，INC.制），回收在鼻腔出来的样品，制成鼻腔洗涂液样品。对于唾 液而言，对小鼠的腹腔给予12yg/mL的氯化氨甲酯胆碱50化L，促进唾液产生后，收集唾液20 yL。对于肺泡洗涂液而言，在BALB/C小鼠的气道下部形成切口，将500化的憐酸盐缓冲液 (NACALAI TESQ肥，INC.制)流入肺，回收出来的憐酸盐缓冲液，制成肺泡洗涂液样品。对于 阴道洗涂液而言，向BALB/C小鼠的阴道流入15化L的憐酸盐缓冲液(NACALAI TESQ肥，INC. 制），将10次移液物作为阴道洗涂液样品。对于粪便提取液而言，向所回收的粪便每lOmg加 入100化的憐酸盐缓冲液(NACALAI TES卵E，INC.制），进行10分钟满流。然后4°C下W3000G 进行10分钟离屯、，将上清液作为粪便提取液样品。
[0209] 通过测定小鼠血清中的免疫抗原特异性IgG效价，评价全身性免疫应答。另外，通 过测定小鼠粘膜样品中的免疫抗原特异性IgA效价，评价粘膜免疫应答。各评价方法如下所 述。
[0210] 另外，各评价结果如图1~4、6~33所示。
[0211] (小鼠血清中抗原特异性IgG效价测定方法化LISA法））
[0212] 向ELISA用96孔板添加利用碳酸盐缓冲液稀释而成的各抗原（例如测定B/ ￥13(3〇113111/1/2010(8)特异性1旨6抗体效价时8/￥13(3〇113111/1/2010(8)流感齡抗原溶液(2.5 yg/mL)各 lOOyL，放置一夜。
[0213] 利用预先准备的含Tween20的PBS(W下洗涂液)将孔洗涂Ξ次，添加用纯化水将封 闭剂(Block Ace、DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.制)稀释至4g/400血而成的封闭溶液各 2(K)yL，室溫下放置2小时。然后用洗涂液洗涂孔3次。
[0214] 使用将封闭剂(Block Ace、DS陆arma Biomedical Co.,Ltd.制）用憐酸盐缓冲液 (NACALAI TESQ肥，INC.制）稀释至0.4g/1 OOmL而成的溶液m下试剂稀释液），将前述的血 清样品进行15次每1/^2倍的系列稀释，分别添加该溶液各5〇4^室溫下放置2小时。
[0215] 然后，用洗涂液洗涂孔3次，添加用试剂稀释液将HRP标记抗小鼠 IgG抗体(Goat- anti-mouse IgG Fc HRP、BET肌L公司制）稀释至10000倍而成的稀释物各lOOyL，室溫下放 置1小时。
[0216] 然后用洗涂液洗涂孔3次，加入TMB溶液化LISAP0D TMB试剂盒、NACALAI TES卵E， INC.制）各lOOyL。向其中加入1M硫酸溶液各lOOyL，对于该96孔板，利用酶标仪（168-11135CAM、Bi〇-Rad Laboratories , Inc.制）测定450nm的吸光度。基于系列稀释时的吸光 度，将该吸光度不突破0.1的最大的稀释倍率作为小鼠血清中IgG效价，其值用Log2的值求 出。
[0217] (小鼠粘膜样品中洗涂液中抗原特异性IgA效价测定方法化LISA法））
[0218] 基本上与抗原特异性IgG效价测定方法相同，但是测定样品为各种粘膜样品，另外 使用HRP标记抗小鼠 IgA抗体(Goat-anti-mouse IgAaHRP、BETHYL公司制)来替代HRP标记抗 小鼠 IgG抗体。除此W外的操作都同样。
[0219] (关于LI^的安全性的研究）
[0220] 对BALB/c小鼠的皮下W10化L注射给予含有B型疫苗和各种LPS的参考例1和参考 比较例1、2的疫苗组合物的样品。然后作为跟踪，每24小时检查小鼠的状态，观察其生死。观 察至72小时后为止，算出其存活率。结果如图5所示。该评价结果作为粘膜疫苗组合物中的 LI^的安全性的结果采用。
[0221] 如图1~4、6~15所示，由实施例和比较例可知，通过使用脂多糖，抗原特异性IgG 和IgAW高水平产生。与此相对，其它的比较例中，对于抗原特异性IgG而言，也存在产生的 情况，但是对于抗原特异性IgA而言产生量低。由运些结果发现，作为免疫刺激剂的脂多糖 或其盐对于舌下的粘膜免疫诱导而言是有效的。另外如图16~33看到那样确认了，通过对 粘膜给予抗原和脂多糖，不仅在该粘膜面而且在远隔的粘膜面也诱导免疫(例如若对舌下 给予抗原和脂多糖则在肠道、阴道面确认了抗原特异性IgA的产生）。即发现，脂多糖或其盐 对于所有粘膜面作为有效的免疫刺激剂发挥作用，并且可W在全身充分诱导抗原特异性 IgA。
[0222] 另外，如图5所示，通过注射免疫，进行含源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的 脂多糖的疫苗组合物、含源自埃希氏大肠杆菌化scherichia coli)的脂多糖的疫苗组合 物、W及含源自鼠伤寒沙口氏菌（Salmonella typhimurium)的脂多糖的疫苗组合物的比 较，结果可W确认含源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的脂多糖的疫苗组合物的安全 性高。
[0223] 由此发现，若考虑到粘膜给药免疫诱导效果和给药组合物安全性运两者，则含源 自成团泛菌(Pantoea agg 1 omerans)的脂多糖的疫苗组合物优异。
[0。4] 产业上的可利用性
[0225]本发明的粘膜疫苗组合物，由于与至少一种抗原一起组合使用上述特定的免疫刺 激剂，即使对口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘 膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或直肠粘膜给药，也可W安全且有效地诱导全身性免疫应答 和粘膜免疫应答。
【主权项】
