一种树鼩单纯疱疹病毒性角膜炎hsk模型的构建、评估方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建、评估方法及其应用，属于人类疾病动物模型技术领域。
技术背景
[0002]单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)是自然界广泛存在易感染人类的传染性病毒，超过80 %的全球人口感染过单纯疱疹病毒，单纯疱疹病毒分为两种基因型，即I型和II型单纯疱疹病毒。I型单纯疱疹病毒(HSV-1)感染部位是头颈部，可引起多种人类疾病，包括口唇疱疹，龈口炎，角膜炎，甚至引起脑炎。Π型的感染部位是生殖器，偶或也引起眼部感染。Π型感染新生儿，除累及眼部还可波及皮肤、血液、内脏和中枢神经系统，并可致命。人是HSV唯一的自然宿主，大多数人在幼儿时期就被HSV感染，在此之后，病毒终身潜伏在三叉神经节(trigeminal gangl1n,TG)的感觉神经元内。
[0003]单纯疱疹病毒感染引起的角膜炎症称为单纯疱疹病毒性角膜炎(Herpessimplexkeratitis，HSK)，眼部HSV感染主要由HSV-1引起。HSV-1角膜炎是常见、且严重的角膜病，也是当今危害严重的感染性眼病之一。它是由病毒感染、免疫与炎症反应参与、损伤角膜及眼表组织结构的复杂性眼病，感染HSV-1后，多数人没有明显症状，少数发展成有危害的疱疹病毒性角膜炎。复发的角膜感染引起眼睛发病，导致不可逆的角膜瘢痕形成，变薄，新生血管生成，最终失明，其复发的详细机制尚不清楚。
[0004]HSV-1感染眼睛及相关的后遗症是传染性角膜发病和致盲的主要原因，疱疹病毒的感染情况，可追溯到几千年前，至今人类仍然饱受这种病毒的折磨。尽管已经进行了四十多年的HSK研究，主要的治疗方法仍旧是局部疗法，现在更多是全身性的阿昔洛韦给药，联合局部的皮质激素治疗。即使进行角膜移植术治疗后，病人仍然大部分复发HSK，且诊断出这些病人有HSV再激活现象，因此，疱疹病毒性角膜炎易复发，很难根治，迫切需要建立合适的动物模型，研究其病毒潜伏及再激活机制，为疱疹病毒性角膜炎的治疗以及药物筛选提供基础依据。
[0005]目前，小鼠和家兔等啮齿类是主要的用于疱疹病毒性角膜炎研究的模型动物，但由于小鼠的角膜很小，很难进行手术操作，感染后可取材的标本少，而且不利于病毒感染大体形态学的观察。此外，小鼠模型缺乏对病毒的临床再激活能力。家兔模型与人类感染的免疫反应差异大，且家兔实验成本高。因此，迫切需要建立一个更接近于人的灵长类动物模型，来模拟人类单纯疱疹病毒性角膜炎的发生、发展过程，为疱疹病毒性角膜炎的治疗提供理想的动物模型。
[000?] 树駆](Tupaia belangeri)在分类学上属哺乳纲，有胎盘类，是一个独立的目，称为攀駒目(Scandentia)，介于灵长目与食虫目之间。树駒具有体型小，易饲养和操作，管理方便，廉价经济，且其进化程度高，新陈代谢和大体解剖比犬、大小鼠等动物与人更为接近，解剖结构也更近似于人，特别是树駒角膜结构和人角膜非常类似。为此，我们拟通过建立树駒HSV-1角膜炎模型来模拟人类单纯疱疹病毒性角膜炎的感染，研究调控病毒潜伏的机制及病毒性角膜炎临床治疗研究;通过非人灵长类模型获得的基础数据更有助于临床治疗的筛药研究，将会带来很大的社会和商业效益。
【发明内容】
[0007]鉴于现在对HSV角膜炎实验动物模型开发的需求，本发明拟设计一种树駒HSV角膜炎模型的建立及评估方法，通过HSV-1病毒经眼睛接种感染树駒，建立树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型，为研究疱疹类病毒性角膜炎的感染机制，致病机理及药物治疗研究提供更好的实验动物模型。
[0008]本发明的技术方案:一种树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法是将HSV-1病毒经树駒眼睛接种感染HSV-1病毒，建立树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型，包括以下步骤:
[0009](I)实验动物准备:准备6月-3岁龄雌性成年健康树駒；
[0010](2)树駒的麻醉及处理:用氯胺酮麻醉动物，将树駒固定于专用的小布袋中，称量并记录其体重，在树駒大腿内侧肌肉丰厚处注射盐酸氯胺酮，5分钟后，树駒处于麻醉状态；
