药物递送系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及热凝胶肽递送系统，其作为液体溶胶经细注射针室温注射且一旦插入人或动物身体的温暖组织就转化成高粘性凝胶。在一个优选实施方式中，所述系统基于疏水肽、壳聚糖和磷酸葡萄糖的应用。
【专利说明】
药物递送系统
技术领域
[0001] 本发明涉及热凝胶肽递送系统，其作为液体溶胶经细注射针室温注射且一旦插入 人或动物身体的温暖组织就转化成高粘性凝胶。所述肽随后以受控方式在较长时间段内从 热诱导型水凝胶释放到周围组织。
【背景技术】
[0002] 许多药物活性肽不能通过口服有效递送，因为大部分肽倾向于在胃肠道中分解。 因此，这些肽需要胃肠外递送。然而，肽类药物胃肠外施用到皮下组织或肌肉组织与由针注 射造成的患者不适相关。这些侵入性注射需要相当频繁地重复，因为许多肽仅有几小时或 甚至小于1小时的短暂半衰期。因此，开发了采用埋植剂或微粒悬液形式的胃肠外储式 (cbpot)制剂以降低这些注射必须出现的频率。
[0003] 为了慢性病患者的舒适度，需要进一步针对能经极细的针注射的缓释药物递送系 统开发目前可用的储式制剂技术。
[0004] 提示热诱导型水凝胶可作为液体溶胶注射并凝固为高粘度水凝胶。然而，许多这 类水凝胶基于高分子量聚合物，其一旦溶于水性介质，则变成高粘度溶液，从而需要较大针 号用于注射（如X.Chen等，J.Biomat.Applications 2011,27(4) ,391-402,由于使用高MW (500kDa)壳聚糖，溶胶必须用无针注射器灌输到眼内）。使用迄今所能建议的系统的另一问 题是注射后不久的极强药物释放(所谓的"突释"（burst))，导致在液体转化成水凝胶的前 一刻，大量药物已释放到组织中。更进一步，一些系统具有稳定性问题并在储存时间中已转 化成水凝胶，这使得其对于之后的注射而言不稳定(例如，如之前在例如W099/07416中所述 的由本发明的
【发明人】就壳聚糖/β_甘油磷酸系统的观测结果）。
【发明内容】
[0005] 因此仍需要持续的肽药物递送系统，其符合所有下列要求以使患者的不适度最小 化并使患者自身或由临床医师所实施注射的舒适度、安全性和操作性最大化：
[0006] -即用型（立即待用于注射的药品，没有必须进行的重要准备工作，如不需干粉用 水性载剂重溶以获得可注射悬液）
[0007] -通过极细针(如21G或更小)的注射能力
[0008] -长期(如一个月或多个月）的药物缓释
[0009] -生物相容性(如没有组分会导致注射后的疼痛）
[0010] -生物降解性(如所有组分在合理时间后由身体完全吸收以避免任何组分在重复 注射事件后的积聚）
[0011] -合理保存期限期间的物理稳定性(如贮存系统在冷却条件或室温下保存期间没 有溶胶品质的变化）
[0012] -赋形剂的良好安全性能
[0013] 本发明意外地符合所有这些要求并因此成为商业上可行的肽递送系统。
[0014] 在第一方面，本发明提供含有以下的药物递送系统：
[0015] (a)药物活性肽或其任何药学上可接受盐，如双羟萘酸帕瑞肽，
[0016] (b)壳聚糖(CS)，经修饰壳聚糖或壳聚糖衍生物，
[0017] (c)磷酸糖类，优选葡萄糖-卜磷酸(G卜P)和
[0018] (d)水。
[0019] 在第二方面，本发明提供制备如第一方面所定义的药物递送系统的方法，包括以 下方法步骤：
[0020] (1)将壳聚糖溶于酸性水溶液，优选盐酸溶液，
[0021 ] (2)将磷酸糖类溶于水性介质，优选水，
[0022] (3)使肽溶解、部分溶解、或分散于磷酸糖类溶液中，优选使所述肽分散，和
[0023] (4)将肽/磷酸葡萄糖溶液和/或悬液与壳聚糖溶液合并。
[0024]在第三方面，提供可通过第二方面所述方法获得的药物递送系统。
[0025] 在第四方面，提供第一或第三方面所述药物递送系统以用于肌肉内或皮下应用， 优选皮下应用。
[0026] 在第五方面，提供含第一、第三或第四方面所述药物递送系统的剂型，其采用在安 瓿、小瓶或预填充注射器中的液体形式。
【附图说明】
[0027]图1显示CS/G1-P水凝胶相比CS溶液的帕瑞肽释放分布(均值土SD，n = 3)并证明所 述肽相比对照的药物控释。
[0028]图2显示随着初始加载而变化的CS/G1-P水凝胶的帕瑞肽释放分布(均值土 SD，n = 3)〇
[0029] 图3显示就在2-8°C和20-25°C保存的CS溶液和CS/胶凝剂系统而言在20.0±0.2°C 的表观剪切粘度(n = 3)并证明本发明实施方式相比参照实施方式的良好物理稳定性。
[0030] 图4显示在37°C下流变学测定的在2-8°C和20-25°C保存的CS/胶凝剂溶液的胶凝 时间演变(ri = 3)，其证明本发明实施方式相比参照实施方式的良好物理稳定性。
[0031] 图5显示在用23G、25G和30G针的两种注射速度下，在空气中注射lmL CS/G1-P溶液 (1 · 5wt · % CS和0 · 40mmo 1 /g G1-P)的注射力(η = 10)，并证明本发明实施方式的良好注射能 力。
[0032] 图6显示3个不同批次1.5wt. %CS/0.40mmol/g Gl-Ρ溶液的CS的相对Mw，所述溶液 是不过滤的和经0.2μπι膜过滤灭菌的(η = 3 )，证明本发明实施方式灭菌的可行性以使其适 于胃肠外应用。
