检测到病毒蛋白变化比较图；
[0024]图5为树駒感染HSV-1后不同时间点眼睛的活病毒滴度检测比较图；
[0025]图6为检测树駒感染HSV-1后不同时间点眼睛中HSV-1病毒基因组载量比较图；
[0026]图7为原位杂交检测HSV-1感染的树駒眼睛视神经节中的LAT信号显示图，图7A为对照组的树駒眼睛视神经节中检测不到LAT信号显示图；图7B为感染后第13天的树駒眼睛视神经节中检测到的LAT信号显示图；图7C为感染后第46天的树駒眼睛视神经节中检测到的LAT信号显示图；图7D为感染后第54天的树駒眼睛视神经节中检测到的LAT信号显示图；
[0027]图8为潜伏感染的树駒眼睛中HSV-1的重激活比较图。
【具体实施方式】
[0028]为能进一步了解本发明的
【发明内容】
及特点，通过以下实施例，并配合附图详细说明，请参阅附图1-8。下述实施例中的方法如无特别说明，均为常规实验方法。以下实施例中，A实验动物为6月-3岁龄雌性成年树駆](Tupaia belangeri chinensis)，购于中国科学院昆明动物研究所灵长类研究中心。树駒的饲养管理均遵循实验动物管理和使用指南(published by the NAT1NAL ACADEMY PRESS Washington，D.C.1996)，本研究中涉及的动物实验方案，已提交中国科学院昆明动物研究所实验动物管理和使用委员会并获得批准，批准文号SYDW20121201001。本研究涉及的动物感染实验和动物样本采集在生物安全Π级(BSL-2)实验室进行，动物饲养于P2实验室。
[0029]B病毒和细胞
[0030]本研究用的野生型HSV-1 17+和McKrae毒株，来源于美国Nigel W.Fraser实验室。所有毒株的扩增在Vero细胞上进行，使用家兔皮肤成纤维细胞(RS-lcells)进行病毒滴度的测定。Vero和RSl细胞购于中国科学院昆明动物研究所细胞库，用含5 %胎牛血清的DMEM培养。
[0031 ] C主要试剂
[0032]胎牛血清(Pufei,1101-500)，DMEM(Gibco, 12800-017)，TIANamp Genomic DNAKit(Tiangen,Cat.DP304-02) ,Ant1-Digoxigenin-AP Fab抗体(Roche,Cat.11093274910)，BCIP/NBT(Roche ,Cat.11383221001 ,Cat.11383213001 )，DAB(福州迈新，Cat.DAB-0031)。HSV-1 多抗(Rabbit anti HSVl，Cat.RR1190P)购于美国American Qualex Antibodies公司，免疫组化二抗(ant1-rabbit IgG HRP-labeled Antibody，Cat#7074S)，购于CellSignaling Technology公司。
[0033]D主要仪器
[0034]眼科裂隙灯显微镜检查仪，ABI荧光定量PCR仪，全自动组织脱水机，全自动组织包埋机，石蜡组织切片机，显微镜。
[0035]1.一种树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法
[0036]实施例1一种树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法
[0037]本发明一种树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法是将HSV-1病毒经树駒眼睛接种感染HSV病毒，建立树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型，包括以下步骤:
[0038](I)实验动物准备:准备6月-3岁龄雌性成年健康树駒；
[0039](2)树駒的麻醉及处理:将树駒固定于专用的小布袋中，称量并记录其体重，在树鼠句大腿内侧肌肉丰厚处注射盐酸氯胺酮，氯胺酮(ketamine)的用量为按树駆]体重为50mg/kg，5分钟后，树駆]处于麻醉状态；
[0040](3)病毒感染:将树駒眼球表面划痕，横竖各划痕十次，用移液枪将剂量为I X14PFU的HSV-1 17+病毒分别滴加到树駒两只眼膜上，即可得到树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型。
