察:取包括骨折断端及其周围软骨痂约1厘米作为观察标本，将标本 置入4 %多聚甲醛中浸泡48h后，用骨刀切成5mm X 5mm X 5mm的小块，置入10 % EDTA液(pH 7.2)脱钙，4°C，每周换脱钙液1次。待针可刺入骨皮质时停止脱钙，随后石蜡包埋(60°C)，制 备4μπι厚度切片;切片经脱蜡至水、HE染色后，进行组织学观察。
[0111] (6)免疫组化染色：切片经脱蜡至水后，分别经0.3%双氧水封闭内源酶；按常规 ABC法进行免疫组化TGF-βΙ染色和免疫组化BMP-2染色。
[0112] 其中，免疫组化TGF-βΙ染色结果观察：细胞染色中出现棕黄色颗粒为阳性反应标 志，每次染色均作对照，通过与计算机相连的显微镜，将采集到的免疫组化切片图像存入微 机，用PAS-9000病理图像分析系统进行分析。染色切片经显微镜放大，每例随机摄取骨痂组 织图像5幅。每批和批间输入的图像入射光强度皆严格控制在同一水平。通过彩色分割方 法，分割骨痂图像中TGF-βΙ阳性产物的染色区域，求出阳性产物的染色面积和阳性产物的 染色灰度。
[0113]细胞内染色：间充质细胞，成骨细胞、单核细胞等胞浆内分布的棕黄色颗粒为TGF-Bl染色阳性。细胞外染：在骨膜、基质、血肿中的细胞间质中分布的片状棕黄针颗粒，为 TGFB-I染色阳性。
[0114] 免疫组化BMP-2染色结果观察:细胞染色中出现棕色为阳性反应，每次染色均做对 照，通过与计算机相连的显微镜将采集到的免疫组化切片图像存入微机，用PAS-9000病理 图像分析系统进行分析。染色切片经显微镜放大400倍，每例随机摄取骨痂组织图像5幅。每 批和批间输入的图像入射光强度皆严格控制在同一水平。通过彩色分割方法，分割骨痂图 像中BMP-2阳性产物区域，求出阳性产物平均光密度(代表BMP-2平均着色程度)和阳性产物 平均积分光密度(代表BMP-2含量），用0.0 lmol/L PBS替代一抗作为阴性对照。
[0115] 各组计量资料用均数土标准差（i±s)表示，并用SPSS13.0软件统计包对各组数 据进行统计分析，组间资料用单因素方差分析，采用t检验，以P<0.05为有显著性差异。
[0116] 5、观察结果
[0117] (1) -般项目：三组动物术后均无感染，实验用药组术后2日行动及饮食恢复如前， 空白对照组及阳性对照组倦卧少动，术后3~4日方恢复;术后3日见实验用药组及阳性对照 组肢体肿胀基本消失，而空白对照组局部瘀斑明显，1周后才消失。
[0118] (2)摄 X 线片：
[0119] 术后一周:实验用药组、阳性对照组和空白对照组的骨折线均清晰可见，但实验用 药组(A组，图la)及阳性对照组（图Ib)局部的血肿吸收较好，而空白对照组（图Ic)的断端周 围可见较多血肿阴影。
[0120] 术后两周:实验用药组(A组，图Id)及阳性对照组（图Ie)的骨折断端影响均趋向模 糊，并有轻度骨膜反应，个别标本有大量骨痂形成;空白对照组（图If)的标本也表现为骨折 端模糊、轻度骨膜反应，但骨痂形成较少。
[0121] 术后四周：实验用药组(A组，图Ig)及阳性对照组（图Ih)可见到明显的外骨痂，骨 折局部密度增高，骨皮质连续性好，大部分标本断端已重塑接近正常骨质；而空白对照组 (图I i)断端也有大量骨痂形成，断端连续，骨痂膨隆较大，但髓腔未通。
[0122] 实验用药组与阳性对照组在第1、2周X线平片检查结果无明显差别，但第4周时实 验用药组骨缺损内骨小梁明显比阳性对照组密实。
[0123] 以上结果表明，实验用药组和阳性对照组的骨折修复快于空白对照组，且实验用 药组的骨折修复快于阳性对照组。
[0124] (3)骨密度检查:见下表1:
[0125] 表1四周时各组的骨密度比较(n = 4，：±s)
[0127] 注，表示与空白对照组比较具有显著差异(P<0.05)，▽表示与阳性对照组相比 不具备显著差异(P>〇.05)。
[0128] 由表1可见，术后28天时，实验用药组与阳性对照组的骨密度值无显著差异，而实 验用药组与空白对照组之间则存在显著差异，均值相差近2倍，表明和胃接骨胶囊能增加骨 量，促进骨折愈合。