【具体实施方式】
[0033] 下文进一步详述本发明并举例说明。
[0034] 在本发明的方面中，所述肽优选是疏水的。在一个实施方式中，所述肽凭其氨基酸 特征疏水。在另一个实施方式中，所述肽凭其抗衡离子疏水，使得肽具有盐疏水性，例如，诸 如地布酸盐、萘甲酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐/恩波酸盐、硬脂 酸盐、昔萘酸盐。在一个优选实施方式中，所述肽以双羟萘酸盐存在，更优选单双羟萘酸盐。
[0035] 在一个优选实施方式中，所述疏水肽或其盐以无定型形式（结晶度〈20%，优选〈 5%)存在并（如通过喷射研磨)微粒化到粒度分布(通过激光衍射)为χ90 < ΙΟμπι(如3μπι)， χ50 < 5μηι(如Ιμπι)，χ10 2 0·3μηι(如0·7μηι)，并具有 2 8m2/g(如32m2/g)的比表面积（通过 BET)〇
[0036] 在另一个优选实施方式中，所述肽是生长抑素类似物，例如奥曲肽、帕瑞肽、伐普 肽或兰瑞肽，优选奥曲肽或帕瑞肽，更优选帕瑞肽。在一个优选实施方式中，所述疏水肽是 双羟萘酸奥曲肽或双羟萘酸帕瑞肽。
[0037] 本文的"疏水"指难溶、微溶或极微溶于水的药物特征，所述药物在环境温度（如 20-25°C)下根据药典(USP和PhEur)溶解度描述性术语，溶解度范围分别是10-33、1-10或 〇.l-lg/L。优选所述疏水肽在环境温度下极微溶于水，优选水溶性在环境温度下约为lg/L 或更低。例如，疏水肽是水溶性为〇. 〇2g/L的双羟萘酸帕瑞肽或水溶性为0.2g/L(25°C)的双 羟萘酸奥曲肽或磷酸盐缓冲液(PBS pH 7.4)中溶解度约为0.02-0.04g/L的双羟萘酸伐普 肽。
[0038] 在本发明的方面中，使用壳聚糖、经修饰壳聚糖或壳聚糖衍生物(如壳聚糖HC1、羧 甲基壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖乙酸盐）。在一个优选实施方式中，所用壳聚糖的脱乙酰 度(DD)为70-95 %，优选DD为85-95 %，更优选DD为90 ± 2.5 %。在一个优选实施方式中，所用 壳聚糖的分子量(MW)为20-300kDa，优选MW为80-200kDa，更优选MW为100-150kDa，甚至更优 选 MW 为 135±20kDa。
[0039] 在一个优选实施方式中，所述壳聚糖的脱乙酰度(DD)为50-100%且分子量(MW)为 3-300kDa，优选 DD 为85-95%和丽为100-2001^^，更优选00为85-95%和丽为100-2001^)&。 [0040]壳聚糖是可获得的，例如通过德国哈雷（萨勒）的赫比医用壳聚糖公司（Heppe Medical ChitosanGmbH)，例如类型为壳聚糖90/10(DD 87.6-92.5%，粘度8-15mPas，对应 于ca · 20-100kDa的MW(GPC))、壳聚糖90/20(DD 87 · 6-92 · 5 %，粘度 16-30mPas，对应于 ca · 40-150kDa的MW(GPC))、壳聚糖90/50(DD87 · 6-92 · 5 %，粘度31-70mPas，对应于ca · 80- 2001^3的麗（6?〇)、壳聚糖90/100(0087.6-92.5%，粘度71-15011^38，对应于。3.100- 250kDa的MW(GPC))或壳聚糖90/200(DD87 · 6-92 · 5%，粘度 151-350mPas，对应于ca. 150- 300kDa的MW(GPC))。粘度在20 °C溶于1 %乙酸的1 %壳聚糖溶液中测量。在本发明的一个优 选实施方式中，使用壳聚糖90/50。
[0041] 在本发明的方面中，使用磷酸糖类。在本发明的实施方式中，所述磷酸糖类的糖是 单糖、双糖或寡糖，优选选自醛醣的组的单糖，如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、 古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖，或选自酮糖的组，如果糖、山梨糖、 塔格糖、阿洛酮糖、阿拉伯酮糖、木酮糖，或其混合物，优选葡萄糖或果糖或其混合物。
[0042] 在一个优选实施方式中，所述磷酸糖类是磷酸葡萄糖，优选葡萄糖-1-磷酸，优选 α-D-葡萄糖-1-磷酸，更优选α-D-葡萄糖-1-磷酸二钠水合物。
[0043] 在本发明的方面中，所述药物递送系统包括基于药物递送系统总重量计的至少 1 %、至少2%、1-30%、2-10%或2-5%、优选2-5%的游离碱形式的肽。
[0044] 在本发明的方面中，所述药物递送系统包括基于药物递送系统总重量计的0.1- 10%、0.5-5%或1-2%、优选1-2%的壳聚糖。
[0045] 在本发明的方面中，所述药物递送系统包括基于药物递送系统总重量计的5- 50%、优选10-25%的药物递送系统中的磷酸糖类。优选的实施方式包括基于药物递送系统 总重量计的1〇、15和20%重量的磷酸糖类葡萄糖-1-磷酸。在这些优选实施方式中，百分比 值分别对应于〇. 27、0.40和0.53mmol/g。
[0046] 在一个优选实施方式中，所述药物递送系统，基于药物递送系统总重量计，包括、 大体包括、基本由以下组成、或由以下组成、优选由以下组成：
