>[0059] 本发明中，进一步优选使用源自成团泛菌（Pantoea agglomerans)的LPS。其中，源 自成团泛菌的LPS优选为使用蛋白标志物利用SDS-PAGE法测得的分子量为5000 ± 3000、优 选5000±2000的源自成团泛菌的LPS。在此所称的分子量通过利用使用了蛋白标志物的 SDS-PAGE法得到的染色带的位置来测定，详细如后文所述。
[0060] 本发明中优选使用的源自成团泛菌的LPS为特征在于0-抗原部分为鼠李糖和葡萄 糖的重复结构的脂多糖。
[0061] 上述源自成团泛菌的LPS可W通过利用常规方法培养成团泛菌（Pantoea agglomerans)，由培养基收集菌体，由所收集的菌体利用公知方法纯化来制造。
[0062] 需要说明的是，上述源自成团泛菌的LI^的分子量可W通过W下的方法测定。
[0063] 目P，对于作为配合物准备的源自成团泛菌的LPS、或者由疫苗组合物用适当的方法 进行提取纯化而得到的源自成团泛菌的LPS，可W用W下的方法测定分子量。
[0064] 将源自成团泛菌的LPS溶解于蒸馈水，制造 Img/mL浓度的溶液，将该溶液和样品缓 冲溶液（Sample buffer solution)2ME+(Wako 化re 化emical Industries,Ltd.制）等量 混合，浸溃于沸水浴中5分钟，然后立即浸溃于冰水中进行骤冷。
[0065] 将电泳缓冲液(ATT0 C0RP.制）充满于板式凝胶电泳槽(Marisol Corp.制），将 20%聚丙締酷胺凝胶固定于电泳槽，向样品槽各加入10化检样，W100V电压连续进行电泳 至少1小时直至色素由凝胶溶出为止。电泳结束后，利用银染色试剂盒161-0443(Bi〇-Rad Laboratories, Inc.制）在室溫下进行银染色，确认行为。
[0066] 本发明的粘膜疫苗组合物中，上述免疫刺激剂的含量的质量，按与本发明的粘膜 疫苗组合物的疫苗抗原的质量的比率（免疫刺激剂的总质量/抗原的总质量）计，优选W 0.002~500的范围含有。若不足0.002则有可能不能得到充分的作为感染症、癌的预防或治 疗剂的功能，若超过500则有可能在安全性方面成为问题。上述比率的更优选的下限为 0.01、更优选的上限为100。
[0067] 另外，本发明的粘膜疫苗组合物，若含有源自特定的革兰氏阴性细菌的脂多糖或 其盐作为上述免疫刺激剂，则可W将它们和其它的W往公知的免疫刺激剂组合来使用。
[0068] 本发明的粘膜疫苗组合物可W如下制造:对上述的抗原和免疫刺激剂根据需要加 入其它成分(例如憐酸盐缓冲溶液等），用公知的方法进行揽拌混合，或者根据需要进而用 公知的方法进行加热、冷却或非加热干燥，由此制造本发明的粘膜疫苗组合物。
[0069] 另外，能够使用本发明的粘膜疫苗组合物来制造液体制剂、半固体制剂、固体制 剂、喷雾剂，除了上述材料W外，也可W根据需要适当使用赋形剂、粘合剂、香料、矫味剂、甜 味剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、表面活性剂等。
[0070] 作为运些材料，没有特别限定，可W使用W往公知的材料。
[0071] 本发明的粘膜疫苗组合物优选为液体制剂、喷雾剂、半固体制剂或固体制剂。如后 文所述，通过本发明的粘膜疫苗组合物为液体制剂、喷雾剂、半固体制剂或固体制剂，可W 合适地对人或动物的粘膜表面给药。
[0072] 另外，本发明的粘膜疫苗组合物由于对人或动物的粘膜表面给药，因此上述半固 体制剂和固体制剂优选通过体液和/或体溫溶解。
[0073] 进一步优选的是，本发明的粘膜疫苗组合物，从抗原的稳定性确保的观点考虑，优 选在保存时水分含量少，因此优选为保存时为干燥状态、在粘膜表面给药后通过体液和/或 体溫溶解的固体制剂。在此所称的"水分含量少"指的是在本发明的粘膜疫苗组合物的总重 量中、含水率优选20重量％ ^下、更优选10重量％ W下。
[0074] 另外，在此所称的"含水率"根据第十六次修改日本药典一般试验法干燥失重法第 一法来求出。即，通过将本发明的粘膜疫苗组合物的试验片在105°C、3小时的条件下进行加 热时的重量的减少比率求出。
[0075] 为了得到运种固体制剂的特性，作为本发明的粘膜疫苗组合物的材料，优选选择 通过体液和/或体溫溶解的材料。作为运种材料，例如作为免疫刺激剂，优选选择水溶性高 的源自成团泛菌的LPS，作为赋形剂，优选选择通过体液和/或体溫溶解的物性的聚合物。通 过形成运种固体制剂，无需特别的设备，就可W简单地对口腔内给药。
[0076] 在此，上述固体制剂包括片剂、包衣片、散剂、颗粒剂、微粒剂、崩解片、贴剂、速溶 片、薄膜剂，若为对粘膜表面给药的固体状的固体制剂则没有特别限定。上述固体制剂优选 为薄膜制剂、崩解片或速溶片。
[0077] 另外，上述半固体制剂优选为凝胶剂、软膏剂、乳膏剂或糖浆剂。
[0078] 本发明的粘膜疫苗组合物，对选自由人或动物(哺乳类、鸟类等）的口腔内粘膜、眼 粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜 或直肠粘膜组成的组中的至少一种粘膜给药，优选对口腔内粘膜给药。认为口腔内粘膜、眼 粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜 或直肠粘膜通常难W活化免疫，但是本发明的粘膜疫苗组合物由于与至少一种抗原一起组 合使用上述的特定的免疫刺激剂，即使对口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘 膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或直肠粘膜给药，也可W有效地诱 导全身性免疫应答和粘膜免疫应答。另外，作为给药途径，通过选择口腔粘膜，由此不会如 对消化道粘膜给予抗原的情况那样受到胃酸影响、蛋白分解酶的影响，另外不会如经鼻对 粘膜给予抗原的情况那样存在急性脑病等严重副作用的可能性，即使是老人、婴儿等也容 易给药，进而不会由于鼻涕等身体上主要原因而阻碍稳定的效果。
