A组，图3g)和阳性对照组（图3h)的细胞间质中均开始出 现TGF-m的染色定位;在膜内成骨部位，新生骨小梁表面衬附的成骨细胞内可见TGF-m的 染色，同时也有细胞外染色，而埋入骨基质的成骨细胞内外TGF-m染色均为阴性;软骨细胞 内仍有TGF-m的强阳性染色;在膜内成骨以上的继续分化的间充质细胞内仍然有TGF-m阳 性染色;在软骨内成骨区域，钙化前沿的软骨细胞浆内未见TGF-m的染色，而周围基质则为 强阳性染色;桥梁骨痂骨膜增厚的部位依旧可见间充质细胞分化，并有细胞内染色阳性。而 空白对照组（图3i)中新生骨小梁较少，骨小梁表面衬附的成骨细胞内TGF-m阳性产物染色 较浅，骨基质中成骨细胞、成软骨细胞数量较少，TGF-m阳性表达较弱。
[0147] 通过免疫组化染色可发现，在试验用药组中，TGF-m在细胞中的表达水平较高， TGF-m的高表达能够刺激骨膜间充质细胞增殖分化，促进成骨细胞和软骨细胞增生，诱导 膜内成骨及软骨内成骨过程，促进细胞外基质合成。表明和胃接骨胶囊提高骨折愈合质量 的作用与促进TGF-m在骨折愈合各个阶段的表达、促进成骨细胞增殖和基质合成有关。
[0148] ②免疫组化BMP-2染色
[0149] 术后第一周：实验用药组(A组，图4a)、阳性对照组（图4b)和空白对照组（图4c)肉 芽组织及纤维性骨痂组织中均出现BMP-2阳性染色细胞(BMP-2阳性染色呈棕黄色，主要分 布于骨小梁及阳性细胞胞浆内）。其中，空白对照组中BMP-2阳性染色细胞较少，阳性染色较 弱；而阳性对照组BMP-2阳性染色细胞较多，阳性染色较强;实验用药组(A组）的镜下视野中 可见大量呈棕黄色的阳性染色细胞，阳性染色强。
[0150] 术后第二周：实验用药组(A组，图4d)、阳性对照组（图4e)和空白对照组（图4f)的 镜下视野均可见BMP-2阳性染色细胞增多。其中空白对照组的阳性染色强度仍较低；阳性对 照组的阳性染色强度增强，并可见排列紊乱的骨小梁生成;而实验用药组(A组）出现大量的 软骨岛和新生骨小梁，可见大量呈棕黄色的阳性染色细胞，阳性染色进一步增强。
[0151] 术后第三周：空白对照组（图4i)BMP_2阳性染色细胞增多，阳性染色强度逐渐增 强；阳性对照组（图4h)也可见较多的阳性染色细胞，阳性染色强度较强；而实验用药组(A 组，图4g)BMP-2阳性染色细胞较第二周时下降，阳性染色强度较第二周时下降减弱。
[0152] 术后第四周：阳性对照组（图4k)和空白对照组（图41)的BMP-2阳性染色细胞数量 均大幅度减少，阳性染色强度均明显较第三周时要弱。而实验用药组(A组，图4j)骨板边缘 可见少量BMP-2阳性染色细胞，基质中以骨细胞为主，细胞基质中BMP-2阳性产物表达已基 本消失。
[0153] BMP-2阳性表达的细胞类型主要有间充质细胞、成软骨细胞、成骨细胞等，退变的 软骨细胞和成熟的骨细胞中未见明显阳性表达。
[0154] (7)TGF-f31免疫组化染色分析
[0155] ① TGF-βΙ阳性产物面积分析结果，请见表3。
[0156] 表3 TGF-βΙ染色面积（X士s，um2，n = 8)
[0158] 注：*表示在同一时间与空白对照组相比具有显著差异(P〈0.05) ;Λ表示在同一时 间与阳性对照组相比具有显著差异(Ρ〈〇.05)。
[0159] 由表3可见，在术后第一周、第二周，试验用药组中TGF-βΙ阳性产物面积均大于阳 性对照组和空白对照组，且具有显著差异;在术后第四周，试验用药组中TGF-m阳性产物面 积与空白对照组相比具有显著差异，但与阳性对照组相比无显著差异。
[0160]表明阳性对照组与试验用药组虽然在较长的愈合期内均能达到相似的愈合效果， 但试验用药组的愈合进程比阳性对照组要快。并且，四个试验用药组的TGF-βΙ阳性产物面 积之间不存在显著差异。
[0161 ]②TGF-βΙ阳性产物染色灰度分析结果，参见表4: 「01621 耒4TrTF-Bl 塾色龙麼 ? _im2. η = 8)
[0164] 注：*表示在同一时间与空白对照组相比具有显著差异(Ρ〈0.05); Δ表示在同一时 间与阳性对照组相比具有显著差异(Ρ〈〇.05)。