[0011](3)病毒感染:将HSV-1病毒滴加到树駒两只眼膜上，即可得到树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型。
[0012]其中，步骤(3)中所述的HSV病毒为野生型HSV-1 17+或HSV-1 McKrae毒株。
[00?3] 进一步地，步骤(2)中所述的氯胺酮(ketamine)的用量为按树駆]体重为50mg/kg?100mg/kgo
[0014]进一步地，步骤(3)中当采用HSV-117+病毒时，需要以Iml注射器针头划痕动物眼膜，即建立表面划痕，横竖各划痕十次，然后将HSV-1 17+病毒滴加到树駒眼膜。
[0015]进一步地，步骤⑶中采用的病毒感染剂量为I X 14PFU/眼睛?I X 16PFU/眼睛。
[0016]本发明提供了一种评估树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的方法，取材病毒感染树鼠句的眼睛，利用裂隙灯检查、PCR(Polymerase Chain React1n) nqRT-PCR(quantitativereal-time polymerase chain react1n)、免疫组化、原位杂交、体外共培养实验、组织活病毒检测及病毒基因组定量等方法，对树駒眼睛组织的感染、病毒潜伏及重激活进行研究，鉴定及评估树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型。
[0017]利用本发明方法构建的树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型在单纯疱疹病毒性角膜炎等发病机制机理研究和治疗、以及药物评价方面的应用。
[0018]HSV-1感染树駒后，在急性感染期，树駒出现与人类疱疹病毒性角膜炎(HerpesSimplex Keratitis，HSK)症状相似的眼部疾病。急性感染期的树駒角膜中可检测到活病毒和病毒蛋白；潜伏期样本中，树駒眼睛视神经节中可检测到潜伏相关转录子LAT的表达;角膜和视神经节的组织匀浆上清中均可检测到活病毒，证明潜伏感染的树駒具有病毒自发重激活现象。因此，树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的建立，可更好地模拟人类疱疹病毒性角膜炎的感染，对其感染机制及抗病毒类药物开发的应用研究都具有很大的价值和潜力。
[0019]本发明的有益效果:I)选用更接近于人类或灵长类的树駒，首次成功建立树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型，能更好地模拟人类的HSV-1角膜炎感染，可为HSV-1角膜炎感染机制及抗病毒药物治疗研究提供更好的实验动物模型;2)用本发明的方法构建出树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的病变特点与人类疱疹病毒性角膜炎感染的临床症状相似，模型重复性、稳定性好，适用于各种治疗性研究和相关的基础性研究，为进一步研究疱疹病毒性角膜炎的致病机制、发病机理及抗病毒药物筛选等方面的研究奠定了基础;3)该构建方法操作简单，技术、设备要求低，成功率高。
【附图说明】
[0020]图1为裂隙灯检查树駒疱疹病毒性角膜炎(HSV-1McKrae感染)，其中图1A为树駒对照组角膜检测图，图1B、图1C、图1D、图1E、图1F分别为树駒感染5天、8天、12天、19天、33天裂隙灯检查树駒疱疹病毒性角膜炎情况图，每幅图上图是裂隙灯明场下拍照，下图是裂隙灯紫外灯下拍照(荧光素染色显示角膜炎性细胞)；
[0021]图2为裂隙灯检查树駒疱疹病毒性角膜炎(HSV-117+划痕感染)，其中图2A为树駒划痕5天对照组，图2B、图2C、图2D、图2E、分别为树駒感染5天、15天、30天、50天裂隙灯检查树駒疱疹病毒性角膜炎情况图，图2F为树駒划痕50天对照组；
[0022]图3为HE染色观察树駒角膜的病变图，其中，图3A为树駒对照组，图3B、图3C、图3D、图3E、图3F、图3G、图3H、图31分别为HSV-1感染树駒后第5天、8天、10天、13天、20、33天、46天、54天HE染色观察树駒角膜的病变图；
[0023]图4为免疫组化检测树駒角膜中的HSV-1病毒蛋白变化比较图，其中，图4A为未感染的树駒对照组，图4B、图4C、图4D、图4E、图4F、图4G、4H、4I分别为HSV-1感染的树駒眼睛在感染后第5天、8天、10天、13天、20天33天、46天、54天树駒角膜中均