[0047] (a) 2-5 %的游离碱形式的疏水肽，优选以双羟萘酸盐存在，优选所述肽是双羟萘 酸帕瑞肽，
[0048] (b) 1-2%的壳聚糖，具有90 ± 2.5%的DD和135 ± 20kDa的MW，溶于酸，优选溶于盐 酸，
[0049] (c)10-25%的葡萄糖-1-磷酸，和
[0050] (d)水。
[0051] 在本发明的第二方面，提供制备如第一方面所定义的药物递送系统的方法，包括 以下方法步骤：
[0052] (1)将壳聚糖溶于酸性水溶液，优选盐酸溶液，
[0053] (2)将磷酸糖类溶于水性介质，优选水，
[0054] (3)使肽溶解、部分溶解、或分散于磷酸糖类溶液中，优选使所述肽分散，和
[0055] (4)将肽/磷酸葡萄糖溶液和/或悬液与壳聚糖溶液合并。
[0056] 在一个优选实施方式中，步骤（1)和（2)所得的溶液冷却到例如1-12°C，优选2-8 °C，然后根据步骤(3)和(4)进一步加工。
[0057] 在一个优选实施方式中，步骤(3)包括使用超声并在冷却条件下进行。冷却条件是 例如确保步骤(3)所涉及组分在超声波处理期间和之后保持在1-12Γ范围内（优选2_8°C范 围）的条件。
[0058] 在一个优选实施方式中，在步骤(4)中，在冷却条件下向壳聚糖溶液加入肽/磷酸 葡萄糖溶液。冷却条件是例如确保步骤(4)所涉及组分在加入期间和之后保持在1-12Γ范 围(优选2_8°C范围）的条件。
[0059]在第三方面，提供可根据第二方面方法获得的药物递送系统。
[0060] 在本发明的第四方面，根据第一或第三方面所述的药物递送系统用于肌肉内或皮 下应用。在一个优选实施方式中，所述药物递送系统用于皮下应用。在一个优选实施方式 中，所述药物递送系统经21G、23G、25G或30G针递送到皮下组织，优选经25针。
[0061] 在本发明的第五方面，含第一、第三或第四方面所述的药物递送系统的剂型采用 在安瓿、小瓶或预填充注射器中的液体形式，优选预填充注射器。在一个优选实施方式中， 所述预填充注射器装有21G、23G、25G或30G针，优选经25针。
[0062] 作为一个优选实施方式，第一、第三、第四或第五方面所述的药物递送系统采用精 细或均一悬液形式，其包括肽或肽盐颗粒，其中90 %或更多的弦长小于30μπι(如使用 Lasentec的激光扫描探针通过聚焦光束反射测量技术FBRM测量）。
[0063] 所述悬液足够稳定，从而其能填装到安瓿、小瓶或预填充注射器中，且长期储存后 仅需在临用前轻微摇晃。
[0064] 实施例 [0065]材料：
[0066]用于以下实施例的壳聚糖(CS)市售可得，如来自赫比医用壳聚糖公司(HMC，德国 哈雷），工业级例如Chitoscienee⑩90/ 50，或医药级例如Cliitoc_eu_tic.al? 9 0/5 0 (批次1)和 Chitoceutical?90/50(批次2)。这些壳聚糖的粘度用粘度计(博勒菲(Brookfield)DVI+pro) 在20°C (溶于1 %乙酸的1 % )测量且粘度数据处于31-70mPas范围。DD通过光度学或滴定测 量，DD数据处于87.6-92.5%范围。MW通过尺寸排阻色谱(SEC)与折射率(RI)检测结合测定， MW数据处于80-200kDa范围。
[0067] <1-0-葡萄糖-1-磷酸二钠水合物(61-?，]\^:376.168/1]1〇1)和盐酸(!1(]1)可购自不同 来源。之前（例如W002/10192)已描述帕瑞肽的合成。使用纯净水，例如通过！VlilliQ? Mi 11 ipore过滤系统(法国莫尔塞姆的密理博(Mi 11 ipore))可获得的U Itrapure?水。
[0068] 物理鉴定壳聚糖：
[0069] 用于本发明的CS通过使用2个ViscoGel A6000M(混合床)柱(德国的马尔文仪器公 司（Malvern InstrumentsGmbH))在Viscotek三重检测器阵列max系统（美国的威斯克泰 (Viscotek))上的三重检测凝胶渗透色谱(GPC)来鉴定。所述设置由以下组成:连接光散射 池的尺寸排阻色谱;折光率检测器和粘度计，其允许同步测定绝对聚合物分子量(Mw)、流体 动力学半径和特性粘度(η)。分析用〇 . 3M乙酸、0.3M乙酸钠、1 %乙二醇流动相在30°C进行， 所用流速为〇.7mL/min且dn/dc为0.163mL/g<XS样品以lmg/mL的浓度制备，搅拌下在相同缓 冲液中溶解24小时，然后在分析前用0.2μπι滤器过滤。注射体积是100yL。用获自威斯克泰的 普鲁兰标准品(Mw = 133kDa，[η] = 〇. 515dL/g，多分散指数Mw/Mn = 1.08)进行系统校准。为 评估物理数据，使用来自威斯克泰的OmniSEC软件。每次CS样品的鉴定一式两份进行。
[0070] 结果示于表1。
[0071] 表1:获自不同壳聚糖批次的物理参数
[0072]
[0074] 制备制剂
[0075] CS 溶液：
[0076] CS溶液如下获得:根据壳聚糖氨基:HC1的摩尔比为0.9:1，将3.75wt. %CS溶于盐 酸(HC1)。
[0077] Gl-Ρ 溶液：
[0078] G1-P 溶液在M i 11 i Q水中以 3 50mg · mL-1 制备。
[0079] 肽加载的CS/G1-P悬液和粒度测定：