[0165] 由表4可见，术后第一周，各试验用药组中TGF-βΙ阳性产物染色灰度均与空白对照 组相比具有显著差异；术后第二周，各试验用药组中TGF-m阳性产物染色灰度均与空白对 照组相比具有显著差异，且A组与阳性对照组相比还具有显著差异;术后第四周，A组和B组 中TGF-βΙ阳性产物染色灰度均与空白对照组相比具有显著差异。
[0166] 从上述结果中可以看出，在术后第一周，TGF-βΙ表达水平较低，染色灰度较高；术 后第二周，TGF-βΙ表达水平升高，染色灰度变低;术后第四周，骨折愈合进程接近尾声，TGF-βΙ表达水平下调 ，染色灰度变高。 这与图 2a~图 2i 的观察结果相一致。
[0167] (8)BMP_2免疫组化染色分析
[0168] ① BMP-2阳性产物光密度均值分析，分析结果见表5:
[0169] 表5BMP-2阳性产物光密度均值(η = 10，?士 S)
[0171] 注：**表示在同一时间与空白对照组相比具有极显著差异(P〈0.01);*表示在同一 时间与空白对照组相比具有显著差异(P〈〇.05); Δ表示在同一时间与阳性对照组相比具有 显著差异(P〈〇.05);▽表示在同一时间与阳性对照组相比不具有显著差异(P>0.05)。
[0172] 由表5可见，术后第一周和第二周，各试验用药组的BMP-2阳性产物光密度均值与 空白对照组相比均具有极显著差异，与阳性对照组相比均具有显著差异。术后第三周、第四 周时，各试验用药组的BMP-2阳性产物光密度均值有所降低，这与BMP-2免疫组化染色的结 果相一致。
[0173] ②BMP-2平均积分光密度值分析，分析结果见表6:
[0174] 表6 BMP-2阳性产物平均积分光密度值(n = 10，i±S)
[0176] 注：**表示在同一时间与空白对照组相比具有极显著差异(P〈0.01) Γ表示在同一 时间与空白对照组相比具有显著差异(P〈〇.05); Δ表示在同一时间与阳性对照组相比具有 显著差异(P〈〇.05);▽表示在同一时间与阳性对照组相比不具有显著差异(P>0.05)。
[0177] 由表6可见，术后第一周和第二周，各试验用药组的BMP-2阳性产物平均积分光密 度值与空白对照组相比均具有极显著差异，与阳性对照组相比均具有显著差异。术后第三 周、第四周时，各试验用药组的BMP-2阳性产物平均积分光密度值有所降低，这与BMP-2免疫 组化染色的结果相一致。
[0178] 以上结果表明，本发明的和胃接骨中药组合物可以明显促进成骨细胞合成及分泌 BMP-2,并使BMP-2表达高峰期提前(试验用药组的BMP-2表达高峰期在术后第二周，而阳性 对照组和空白对照组则在术后第三周），加速间充质细胞向成软骨细胞及成骨细胞转化，从 而促进骨折愈合。
[0179] 检测例2和胃接骨的中药组合物对消化系统的影响
[0180] 选用实施例1制备的和胃接骨饮(每毫升中含生药0.3g)，将与检测例1中相同的麝 香接骨丹用蒸馏水配置成〇. 3g/ml，待用。
[0181] 1、和胃接骨饮对小鼠炭末肠推进的影响
[0182] ICR小鼠 50只，雌性，体重25.5 ± 2.3Ig，按体重搭配分成4组，其中，空白对照组灌 胃给予蒸馏水（灌胃体积0.2ml/10g，下同），阳性对照组灌胃给予麝香接骨丹水溶液 (0.045g/ml，折算成生药含量），试验用药组分别灌胃给予和胃接骨饮大剂量(0.21g/ml)和 小剂量(〇.l〇5g/ml)，
[0183] ICR小鼠96只，雌性，体重25.5 ± 2.3Ig，按体重搭配分成8组，其中，空白对照组灌 胃给予蒸馏水（灌胃体积0.2ml/10g，下同），阳性对照组灌胃给予麝香接骨丹水溶液 (0.045g/ml)，试验用药组(A-1组)灌胃给予实施例1的和胃接骨饮大剂量(0.21g/ml)，试验 用药组(A-2组）灌胃给予实施例1的和胃接骨饮小剂量(0.105g/ml)，试验用药组(B组、C 组、D组、E组）分别灌胃给予实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的和胃接骨饮小剂量 (0.105g/ml);每日1次，连续7天;末次给药前1日起禁食，并于末次给药后20min灌胃给予 5%活性炭溶液0.2ml/10g，20min后脱颈臼处死，量取炭末前沿长度及小肠全长，计算炭末 推进百分率，结果见表7。
[0184] 表7各实验组对小鼠炭末肠推进的影响(X ± SD)
[0186] 注:*表示与空白对照组比较差异显著(P<