[0079] 另外，作为本发明的粘膜疫苗组合物的给药方法，如前文所述。另外，作为其给药 量，考虑到动物种类、对象的年龄、性别、体重等来确定，例如使用HA作为抗原的情况下，通 常可次或2次W上给予0.化g~50yg。优选多次给药，此时，优选间隔1~4周给药。
[0080] 发明的效果
[0081] 本发明的粘膜疫苗组合物，由于与至少一种抗原一起组合使用上述特定的免疫刺 激剂，通过对口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘 膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或直肠粘膜给药，可W安全且有效地诱导体液免疫、例如全身 性免疫应答和粘膜免疫应答。
【附图说明】
[0082]图1为表示实施例1、比较例1~5的小鼠鼻腔洗涂液中流感HA(B型)特异性IgA效价 的结果的图表。
[00削图2为表示实施例1、比较例1~5的小鼠血清中流感HA(B型)特异性IgG效价的结果 的图表。
[0084] 图3为表示实施例2、比较例6~10的小鼠鼻腔洗涂液中流感HA化1N1)特异性IgA效 价的结果的图表。
[0085] 图4为表示实施例2、比较例6~10的小鼠血清中流感HA化1N1)特异性IgG效价的结 果的图表。
[0086] 图5为表示参考例1、参考比较例1、2的小鼠存活率的图表。
[0087] 图6为表示实施例2、3、4、比较例10的小鼠鼻腔洗涂液中流感HA化1N1)特异性IgA 效价的结果的图表。
[008引图7为表示实施例2、3、4、比较例10的小鼠血清中流感HA化1N1)特异性IgG效价的 结果的图表。
[0089] 图8为表示实施例5、比较例11、12的小鼠鼻腔洗涂液中肺炎球菌芙膜多糖特异性 IgA效价的结果的图表。
[0090] 图9为表示实施例5、比较例11、12的小鼠血清中肺炎球菌芙膜多糖特异性I gG效价 的结果的图表。
[0091] 图10为表示实施例6、比较例13、14的小鼠鼻腔洗涂液中HPV16特异性IgA效价的结 果的图表。
[OOW]图11为表示实施例6、比较例13、14的小鼠血清中HPV16特异性IgG效价的结果的图 表。
[0093] 图12为表示实施例5、7、8、比较例12的小鼠鼻腔洗涂液中肺炎球菌芙膜多糖特异 性IgA效价的结果的图表。
[0094] 图13为表示实施例5、7、8、比较例12的小鼠血清中肺炎球菌芙膜多糖特异性IgG效 价的结果的图表。
[0095] 图14为表示实施例6、9、10、比较例14的小鼠鼻腔洗涂液中HPV16特异性IgA效价的 结果的图表。
[0096] 图15为表示实施例6、9、10、比较例14的小鼠血清中HPV16特异性IgG效价的结果的 图表。
[0097] 图16为表示实施例25、比较例15的小鼠鼻腔洗涂液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[009引图17为表示实施例25、比较例15的小鼠唾液中OVA特异性IgA效价的结果的图表。
[0099] 图18为表示实施例25、比较例15的小鼠肺胞洗涂液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[0100] 图19为表示实施例25、比较例15的小鼠阴道洗涂液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[0101] 图20为表示实施例25、比较例15的小鼠粪便提取液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[0102] 图21为表示实施例25、比较例15的小鼠血清中OVA特异性IgG效价的结果的图表。
[0103] 图22为表示实施例26、比较例16的小鼠鼻腔洗涂液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[0104] 图23为表示实施例26、比较例16的小鼠唾液中OVA特异性IgA效价的结果的图表。
[0105] 图24为表示实施例26、比较例16的小鼠肺胞洗涂液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[0106] 图25为表示实施例26、比较例16的小鼠阴道洗涂液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[0107] 图26为表示实施例26、比较例16的小鼠粪便提取液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[0108] 图27为表示实施例26、比较例16的小鼠血清中OVA特异性IgG效价的结果的图表。
[0109] 图28为表示实施例27、比较例17的小鼠阴道洗涂液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[0110] 图29为表示实施例27、比较例17的小鼠粪便提取液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[0111] 图30为表示实施例27、比较例17的小鼠血清中OVA特异性IgG效价的结果的图表。
[0112] 图31为表示实施例28、比较例18的小鼠阴道洗涂液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[0113] 图32为表示实施例28、比较例18的小鼠粪便提取液中OVA特异性IgA效价的结果的 图表。
[0114] 图33为表示实施例28、比较例18的小鼠血清中OVA特异性IgG效价的结果的图表。
【具体实施方式】
[0115] 通过W下的实施例对本发明进行具体说明，但是本发明不被运些实施例所限定。
[0116] (实施例1)
[0117] 向含流感疫苗抗原的溶液(B/Wisconsin/1/2010、阪大微生物病研究会制)2.2扣L (445yg/mL)、和源自成团泛菌（Pantoea agglomerans)的脂多糖(NACALAI TES