[0080]向Gl-ρ溶液加入双轻萘酸帕瑞肽，通过磁力搅拌2小时来分散并在磁力搅拌下用 超声波探头在冰浴中超声处理2分钟（振幅80%，循环1，德国斯图加特的Hielscher超声波 技术公司UP400S超声波处理器）。3.60g G1-P/肽悬液随后在磁力搅拌下逐滴加入2.40g冰 浴中的冷CS溶液。如通过光学显微镜和聚焦光束反射测量技术(FBRM)证实(表2)的，所得 CS/G1-P/肽制剂进一步搅拌，直至获得均一悬液。最终制剂在2-8°C保存待用，所述制剂包 含1.5￥匕％〇5、0.40_〇1/^61?和2.5或5.(^1%肽。
[0081 ] FBRM数据用Lasentec FBRM PI-14/206探针（美国的梅特勒-托利多（]\^?16『- Toledo))获得并用Lasentec FBRM软件(6.7.0版09/2005，美国哥伦比亚的梅特勒-托利多） 分析。此光散射技术测量来自蓝宝石窗口外聚焦的旋转激光束的反向散射光，其与悬液接 触。激光在探针窗口附近扫描颗粒时，产生背散射光信号，其持续时间被译成弦长(一个颗 粒边缘与另一颗粒边缘之间的直线距离）。因此，即使弦长与粒度相关，也不直接测量粒度 分布，而是测量弦长分布。
[0082]表2:CS/G卜P/肽悬液中的弦长分布
[0083]
[0085]肽加载的CS悬液(没有磷酸葡萄糖的对照）：
[0086]根据同一操作制备作为对照的CS/肽悬液，但所述肽在水中而非Gl-Ρ溶液中分散。
[0087] CS/G1-P/帕瑞肽2.5%(实施例1)和CS/G1-P/帕瑞肽5%(实施例2)的制备方法(批 量6G)的详细描述：
[0088] 材料：
[0089] HMC的Chitoceutical 90/50(DD:88.7%Mw:149kDa);Fluka的HC1 1M;西格玛 (Sigma)的Gl-Ρ二钠(Mw: 361 · 59G/mol);无定形、微粒化的双轻萘酸帕瑞肽（游离碱Mw: 1047.21，双羟萘酸盐Mw: 1435.53，激光衍射的粒度分布:χ90 < 10μπι(这里为3μπι)，χ50 < 5μπι (这里为lμm)，xl0 2 0·3μm(这里为0·7μm)，比表面积（BET)2 8m2/g(此处为32m2/g));水 (MilliQ)。
[0090] (1)制备壳聚糖溶液
[0091] 通过磁力搅拌过夜制备溶于HC1 0.185M的40.00g 3.75%w/w壳聚糖溶液。壳聚糖 溶液经Ilym尼龙滤器过滤以移除任何不溶性颗粒物质。溶液在2-8°C保存。 要求 实际 iTics (g) 1.50 1,50
[0092] HC10.185M qsp (g5 40.00 40.00 Ccs,〇i (nig/g) 37.5 37.5 pH 5.5-5.8 5.55
[0093] (2)制备05/61-?/帕瑞肽2.5%热凝胶悬液(实施例1):
[0094] (2 · 1)制备 Gl-P/帕瑞肽5 · 712 % 悬液：
[0095] 在玻璃烧杯中称取342.70mg双羟萘酸帕瑞肽和1500.00mg Gl-P，用水调整到 6.000g。所述混合物通过磁力搅拌2小时来预均质化。
[0096] 然后所述混合物如下均质化:在磁力搅拌下用超声波探头在冰浴中超声处理5分 钟(振幅80%，循环1)。 要求 实际 (mg) 1500.0 1500.11 m ,.. , ., (mg) 342.70 342.29
[0097] Β?ο qsp (g) 6.()()0 5.9987 Qii.plmg/g) 250.00 250.07 C 胺(mg/g) 57.12 57.06
[0098] (2.2)制备CS/G1-P/S0M230 2.5%热凝胶悬液：
[0099] 称取2.400g壳聚糖溶液到带磁力搅拌器的配衡玻璃烧瓶。
[0100] 冰浴下，壳聚糖溶液和G1-P/双羟萘酸帕瑞肽5.712 %悬液冷冻至少15分钟。在磁 力搅拌下向壳聚糖溶液逐滴加入3.600g G1-P/双羟萘酸帕瑞肽5.712%悬液。连续搅拌所 得悬液至少30分钟或直至药物彻底分散。（用Lasentec探针，FBRM)测定pH和平均粒度。悬液 在2-8 °C保存。 要求 实际 m( Sv,i (?) 2.400 2.40039
[0101] " mGi-p/賤報帕磁 5.7i2% (g) 3.600 3.60797 im<ss/gi p/w 2 5% (§) 6.000 6.00835
[0102] (3)制备CS/G1-P/帕瑞肽5%热凝胶悬液(实施例2):
[0103] (3 · 1)制备G1-P/双羟萘酸帕瑞肽11 · 42 3 %悬液：
[0104] 称取685.40mg双羟萘酸帕瑞肽和1500.0Omg G1-P到玻璃烧杯并用水调整到 6.000g。所述混合物通过磁力搅拌2小时来预均质化。
[0105] 然后所述混合物如下均质化:在磁力搅拌下用超声波探头在冰浴中超声处理5分 钟(振幅80%，循环1)。
[0106] 要求 实际 m(il.P (ins's 1500.0 1499.81 m ·, ； (mg) 685.4Q 685.60 H：0 qsp (g) 6.000 5.99967 C(iM? (mg/??) 250.00 249.98
[0107] C 职帕職（g) 114.23 114.27
[0108] (3 · 2)制备CS/G1-P/帕瑞肽5 %热凝胶悬液：