[0129] 四个试验用药组中，A组的骨密度最大，B组、C组、D组和E组的骨密度虽比A组稍低， 但仍高于阳性对照组。表明实施例1的和胃接骨胶囊对骨折愈合的促进作用最佳。由A组和E 组的检测数据可知，僵蚕、女贞子和黄芪的组合较海螵蛸更有利于增加骨量，促进骨折愈 合。
[0130] (4)抗折力测试:见下表2:
[0131] 表2四周时各组3点弯曲最大破坏弯距均值比较(n = 4，^±s)
[0133] 注表示与空白对照组比较具有显著差异(P<0.05)，▽表示与阳性对照组相比 不具备显著差异(P>〇.05)。
[0134] 由表2可见，术后28天时，实验用药组和阳性对照组均与空白对照组存在显著差 异，均值相差近2倍，表明试验用药组的桡骨标本在骨折愈合中的力学性能优于空白对照 组。
[0135] (5)组织学观察：
[0136] 术后第7天:实验用药组(A组，图2a)、阳性对照组（图2b)和空白对照组（图2c)均可 见间充质细胞增殖活跃，从结构和形态上可以看出，间充质细胞有向软骨骨细胞、软骨细胞 分化的趋势;细胞间质内均可见毛细血管增生及炎性细胞浸润，并可见大量胶原细胞形成。 但空白对照组间充质细胞分化程度低，成纤维细胞较少，基质中的胶原纤维稀少；阳性对照 组间充质细胞分化程度较高，成纤维细胞分布稠密，基质中胶原纤维生成较多;实验用药组 (A组)成纤维细胞数量及胶原纤维较多，分化较成熟，细胞分布规则稠密。
[0137] 术后第14天:实验用药组(A组，图2d)、阳性对照组（图2e)和空白对照组（图2f)骨 痂中胶原纤维逐渐被骨小梁取代，但空白对照组骨小梁较少，骨痂中可见较多未成熟分化 的胶原纤维细胞、成骨细胞，细胞排列稀疏，数量较少；阳性对照组称呼细胞较多，骨细胞较 少，骨小梁生成较多；实验用药组(A组)骨小梁数量较多，骨小梁边缘的成骨细胞数量也较 多，细胞排列致密整齐，基质内可见钙盐沉着，偶见破骨细胞。
[0138] 术后第21天:实验用药组(A组，图2g)新生骨痂与骨折端正常骨组织连成一片，并 有形成连续板层骨的趋势，骨痂中可见大量位于骨陷窝内的成熟骨细胞形成，细胞周围基 质中可见大量钙盐沉着，骨细胞周围乐见较多破骨细胞；阳性对照组（图2h)也有板层骨形 成，但数量较少，基质中骨细胞、成骨细胞较多；空白对照组(图2i)骨小梁逐渐增多，骨痂内 成熟的骨细胞数量较少，骨小梁边缘可见较多成骨细胞。
[0139] 术后第28天:实验用药组(A组，图2j)骨痂组织细胞结构及形态、基质骨化程度已 接近成熟骨组织；而阳性对照组（图2k)中可见大量位于骨陷窝内的成熟骨细胞，并已形成 连续成熟的板层骨，基质钙化明显；空白对照组（图21)骨痂内成熟的骨细胞较多，可见连续 板层骨形成，板层骨边缘可见排列整齐的成骨细胞。
[0140] 由此可见，与实验用药组及阳性对照组相比，空白对照组的骨折愈合进程明显减 慢，并且试验用药组的骨折愈合进程快于阳性对照组。
[0141] (6)免疫组化染色：
[0142] ①免疫组化TGF-βΙ染色
[0143] 术后第7天:各组骨外膜下及周围软组织形成的血肿中有大量的中性粒细胞、淋巴 细胞、单核细胞、红细胞浸润，这些细胞间质中TGF-βΙ成片状分布，呈强阳性染色;在单核炎 性细胞周围，TGF-βΙ的染色更为明显;增生的骨膜细胞内有TGF-βΙ的阳性染色;大量成纤维 细胞不规则地排列在松散的纤维蛋白网架中，亦可见TGF-m的细胞外染色;其中，实验用 药组(A组)基质中阳性细胞较多，染色较深（图3a);阳性对照组基质中阳性细胞也较多，但 染色较实验用药组浅（图3b);空白对照组基质中阳性细胞则较少，染色较淡（图3c)。
[0144] 实验用药组及阳性对照组较空白对照组染色强烈，且实验用药组和阳性对照组与 空白对照组之间的平均灰度也存在非常显著性差异。
[0145] 术后第14天:实验用药组(A组，图3d)和阳性对照组（图3e)中均可见新生血管壁周 围的间充质细胞内和细胞外均为阳性染色，形成一个清晰的TGF-m环形染色带;并且实验 用药组（图3d)中还可见到骨外膜深层间细胞活跃增殖，并有向成纤维细胞、软骨细胞、成骨 细胞分化的趋势；阳性对照组（图3e)骨外膜深层间细胞活跃程度也较高，也有向功能细胞 分化的趋势。而空白对照组（图3f)的细胞活跃及分化程度均较低。在第二周时，三组细胞的 胞浆内均见TGF-βΙ阳性染色，间质中未见TGF-βΙ染色定位。
[0146] 术后第28天:实验用药组(