駒感染后第8天，上皮层脱落，基质层出现大量炎性细胞。图3D显示树駒感染后第10天，上皮层脱落，基质层出现炎性细胞。图3E显示树駒感染后第13天，上皮层开始修复，炎性细胞减少，表明急性炎症减弱，但HSV-1引起的炎症仍然存在，转化成慢性炎症。图3F-3I显示树駒感染后第20，33，46和54天的角膜组织切片，形态基本和未感染的对照组相同(白色箭头指示角膜上皮层，图3C和图3D中箭头指示角膜上皮层消失)。
[0052]为了更详尽地描述HSV-1在树駒眼睛的感染特点，用HSV-1多抗对树駒眼睛的角膜进行了免疫组化检测。检测结果如图4所示，图4B-4F显示HSV-1感染的树駒眼睛，在感染后第5，8，10，13和20天的角膜中均检测到病毒蛋白(黑色箭头指示HSV-1病毒蛋白阳性信号)，而图4A为未感染的对照组和图4G-4I为潜伏感染期的角膜(感染后第33，46和54天后)中均未检测到病毒蛋白。表示渡过急性感染期后，树駒眼睛中检测不到病毒蛋白，标志着病毒进入了潜伏期。
[0053]为确定HSV-1感染的树駒眼睛中的活病毒滴度，我们解剖并采集对照组，以及感染后第3，5，7，8，10，13，30和46天的树駒眼睛(每个时间点3个样本)，测定其中的活病毒滴度。眼睛的匀浆上清与RS-1细胞共培养20小时后，可以观察到细胞病变，最后计算出树駒眼睛中的HSV-1滴度，结果如图5所示，HSV-1感染的树駒眼睛中存在大量的病毒，且峰值出现在感染后的第5天，第10天后病毒滴度降低，第13天降至最低，但急性期之后，树駒眼睛中还有活病毒出现，这可能与树駒眼睛中存在自发重激活的病毒有关。
[0054]为进一步确认HSV-1在树駒眼睛中的感染，采集对照组，以及感染后第3，5，7，8，10，13，30和46天的树駒眼睛(每个时间点3个样本)，提取组织0嫩，利用妒0?进行病毒基因组载量测定。结果见图6，树駒各感染时间点的眼睛中，均检测到大量的HSV-1基因组，但峰值出现在感染后的第5天，第10天后病毒基因组载量降低，第13天降至最低，这与图5树駒眼睛的活病毒滴度检测结果相一致。
[0055]潜伏相关转录子LAT是HSV潜伏期唯一始终表达的转录子，LAT稳定表达是潜伏的特有标志。由于HSV-1感染树駒眼睛后，最终导致病毒进入外周和中枢神经系统，为确定是否病毒也潜伏于树駒眼睛的某一部位，用原位杂交检测树駒眼睛中LAT的表达，角膜中未检测到LAT表达，但视神经节中检测到LAT阳性信号，视神经节的神经元细胞核内出现LAT表达，如图7所示。图7A为对照组的树駒眼睛视神经节图，未检测到LAT信号；图7B为感染后第13天的树駒眼睛视神经节图，检测到LAT信号(黑色箭头所示，而且LAT稳定持续表达，图7C和7D显示感染后第46天和第54天的树駒眼睛视神经节图，仍可检测到LAT信号(黑色箭头所示)。表明病毒已进入潜伏感染阶段，可能潜伏于视神经节，但潜伏的病毒是否能重激活，需要进一步研究。
[0056]为观察潜伏在树駒眼睛中的病毒是否能重激活，HSV-1感染树駒后，第46天取材眼睛组织，分别将角膜和视神经与RS-1细胞进行体外共培养实验。另外，为了区分持续感染和潜伏感染，对树駒眼睛的匀浆上清也进行共培养检测，检测结果如图8所示，培养至第3天，角膜和视神经节的匀浆上清，均引起RS-1细胞发生病变，证明角膜和视神经节的匀浆上清中存在持续感染的病毒，病毒并没有真正潜伏。这与图5的潜伏期眼睛中仍然能检测到活病毒的结果一致，也再次验证了树駒眼中存在自发重激活的病毒。
[0057]3.一种树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的评估方法及应用
[0058]实施例3—种树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的评估方法及应用
[0059]本发明利用裂隙灯检查，免疫组化，活病毒滴度检测，病毒基因组载量测定，以及原位杂交等方法鉴定评估HSV-1在树駒眼睛的感染、潜伏和自发重激活，这些实验结果均表明，HSV-1可有效地感染树駒眼睛，能更好地模拟人类的疱疹病毒性角膜炎症状，且树駒角膜结构高度相似于人的角膜。该角膜炎模型的建立有利于进一步研究疱疹病毒性角膜炎的发生、发展及复发过程，以及病毒潜伏及再激活机制，对抗病毒类药物开发的应用研究都具有很大价值和潜力。因此，本发明所建立的树駒疱疹病毒性角膜炎模型有望成为病毒性角膜炎临床治疗和筛药的理想动物模型。
[0060]从以上实施例可以看出，树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型较小鼠等其它啮齿类实验动物单纯疱疹病毒性角膜炎模型的优势:
[0061]小鼠的疱疹病毒急性感染期，眼睛炎症反应较重，小鼠睁不开眼睛，很难观察到角膜的病理变化;小鼠的角膜很小，很难进行手术操作，感染后可取材的标本少，而且不利于病毒感染大体形态学的观察。此外，小鼠模型缺乏对病毒的临床再激活能力。而树駒感染疱疹病毒后，出现的眼睛疾病症状能更好地模拟人类疱疹病毒性角膜炎的感染，观察到类似于人类疱疹病毒性角膜炎的病理变化及疾病发展过程。在HSV感染的树駒眼中还检测到HSV病毒，视神经节中有病毒潜伏，且树駒眼中存在自发重激活的病毒;可为疱疹病毒性角膜炎的感染机制及抗病毒药物评价、治疗研究提供更好的实验动物模型。
【主权项】
1.一种树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法，其特征在于将HSV-1病毒经树駒眼睛接种感染HSV病毒，建立树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型，包括以下步骤: (1)实验动物准备:准备6月-3岁龄雌性成年健康树駒； (2)树駒的麻醉及处理:用氯胺酮麻醉动物，将树駒固定于专用的小布袋中，称量并记录其体重，在树駒大腿内侧肌肉丰厚处注射盐酸氯胺酮，5分钟后，树駒处于麻醉状态； (3)病毒感染:将HSV-1病毒滴加到树駒两只眼膜上，即可得到树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型。2.根据权利要求1所述的树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法，其特征在于:步骤(3)中所述的HSV-1病毒为野生型HSV-1 17+或HSV-1 McKrae毒株。3.根据权利要求1所述的树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法，其特征在于:步骤(2)中所述的氯胺酮的用量为按树駆]体重为50mg/kg?100mg/kg。4.根据权利要求2所述的树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法，其特征在于:步骤(3)中当采用HSV-1 17+病毒时，需要以Iml注射器针头划痕动物眼膜，即建立表面划痕，横竖各划痕十次，然后将HSV-1 17+病毒滴加到树駒眼膜。5.根据权利要求1所述的树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法，其特征在于:步骤(3)中采用的病毒感染剂量为I X 14PFU/眼睛?I X 16PFU/眼睛。6.一种评估树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的方法，其特征在于:取材病毒感染树駒的眼睛组织，利用裂隙灯检查、qPCR、qRT-PCR、免疫组化、原位杂交、体外共培养实验、组织活病毒检测及病毒基因组定量等方法，对树駒眼睛组织的感染、病毒潜伏及重激活进行研究分析，鉴定及评估树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型。7.—种树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型的应用，其特征在于:用本方法构建的树駒单纯疱疹病毒性角膜炎模型在单纯疱疹病毒性角膜炎的发病、机制机理研究和治疗以及药物评价方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种树鼩单纯疱疹病毒性角膜炎动物模型的构建、评估方法及应用。本发明通过单纯疱疹病毒HSV-1经眼睛接种感染树鼩，建立树鼩单纯疱疹病毒性角膜炎模型，并利用裂隙灯检查、qPCR、qRT-PCR、免疫组化、原位杂交、体外共培养实验、组织活病毒检测及病毒基因组定量等方法，对树鼩眼睛组织的感染、病毒潜伏及重激活进行研究和分析，鉴定及评估树鼩单纯疱疹病毒性角膜炎模型的有效性及实用性。本发明首次成功建立树鼩单纯疱疹病毒性角膜炎模型，能更好地模拟人类疱疹病毒性角膜炎的感染，可为疱疹病毒性角膜炎感染机制及抗病毒药物评价、治疗研究提供更好的实验动物模型；该动物模型重复性、稳定性好；该构建和评估方法操作简单，技术、设备要求低，成功率高。
【IPC分类】A61K49/00
【公开号】CN105535997
【申请号】CN201610023595
【发明人】李丽红, 周巨民, 陈桂俊, 杨卫, 郎丰超, 杨丽萍, 王二林, 李欣, 李卓然
【申请人】中国科学院昆明动物研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月14日