一种利用df1传代细胞生产伪狂犬病活疫苗的方法及其制品的制作方法
【专利说明】一种利用DF1传代细胞生产伪狂犬病活疫苗的方法及其制口叩
技术领域
[0001]本发明涉及一种利用DFl传代细胞生产伪狂犬病活疫苗的方法及其制品，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002]我国目前生产伪狂犬病活疫苗所用的细胞为鸡胚成纤维原代细胞。用鸡胚成纤维原代细胞培养伪狂犬病病毒，产毒滴度不高；鸡胚成纤维原代细胞的制造因每批鸡胚原材料的差异，细胞批间差异较大；鸡胚成纤维原代细胞细胞碎片与杂蛋白多，接种猪易引起过敏反应。
【发明内容】
[0003]有鉴于此，本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的利用DFl传代细胞生产伪狂犬病活疫苗的方法。
[0004]为达到上述目的，本发明提供一种利用DFl传代细胞生产伪狂犬病活疫苗的方法，包括如下步骤:
(1)用DFl传代细胞培养伪狂犬病病毒弱毒株；
(2)收获所述步骤(I)得到的细胞培养毒液；
(3)在所述步骤(2)得到的细胞培养毒液中加入稳定剂和抗菌素，经冷冻真空干燥得到伪狂犬病DFl细胞活疫苗。
[0005]进一步地，其中所述方法中使用转瓶或生物反应器进行培养。
[0006]进一步地，其中所述步骤(I)包括如下步骤:
(Ia)制苗用细胞的传代与培养:所述传代细胞经Η)ΤΑ-胰酶细胞分散液消化传代，用细胞生长液继续培养，形成DFl传代细胞单层；
(Ib)细胞毒种的繁殖:将所述伪狂犬病病毒弱毒株接种至所述步骤(Ia)中得到的DFl传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；2~3日后收获细胞培养毒液作为生产用毒种；
(Ic)制苗毒液的繁殖:取所述步骤(Ia)中得到的DFl传代细胞单层，弃去所述细胞生长液，接种含所述步骤(Ib)中得到的毒种的细胞维持液，继续培养。
[0007]进一步地，其中所述步骤(Ib)得到的细胞毒种，每Iml含病毒> 18TCID500
[0008]进一步地，其中所述步骤(la)、(lb)、(Ic)中的细胞培养所用的温度为36 0C ~37。。。
[0009]进一步地，其中所述步骤(Ib)、(Ic)中接种时的接种量按体积百分比计为含1%?2%生产用细胞毒种的维持液。
[0010]进一步地，其中所述步骤(Ia)中的细胞生长液含90 %?92% MEM液、8%?10%犊牛血清和100~200单位/ml青链霉素，所述细胞生长液的pH值为7.0?7.2，其中MEM液和犊牛血清的单位为体积百分比。
[0011]进一步地，其中所述步骤(Ib)和(Ic)中的细胞维持液含95%?98%MEM液、2%?5%犊牛血清和100~200单位/ml青链霉素，所述细胞维持液的pH值为7.2?7.4，其中MEM液和犊牛血清的单位为体积百分比。
[0012]进一步地，其中所述步骤(2)包括如下步骤:接毒后2~3日收获细胞培养毒液，收获的毒液置_20°C以下保存。
[0013]进一步地，其中所述步骤⑵收获的毒液，每Iml含病毒彡18TCID50 ；
进一步地，其中所述步骤(3)得到的伪狂犬病DFl细胞活疫苗，每头份疫苗含病毒彡 16TCID5q。
[0014]另外，本发明还提供一种伪狂犬病活疫苗，所述伪狂犬病活疫苗通过上述方法制得。
[0015]本发明实现的技术效果如下:
1、利用DFl传代细胞生产伪狂犬病活疫苗，具有生产工艺简单且稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量，减少过敏反应等优点；
2、利用本发明生产的伪狂犬病活疫苗安全性好、免疫效力高，对伪狂犬病强毒攻击具有较好的免疫保护作用；
3、利用DFl传代细胞培养伪狂犬病病毒弱毒，因DFl传代细胞是异源传代细胞，可避免同源细胞带未知猪源微生物的可能，更能保证疫苗的纯净。
【附图说明】
[0016]图1:伪狂犬病DFl传代细胞活疫苗的生产工艺流程图。
[0017]图2:免疫接种猪的血清抗体消长规律图。
[0018]
【具体实施方式】
[0019]为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。本发明所采用的生物材料的遗传来源伪狂犬病DFl传代细胞活疫苗所使用的毒种为伪狂犬病病毒Bartha株，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)。本发明所采用的伪狂犬病DFl传代细胞活疫苗所使用的细胞为鸡胚成纤维传代细胞(DFl传代细胞)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)。本发明所采用的伪狂犬病DFl传代细胞活疫苗检验用强毒为伪狂犬病病毒闽A株，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)。
[0020]应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0021]实施例1伪狂犬病活疫苗的制备
如图1所示，一种利用DFl传代细胞生产伪狂犬病活疫苗的方法，包括如下步骤:
(1)制苗用细胞选择=DFl传代细胞；