[0109] 称取2.400g壳聚糖溶液到带磁力搅拌器的配衡玻璃烧瓶。
[0110] 冰浴下，壳聚糖溶液和61-?/301230双羟萘酸盐11.423%悬液冷冻至少15分钟。在 磁力搅拌下向壳聚糖溶液逐滴加入3.600g G1-P/双羟萘酸帕瑞肽11.423%悬液。连续搅拌 所得悬液至少30分钟或直至药物彻底分散。（用Lasentec探针，FBRM)测定pH和平均粒度。悬 液在2-8 °C保存。 要求 实际 iricssoi (S) 2.400 2.39977
[0111] mGip觸! j.4r，v(g) 3,600 3.59806 mrsiii-p ：? .!' 5"" (g) 6.000 5.99783
[0112] (4)结果：
[0113] 要求 实际 pH2-8°C
[0114] (wt%) (wt%)
[0115] 实施例1壳聚糖 1.50 1.498
[0116] Gl-P 15.00 15.017 7.30
[0117] S0M230游离碱 2.50 2.500
[0118] 实施例2壳聚糖 1.50 1.500
[0119] Gl-P 15.00 14.996 7.32
[0120] S0M230游离碱 5.00 5.001
[0121] 通过HPLC的肽定量：
[0122] 用Agilent 1100 HPLC系统(美国加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦)并采用沃特斯 屏蔽型固定相色谱柱RP18(3.5μηι，50x4.6mm)(美国米尔福德的沃特斯公司（Waters Corporation))对肽定量。流动相A由水、乙腈、磷酸（900 :100:1V/V/V)组成且流动相B为 (100:900: 1V/V/V)，流速为1. OmL/min，使用6级梯度。10yL样品在40°C的烘箱温度下注射。 通过在230nm的UV检测进行分析。所有样品一式两份注射。所得色谱图用Chromeleon 6·8数 据系统(美国加利福尼亚州森尼韦尔的戴安公司(Dionex Corporation))分析。肽的参照储 液在甲醇中制备，不同浓度的标准溶液用pH 7.4的释放介质制备(见表2)。所得校准曲线范 围是3-250yg/mL，相关系数高于0.999。
[0123] 体外释放试验：
[0124] 体外释放试验用两种不同的方法一式三份进行。方法I中，约0.5g量(准确称量到 O.OOlg)的制剂经21G针注入50mL试管并在维持于37°C的往复振荡水浴(德国布尔格韦德尔 的GFL)中孵育1小时以成胶。然后，将25mL预加温到37°C的pH 7.4的释放介质缓慢加入储式 制剂(t = 0)，开始轻微振荡（10%)。方法II中，在维持于37°C的往复振荡水浴(德国布尔格 韦德尔的GFL)中（t = 0)，相同量的制剂直接注入含25mL预加温到37°C的pH 7.4的释放介质 (就肽加载制剂而言是50mL)的50mL试管。静止1小时以成胶后，开始轻微振荡（10%)。对于 方法I和方法II，在确定时间点，使试管温和均质化，离心，从培养液中移出10mL样品（就肽 加载制剂而言是25mL)并用新鲜释放介质取代以维持恒定体积且保持灌式(sink)状态。所 有测量一式两份进行。如上所述，释放的肽量通过HPLC测定。用于各释放试验的pH 7.4的释 放介质的组成列于表3。
[0125]表3:用于体外释放试验的pH 7.4的释放介质的组成 [0126]
[0127] *:聚山梨醇酯80作为表面活性剂加入以提高肽在释放介质中的溶解度
[0128] 肽加载CS/G1-P储式制剂的缓释性能：
[0129] 05/61-?/肽制剂在37°(：注入?!17.4的释放介质后转变成固体储库。相反，由于介 质的pH，肽加载CS溶液(无胶凝剂)逐步固化成大量聚集物。CS/G1-P/肽储库在90天的释放 试验中维持其形状和结构完整性。
[0130]肽加载CS/G1-P水凝胶的释放分布示于图1。
[0131]相较无胶凝剂的肽悬液(60.6± 16.8% )，向CS溶液加入Gl-Ρ可显著减少初始突释 (在6小时内释放2.5 ± 2.1 % )。此外，CS/G1-P/肽制剂显示该肽在超过3个月阶段中缓慢释 放，而纯CS基阳性对照在约3天中实现80 %释放。事实上，含2.5 %肽的储库在90天内显示 47%释放，遵循双相释放模式。其在第1周中显示约20%的小突释，然后是更慢的缓释阶段。
[0132] 在完整试验期间中观察到三重样品之间所释放肽量的小标准偏差，大多低于土 3%，显示储式制剂随着时间实现良好的释放重复性。
[0133] 药物加载的影响：
[0134] 如图2所示，CS/G1-P/肽2.5与CS/G1-P/肽5制剂之间的肽加载加倍不会显著影响 初始突释(6小时中分别为2.5%和2.3%)，维持总体双相释放模式。然而在更慢的释放阶 段，5%加载的水凝胶比2.5%加载的水凝胶释放肽更慢，导致90天后两种制剂之间的18% 的差异。
[0135] 本发明所例示实施方式的下列分析试验用相应的安慰剂制剂进行，其结果同样代 表含肽制剂。
[0136] 制备CS/G1-P安慰剂溶液：