1. 一种粘膜疫苗组合物，其特征在于，其为对选自由人或动物的口腔内粘膜、眼粘膜、 耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜和直肠 粘膜组成的组中的至少一种粘膜给药的粘膜疫苗组合物， 其含有至少一种抗原和作为免疫刺激剂的源自革兰氏阴性细菌的脂多糖或其盐，所述 革兰氏阴性细菌选自由沙雷氏菌属（Serratia)、勒克菌属（Leclercia)、拉恩菌属 (Rahne 1 la)、嗜热酸菌属（Acidicaldus)、嗜酸菌属（Acidiphilium)、酸球形菌属 (八(^(118口1^6從）、酸胞菌属(八(^(1〇06113)、酸单胞菌属(八(^(1〇11101^8)、亚细亚菌属(八831&)、 别尔纳普氏菌属（Belnapia)、脆弱球菌属（Craurococcus)、葡糖醋杆菌属 (Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、柯扎克氏菌属(Kozakia)、利亚杆菌 属（Leahibacter)、鼠球菌属(Muricoccus)、新亚细亚菌数（Neoasaia)、嗜油单胞菌属 (016〇111〇1^8)、副脆弱球菌属(？3^(^3111'〇(3〇(3(3118)、红球状菌属(1?11〇(1(^；!_13)、玫瑰球菌属 (尺〇80〇(3〇(3(3118)、如比特皮达（1?11131'；^6卩1(1&)、糖杆菌属（3&(3(311&1'；^&(^61')、星状菌属 (Stella)、斯瓦米纳坦氏菌属（Swaminathania)、替考球菌属(Teichococcus)、扎瓦尔金氏 菌属(Zavarzinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、芽抱杆菌属 (Bacillus)、甲焼袋状菌属(Methanoculleus)、甲焼八叠球菌属(Methanosarcina)、梭菌属 (Clostridium)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、泛菌属（Pantoea)、 醋酸杆菌属(Acetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和肠杆 菌属(Enterobacter)组成的组中的至少一种。2. 根据权利要求1所述的粘膜疫苗组合物，其为液体制剂、喷雾剂、半固体制剂或固体 制剂，所述半固体制剂和固体制剂通过体液和/或体温溶解。3. 根据权利要求2所述的粘膜疫苗组合物，其为通过体液和/或体温溶解的固体制剂。4. 根据权利要求1、2或3所述的粘膜疫苗组合物，其用于诱导体液免疫。5. 根据权利要求1、2、3或4所述的粘膜疫苗组合物，其中，抗原为源自感染症的抗原或 癌抗原。
【专利摘要】本发明的目的在于，提供作为感染症、癌的预防或治疗剂有用，安全，可以有效地诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答，且能够对口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或直肠粘膜给药的粘膜疫苗组合物。本发明为一种粘膜疫苗组合物，其特征在于，其为对选自由人或动物的口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜和直肠粘膜组成的组中的至少一种粘膜给药的粘膜疫苗组合物，其含有至少一种抗原和作为免疫刺激剂的源自革兰氏阴性细菌的脂多糖或其盐，所述革兰氏阴性细菌选自由沙雷氏菌属(Serratia)、勒克菌属(Leclercia)、拉恩菌属(Rahnella)、嗜热酸菌属(Acidicaldus)、嗜酸菌属(Acidiphilium)、酸球形菌属(Acidisphaera)、酸胞菌属(Acidocella)、酸单胞菌属(Acidomonas)、亚细亚菌属(Asaia)、别尔纳普氏菌属(Belnapia)、脆弱球菌属(Craurococcus)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、柯扎克氏菌属(Kozakia)、利亚杆菌属(Leahibacter)、鼠球菌属(Muricoccus)、新亚细亚菌数(Neoasaia)、嗜油单胞菌属(Oleomonas)、副脆弱球菌属(Paracraurococcus)、红球状菌属(Rhodopila)、玫瑰球菌属(Roseococcus)、如比特皮达(Rubritepida)、糖杆菌属(Saccharibacter)、星状菌属(Stella)、斯瓦米纳坦氏菌属(Swaminathania)、替考球菌属(Teichococcus)、扎瓦尔金氏菌属(Zavarzinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、甲烷袋状菌属(Methanoculleus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、梭菌属(Clostridium)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、泛菌属(Pantoea)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)组成的组中的至少一种。
【IPC分类】A61P31/04, A61P31/16, A61P31/12, A61P37/04, A61K39/145, A61K9/12, A61K9/20, A61K9/08, A61K39/39, A61K9/06
【公开号】CN105530958
【申请号】CN201480050379
【发明人】深坂昌弘, 堀光彦, 大久保胜之, 浅利大介, 冈崎有道, 清远英司, 松下恭平
【申请人】日东电工株式会社
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年10月2日
【公告号】CA2923040A1, US20160193327, WO2015050180A1