[0041 ]实施例2—种树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法
[0042]其他部分与实施例1相同，所不同的是:
[0043]实验方法中步骤(2)中氯胺酮(ketamine)的用量为按树駆]体重为100mg/kg;
[0044]实验方法中步骤(3):直接将I X 16PFU剂量的HSV-1 McKrae毒株用移液枪分别滴加到树駒两只眼膜上，即可得到树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型。
[0045]另外，实验中，发明人还设置了对照组树駒动物，即只划痕动物眼膜，不加病毒，滴加等体积的I3BS溶液到树駒眼膜(HSV-1 17+对照组)；或不划痕动物眼膜，直接滴加等体积的PBS溶液到树駒眼膜(HSV-1McKrae对照组)。
[0046]感染操作结束后，将动物放回动物饲养房，待动物自然苏醒。在树駒感染后I?2周内，每12小时观测一次树駒动物的临床症状及感染情况，发现:树駒在HSV-1急性感染期间，出现被毛粗乱、厌食、体重减轻、嗜睡、缺乏活力及眼睛炎症等症状。至感染后两周左右，感染症状得到缓解，动物逐渐恢复健康。通过对比分析，最佳的感染剂量是I X 16PFU/眼睛(plaque forming unit，简称PFU)病毒感染树駆]，感染成功率可达100%，也即模型的成功率为100%。最理想的毒株是HSV-1McKrae毒株，可更自然地模拟人类疱疹病毒性角膜炎的感染。
[0047]2.一种评估树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的方法
[0048]在感染后不同的时间点(3，5，7，10，13，20，33，46，54天)麻醉动物并处死。取材眼睛组织，每个时间点取6只动物样本，同时取对照组动物样本。取材的各动物组织样本分为两份，一份经液氮速冻后，_80°C冰箱保存，以提取DNA，RNA或检测组织中的病毒滴度；另外一份置于中性福尔马林固定液中进行固定，以制备石蜡组织切片。通过裂隙灯检查、qPCR、qRT-PCR、免疫组化、原位杂交、体外共培养实验、组织活病毒检测及病毒基因组定量等方法，对HSV-1在树駒眼睛组织的感染，潜伏及重激活进行研究，鉴定及评估树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的有效性及实用性。
[0049]树駒角膜接种HSV-1McKrae后引起角膜炎，裂隙灯检查对照组和实验组动物的眼睛，分别在明场和紫外灯(眼中滴入焚光素)条件下观察、拍照。结果如图1所示，在急性感染期可观察到典型的点状及树枝状病毒性角膜炎，每幅图上图是裂隙灯明场下拍照，下图是裂隙灯紫外灯下拍照(荧光素染色显示角膜炎性细胞)，图1A为树駒对照组(未滴加病毒)。树駒眼病的发展一般会经历以下几个过程:图1B显示树駒感染5天左右，树駒的眼睑持续地红肿，眼角膜开始混浊，明场下可见角膜细胞炎性浸润，紫外灯下可见炎性细胞呈现绿色荧光；图1C显示第8天炎症加重，树駒角膜出现树枝状角膜炎；图1D显示第12天后炎症开始缓解；图1E显示第19天起眼部的红肿慢慢消失，角膜渐渐恢复透明；图1F显示感染病毒33天后，眼睑周围的炎症彻底消失，角膜透明，无水肿，部分树駒从外观看，眼睛完全恢复。
[0050]HSV-1 17+毒株感染的树駒，如图2所示。图2B显示树駒除了 HSV-1McKrae毒株感染引起的眼病症状，角膜还出现云雾状白翳，图2C显示角膜形成白色瘢痕，图2D和图2E显示角膜甚至生成新生血管，两个月左右眼睛才能逐渐恢复，图2A和图2F分别是划痕5天和划痕50天的对照组树駒眼睛的状况(即只划痕树駒眼膜，不感染HSV-1 17+病毒)，无上述眼病症状。
[0051 ]如图3所示，将HSV-1感染的树駒角膜切片进行苏木素伊红(HE)染色。树駒眼睛角膜结构与人的角膜非常相似，如图3A为树駒对照组，包括5层结构:上皮层(Epithelium，EN)、前弹力层(Bowman’s layer,Bff)、基质层(Stroma，S，基质层内有基质细胞Keratocyte，KR)、后弹力层(Descemet，s membrane，DM)和内皮层(Endothelium，EN)。图3B显不树鼠句HSV-1感染后第5天，上皮层与前弹力层分开，部分上皮细胞脱落，基质层出现少量炎性细胞。图3C显示树