[0137] CS溶液如下获得:根据CS氨基:HC1的摩尔比等于0.9:1，将3.75wt. %CS溶于HC1。 Gl-Ρ溶液在MilliQ水中以多种浓度制备。CS和Gl-Ρ溶液分开冷却到4°C，持续15分钟。然后 Gl-Ρ溶液在磁力搅拌下逐滴加入置于冰浴中的CS溶液。所得CS/G1-P溶液进一步搅拌15分 钟。所得制剂在2_8°C保存。作为参照，CS/β-甘油磷酸二钠盐水合物（f3-GP，Mw:288.10G/ mol)溶液根据同一过程制备。
[0138] 流变测量：
[0139] 流变测量用Haake Rheostressl流变仪（卡尔斯鲁厄的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))进行，其采用循环环境系统以控制温度。样品体积是约0.5mL，在锥板 几何结构(2°圆锥角，35_直径）间引入。溶剂阱用于最小化所有试验中的水蒸发。为测定其 在20.00 ± 0.20°C的粘度，新鲜制备的脱气样品在受控剪切速率下进行旋转试验，所述样品 用1 ·5wt· %Chitoceuticar 90/50( 1)和0·00-0·53mmol/g范围的Gl-Ρ浓度制备，其中剪切速 率保持恒定持续60s且随后从5逐步增加到103^1。表观剪切粘度值计算为在各剪切速率平 衡30s后测定的表观剪切粘度均值。进行以下试验：（i)用于测定胶凝时间的时间扫描实验， 在1Hz的恒定角频率和37.00 ± 0.20 °C的恒定温度下完成。溶胶/凝胶转变温度(T雛)或时间 (t凝狡)对应于G'和G"的曲线交点；（ii i)通过在水凝胶上实施频率扫描测试评估水凝胶强 度，所述水凝胶通过接触空气或在PBS中形成。凝胶如下制备:为防止水分蒸发而在水分饱 和的大气中或在37°C预加热的lmL PBS中，lmL CS/Gl-Ρ溶液灌入圆形模具并在37°C孵育6 小时、24小时和48小时以形成水凝胶。
[0140] 稳定性试验：
[0141 ]稳定性试验用不同CS溶液完成：（i)纯CS溶液，1.5wt. %CMtoeeuticaf390/50(2); 两种CS/G1-P溶液（i i ) 1 · 5wt · % Chitoceuticar90/50 (1) /0 · 27mmo 1 /g G卜P和（i i i ) 1 · 5wt · % Chitoceuticalk 9()，50(1 )/0 · 40mmol/g G卜P及（iv)a CS/f3-GP溶液，以及作为参照 的 1 · 5wt · % Chitoceuticalκ 90/50(1 )/0 · 40mmol/gi3-甘油磷酸二钠盐水合物（β-GP，Mw: 288.10G/m〇l)。这些溶液经0.22μπι滤器过滤，装填入2R小玻璃瓶，用氮气排空然后气密封。 米用Lighthouse FMS-760仪器（莱特浩斯仪器公司（Lighthouse Instruments)，LLC)，通过 频率调制光谱测定的平均顶部空间氧气含量是〇.70±0.07%。样品在冷藏条件（即2-8°C) 和室温（即20-25°C)下保存，分别在样品于2-8°C保存后七=1、7、14、30、60、90、135、180和 270天以及样品于20-25 °C保存后t = 1、7、14、30、60和180天分析。在各时间点，跟踪各样品 的不同特征组：（i)目测检查制剂的任何外观变化，即颜色、浊度、稠度(液体或凝胶状态）； (i i)用691 pH计(瑞士黑里绍的万通(Metrohm))测定pH值；（i i i)如章节"流变测量"所述，通 过实施逐级测验来测量20.00±0.20°C下的粘度；（iv)如"流变测量"所定义，通过时间扫描 实验测定胶凝时间。
[0142] CS/胶凝剂溶液的贮存稳定性：
[0143] 贮存稳定性是在原位形成水凝胶系统药物开发中需要评价的关键参数。此类制剂 应具有可接受的半衰期，即其物理热凝胶特性应在整个所定义的贮存条件中维持直至施 用。这部分呈现两种本发明所述的CS/Gl-Ρ热凝胶溶液(具有0.27和0.40mmol/g Gl-Ρ)与参 照CS/0-GP热凝胶溶液(有0.40mmo 1/gi3-GP)和纯CS溶液(在同一聚合物浓度：1.5wt. % )对 比的稳定性研究。所述研究包括两种不同贮存温度(2-8°C和20-25°C)、表观、pH、粘度和溶 液胶凝时间以及CS分子量的6-9个月的随访。
[0144] 表观和pH:
[0145] 总体上，在6-9个月的贮存中（两种温度都）没有观察到CS和CS/G1-P溶液的表观 (液态）或pH值变化。纯CS溶液的pH保持为5 · 2±0 · 1，而对于0 · 27和0 · 40mmol/g G1-P，CS/ Gl-Ρ溶液的pH分别是7.1±0.1和7.2±0.1。相反，CS/f3-GP溶液于2-8 °C下小于30天内和20- 25 °C下仅1天后就转变成浑浊凝胶，pH值从7.4下降到7.0。
[0146] 粘度：
[0147] CS溶液和CS/胶凝剂系统的表观剪切粘度示于图3。结果显示对于长达6-9个月的 贮存阶段和在冷藏条件下，纯CS和CS/G1-P溶液的表观剪切粘度保持不变。相反，剪切速率 为5sHcS/0-GP的粘度在30天内从约180mPas显著增加到7500mPas。同样，CS/G1-P溶液的 粘度在室温稳定2个月且在低剪切速率下于6个月后仅略微增加，而纯CS溶液的粘度随着时 间极轻微降低且CS/0-GP溶液的粘度仅在7天后就大幅提高。这些结果与之前的观察完全一 致，即对于两种贮存条件，纯CS溶液以及CS/G1-P溶液随着时间保持液态，而CS/0-GP溶液随 着时间转变成凝胶。相比室温下的小于7天，冷藏条件下贮存能使CS/0-GP制剂维持液态稍 多于14天。一旦出现溶胶/凝胶转变，CS/0-GP凝胶的粘度持续增加直至稳定（图3(g)中在2- 8°C更明显）。