(2)制苗用细胞的传代与培养:上述DFl传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。故将上述培养的DFl传代细胞进行细胞冻存，待使用时需进行细胞复苏。
[0022]细胞冻存:选择处于对数生长期的细胞，按上述细胞传代方法将细胞消化分散后加入细胞冻存液(10%~85% MEM溶液、10%~90%胎牛血清、5%~10% DMSO),分装于细胞冻存管，用封口胶封口，标记细胞名称、代次、日期。先经阶梯降温(以-1?-30C /分钟的速度降温)，最后移入液氮(_196°C)中。
[0023]细胞复苏:自液氮中取出冻存细胞，迅速放入40°C温水中，缓缓摇动至完全融解，离心(1000r/min离心5~10分钟)并倾去上清液，加入5~7ml (T25瓶)营养液分散悬浮细胞，转入培养瓶，置36~37°C继续培养，长成良好单层。
[0024](3)细胞毒种的繁殖:将伪狂犬病病毒弱毒株接种生长良好的上述DFl传代细胞单层，加入细胞维持液继续培养；2~3日后收获细胞培养毒液作为生产用毒种；
细胞毒种鉴定:细胞毒种鉴定完全符合伪狂犬病病毒弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每Iml含病毒> 18TCID500
[0025](4)制苗毒液的繁殖:取已形成良好单层的DFl传代细胞培养瓶，弃去细胞生长液，接种上述含毒的维持液，继续培养；接毒后2~3日收获细胞培养毒液，收获的毒液置-20°C以下保存；
制苗毒液的检验:按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，各收次病毒培养液分别用细胞测定效价，每Iml含病毒彡18TCID50 ；
(5)配苗、分装及冻干:将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。
[0026]成品检验:按现行《中华人民共和国兽药典》进行检验，应符合“伪狂犬病活疫苗”的规定，对猪安全无副作用，每头份疫苗含病毒> 16TCID500
[0027]其中，各步骤中所涉及到的具体条件如下:
所述步骤(2)、(3)、(4)中的细胞培养所用的温度为36°C ~37°C。
[0028]所述步骤(3)、⑷中接种时的接种量为1%?2% (ml/ml)生产用细胞毒种的维持液。
[0029]所述步骤(2)中的细胞生长液的配方为:90%?92% (ml/ml) MEM液、8%?10%(ml/ml)犊牛血清、并加100~200单位/ml青链霉素，pH值调整为7.0?7.2。
[0030]所述步骤(3)、⑷中的细胞维持液的配方为:95%?98% (ml/ml) MEM液、2%?5% (ml/ml)犊牛血清、并加100~200单位/ml青链霉素，pH值调整为7.2?7.4。
[0031]实施例2伪狂犬病DFl传代细胞活疫苗对猪的安全性试验 I材料与方法
1.1试验用疫苗
实验室研制的伪狂犬病DFl传代细胞活疫苗3批，批号分别为DF201301、DF201302、DF201303。
[0032]1.2试验用动物
来源于广东永顺生物制药股份有限公司实验动物场自繁自养的伪狂犬病病毒中和抗体阴性的健康猪。
[0033]1.3对猪的安全试验
1.3.1 一次单剂量免疫接种的安全试验
选取20~25日龄、50~55日龄的健康猪，将3批实验室产品对不同日龄的猪进行单剂量免疫接种，每批疫苗分别免疫5头猪，每头猪肌肉注射I头份疫苗，接种后每天上、下午各测温观察I次，观察14日。并分别设立阴性对照猪5头，与免疫猪相同条件下饲养测温观察。
[0034]选取怀孕82~94日的母猪，将3批实验室产品对其进行单剂量免疫接种，每批疫苗分别免疫5头猪，每头猪肌肉注射I头份疫苗，每天上下午各测温观察I次。观察免疫母猪精神、食欲、体温状况并跟踪生产情况。并设立空白的阴性对照怀孕82~94日母猪5头，与免疫母猪相同条件下饲养测温并观察生产情况。
[0035]1.3.2单剂量重复免疫接种的安全试验
选取20~25日龄、50~55日龄的健康猪，将3批实验室产品对不同日龄的猪进行单剂量重复免疫接种，每批疫苗分别免疫5头猪，每头猪肌肉注射I头份疫苗，接种后每天上、下午各测温观察I次，接种后14日进行重复接种，重复接种后观察14日。并分别设立阴性对照猪5头，与免疫猪相同条件下饲养测温。
[0036]选取怀孕68~80日的母猪，将3批实验室产品对其进行单剂量重复免疫接种，每批疫苗分别免疫5头猪，每头猪肌肉注射I头份疫苗，接种后每天上、下午各测温观察I次，接种14日后进行重复接种，观察免疫母猪精神、食欲、体温状况及生产情况。并设立空白的阴性对照怀孕68~80日母猪5头，与免疫猪相同条件下饲养测温并观察生产情况。
[0037]1.3.3超剂量免疫接种的安全试验
选取20~25日龄、50~55日龄的健康猪，将3批实验室产品对不同日龄的猪进行超剂量免疫接种，每批疫苗分别免疫5头猪，每头猪肌肉注射10头份疫苗，接种后观察14日，每天上下午各测温观察I次。并分别设立阴性对照猪5头，与免疫猪相同条件下饲养测温观察。
[0038]选取怀孕82~94日的母猪，将3批实验室产品进行超剂量免疫接种，每批疫苗分别免疫5头猪，每头猪肌肉注射10头份疫苗，每天上、下午各测温观察I次。观察免疫母猪精神、食欲、体温状况及生产情况。并设立空白的阴性对照怀孕82~94日母猪5头，与免疫母猪相同条件下饲养测温并观察生产情况