[0148] 胶凝时间：
[0149] 追踪在相同贮存时期中设定在37°C的不同CS/胶凝剂制剂的溶胶/凝胶转变时间 并示于图4。看来由0.27mmol/g Gl-Ρ组成的溶液的胶凝时间随着时间而不稳定，在20-25°C 和2-8°C下贮存6个月后，从初始约40分钟分别减少到35分钟和27分钟，在20-25°C条件下随 着时间观察到显著变化。当Gl-Ρ浓度增加到0.40mmol/g时，这些变化消失。事实上，在20-25 °(：保存的含0.40mmol/g Gl-Ρ的CS/Gl-Ρ溶液观察到的胶凝时间在2个月中稳定，但之后略 微减少。然而，当在冷藏条件下贮存时，此溶液在9个月中显示12.2± 1.0分钟的恒定胶凝时 间。关于CS/0-GP溶液，样品在2-8°C下在小于30天内经历自发胶凝，而20-25 °C下为1天。这 些观察通过流变测量胶凝时间证实，因为CS/0-GP系统从时间扫描实验开始起就表现出凝 胶样性能(G'>G"）。然而，这些时间点前，胶凝时间仍然极快:在1-2分钟范围内。因此，CS/β- GP溶液在室温或冷藏条件下保存时不稳定。相反，向CS溶液加入作为替代性胶凝剂的 0.40mmol/g Gl-Ρ可显著提高系统稳定性，尤其是在2-8°C保存时。
[0150]注射能力评估：
[0151]含有 1.5wt. %Chitoceutical?90/50(l)和0.40mmol/g Gl-Ρ的CS/Gl-Ρ溶液的注射 力用电子拉伸试验器(茨维克(2?^)2 2.5，德国乌尔姆)测量并用仏#乂?6竹11软件(3.0 版，德国乌尔姆的茨维克)分析。使用lmL注射器（lmL Luer-Lok Tip注射器，美国新泽西州 富兰克林的BD)将lmL热凝胶溶液注入空玻璃容器。测试数种针：（i)23G(HSW F丨nE-JEGT'? 23G x 1"，德国图特林根的HSW公司(Henke-Sass WolfGmbH))，（ii)25G(Temm〇?皮下注射 针，25G X Γ薄壁针，美国新泽西州萨默塞特的泰尔茂医疗公司（Terumo Medical Corporation))和（iii)30G(BD Microlance?3,30G xl/2"，美国新泽西州富兰克林湖的 BD)。测量前，所有注射器室温平衡10分钟并通过排出气泡直到流出少量溶液以待用。对于 各针号，注射力在两种不同注射速度下测量:80和100mm/min。所有测量重复10次。
[0152] 根据Schoenhammer等Pharmaceutical Research,26(2009)2568-2577，将20N上限 设为s. c.注射的接受标准。结果示于图5，显示仅针号显著影响注射力。用23G和25G针时，注 射CS/G1-P溶液所需的力低于5N，这被认为可以极平稳地注射。使用30G的较细针需要约 17.5N的增大的注射力，但仍不超过20N上限。因此，本发明基于CS的制剂可被视作容易经细 如30G或更细的针注射。
[0153] 无菌过滤：
[0154] 含1 · 5wt · % ChitoceuticalK 90/50( 1)和0 · 40mmol/g Gl-Ρ的CS/G1-P溶液经0 · 22μπι 注射器滤器(亲水性，33mm直径，4.5cm2过滤面积，Mi 1 lex-GV滤器，密理博)过滤。通过研究 在无菌过滤前后测量的用GPC测定的CS分子量，对3个批次评价无菌过滤对溶液特性的影 响。相对于未过滤溶液的Mw，计算过滤溶液中CS的分子量。所有测量一式三份进行。
[0155] 无菌过滤易针对CS/G1-P溶液进行。如图6所示，过滤后溶液粘度保持不变。GPC分 析显示未过滤和过滤制剂之间聚合物分子量仅略减少约1%，该值在所述方法的精度范围 内（± 5 % )。因此，认为无菌过滤中没有聚合材料在滤器上损失。
[0156] CS/G1-P水凝胶的体内施用/局部耐受性：
[0157] 在健康的10周龄Hans Wistar雄性大鼠中检测CS/G1-P水凝胶在3周内的局部耐受 性。0.5mL室温平衡的无菌CS/G1-P热凝胶溶液（1.5wt. %Chitoceuticar 90/50(2)， 0.40mmol/g Gl-Ρ)用23G针皮下注射入9只全身麻醉大鼠的肩胛间区。在其尾背侧区皮下注 入相同体积的无菌盐溶液作为负对照。监控动物的健康状态和体重。如下在异氟烷状态下 收集血液样品：在第-3天(施用前)进行舌下穿刺用于血液学分析，以及在尸检日进行腔静 脉穿刺用于血液学及生化分析。1、7和21天后，3只大鼠在暴露于异氟烷后通过从腔静脉穿 刺放血来处死，切除注射位点处的组织以用于组织学检查。
[0158]表4:植入CS/Gl-Ρ水凝胶的大鼠 s. c.组织的组织学检查
[0159]
[0160]对于炎症，"++"、"+++"和"++++"分别指不轻度、中度和显著炎症反应。
[0161 ]对于纤维化，"+"和"++"分别代表无、极小和轻微纤维化。
[0162]在大鼠皮下注射CS/Gl-Ρ制剂周围观察到的炎性反应是典型异物反应，类似于其 他储库系统(如PLGA微粒或标准CS/0-GP水凝胶）中报道过的组织反应。注射制剂后，急性到 慢性炎症按顺序发生且炎症往往随着时间消退。纤维化伴随炎症反应并位于植入位点周 围；其在注射后7天以充分血管化的未成熟肉芽组织开始，在接近21天时形成由成纤维细胞 和胶原纤维组成的轻微血管化的厚囊(capsule)。因此，水凝胶表现出可接受的组织生物相 容性。
【主权项】
1. 一种药物递送系统，所述系统包括： (a) 药物活性肽或其任何药学上可接受盐， (b) 壳聚糖，经修饰壳聚糖或壳聚糖衍生物， (c) 磷酸糖类，和 (d) 水。2. 如权利要求1所述的药物递送系统，其特征在于，一种所述肽为疏水性。3. 如前述权利要求中任一项所述的药物递送系统，其特征在于，一种所述肽以疏水盐 形式存在，如所述肽作为双羟萘酸盐存在。4. 如前述权利要求中任一项所述的药物递送系统，其特征在于，一种所述肽是生长抑 素类似物，例如奥曲肽、帕瑞肽、伐普肽或兰瑞肽，优选奥曲肽或帕瑞肽，更优选帕瑞肽。5. 如前述权利要求中任一项所述的药物递送系统，其特征在于，所述壳聚糖的脱乙酰 度(DD)为70-95%，优选DD为85-95%，更优选DD为90±2.5%。6. 如前述权利要求中任一项所述的药物递送系统，其特征在于，所述壳聚糖的分子量 (MW)为 20-300kDa，优选 MW 为 80-200kDa，更优选 MW 为 100-150kDa，甚至更优选 DW 为 135 土 20kDa〇7. 如前述权利要求中任一项所述的药物递送系统，其特征在于，所述壳聚糖的脱乙酰 度(DD)为50-100 %且分子量(MW)为3-300kDa，优选85-95 %的DD和100-200kDa的MW，更优选 85-95% 的 DD 和 100-200kDa 的 MW。8. 如前述权利要求中任一项所述的药物递送系统，其特征在于，所述磷酸糖类的糖是 单糖、双糖或寡糖，优选选自醛醣的组的单糖，如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、 古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖，或选自酮糖组，如果糖、山梨糖、塔 格糖、阿洛酮糖、阿拉伯酮糖、木酮糖，或其混合物，优选葡萄糖或果糖或其混合物。9. 如前述权利要求中任一项所述的药物递送系统，其特征在于，所述磷酸糖类是磷酸 葡萄糖，优选葡萄糖-1-磷酸，优选α-D-葡萄糖-1-磷酸，更优选α-D-葡萄糖-1-磷酸二钠水 合物。10. 如前述权利要求中任一项所述的药物递送系统，其特征在于，所述系统包括基于药 物递送系统的总重量计至少1 %、至少2 %、1-30 %、2-10 %或2-5 %、优选2-5 %的游离碱形 式的肽。11. 如前述权利要求中任一项所述的药物递送系统，其特征在于，所述系统包括基于药 物递送系统的总重量计0.1-10%、〇.5-5%或1-2%、优选1-2%的壳聚糖。12. 如前述权利要求中任一项所述的药物递送系统，其特征在于，所述系统包括基于药 物递送系统的总重量计5-50%、优选10-25%的药物递送系统中的磷酸糖类。13. 如前述权利要求中任一项所述的药物递送系统，其特征在于，所述系统，基于药物 递送系统的总重量计，包括、大体上包括、基本由以下组成、或由以下组成、优选由以下组 成： (a) 2-5%的游离碱形式的疏水肽，优选以双羟萘酸盐存在，优选所述肽是双羟萘酸帕 瑞肽， (b) 1-2 %的壳聚糖，具有90 ± 2.5 %的DD和135 ± 20kDa的MW，溶于酸，优选溶于盐酸， (c) 10-25%的葡萄糖-1-磷酸，和 (d)水。14. 一种制备如权利要求1-13中任一项所述药物递送系统的方法，所述方法包括以下 方法步骤： (1) 将壳聚糖溶于酸性水溶液，优选盐酸溶液， (2) 将磷酸糖类溶于水性介质，优选水， (3) 使肽溶解、部分溶解、或分散于磷酸糖类溶液中，优选使所述肽分散，和 (4) 将肽/磷酸葡萄糖溶液和/或悬液与壳聚糖溶液合并。15. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)和(2)所得的溶液冷却到例如 1-12°C，优选2-8°C，然后根据步骤(3)和(4)进一步加工。16. 如权利要求14-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)包括使用超声并 在冷却条件下进行。17. 如权利要求14-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，在冷却条件 下向壳聚糖溶液加入肽/磷酸葡萄糖溶液。18. -种可通过如权利要求14-17中任一项所述方法获得的药物递送系统。19. 如权利要求1-13中任一项或权利要求18所述的药物递送系统，其特征在于，所述系 统用于肌肉内或皮下应用，优选皮下应用。20. -种剂型，其特征在于，所述剂型包括如权利要求1-13中任一项、权利要求18或19 所述的药物递送系统，所述系统采用液体形式，优选在安瓿、小瓶或预填充注射器中的悬 液，优选采用在装有21G或更细、优选25G或更细的注射针的预填充注射器中的悬液形式。
【文档编号】A61K47/26GK105828803SQ201480069794
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年12月17日
【发明人】S·萨坡
【申请人】诺华股份有限公司