一种酶刺激响应型智能纳米容器及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶刺激响应型智能纳米容器，由MCM?41介孔二氧化硅和环糊精通过一条含有酯键的化学链相连接形成。所述的酶刺激响应型智能纳米容器通过先将介孔二氧化硅微球进行表面修饰后与七?(6?脱氧?6?叠氮基)?β?环糊精通过反应组装成纳米容器，再通过自然吸附使药物存储在MCM?41介孔二氧化硅的内部制备而成。脂肪酶作用于智能纳米容器中的酯键，实现药物的释放，从而促使纳米容器吸附?释放药物分子。本发明的智能纳米容器作为一种药物载体系统，能够对人体中的多种酶做出响应，并且对酶刺激响应灵敏度高，操作简便，在生物化学医学领域具有良好的应用前景，能够实现靶向治疗癌症杀灭癌细胞，适用于癌症的治疗。
【专利说明】
-种酶刺激响应型智能纳米容器及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于材料科学技术领域，具体设及一种酶刺激响应型智能纳米容器及其制 备方法。
【背景技术】
[0002] 智能纳米容器，能在外界的某种刺激信号刺激下发生水解、质子化、构象、亲水性 和溶解度等性质变化，实现反馈调节，并且根据刺激信号的性质和强弱调整药物释放的时 间、空间和剂量。刺激信号主要包括内源性刺激，如pH值、氧化还原物质和酶浓度等，和外源 性刺激，如溫度、光、磁场、超声和电压等。具有缓释、控释和祀向释放功能的智能纳米容器 药物传递系统可W提高药物生物利用度并降低其毒副作用。具备自组装能力的超分子实体 是构筑具有特殊性能的智能药物载体的理想搁块。
[0003] Wang等人（Mingdong W, et al. Qiemical Communications , 2014,50(39): 5068- 5071)将含有叠氮基的苯并咪挫和带有烘基的β-环糊精通过点击反应生成一个遇酸可分解 的可控开关，然后用硅烷偶联剂3-氨基丙基和Ξ甲氧基硅烷在介孔二氧化娃表面修饰丙 氨，最终由于介孔二氧化娃-丙氨上有游离的氨基，可W和被修饰的β-环糊精上面的舰原子 发生取代反应，把遇酸可分解的开关连接到介孔二氧化娃纳米微球的表面上，构建了 pH刺 激响应型智能药物纳米容器，该智能药物纳米容器能够实现药物在酸性条件时的抑响应吸 附和释放。Lin等人（Min Lin,et al.Acs Applied Mate;rials&Inte;rfaces,2014,6(8): 5860-5868)制备了能够在酶作用下发生响应的智能纳米容器，通过硅烷偶联剂Ξ乙氧基娃 烧把DNA修饰在介孔二氧化娃纳米微球表面，如果纳米微球的介孔中装载有药物分子，微球 表面卷曲形状的DNA分子就会对纳米微球进行封装，当DNA酶(I酶)加到模拟液体中时，介孔 二氧化娃纳米微球表面的DNA就会发生水解，成为大量细小的片段，介孔处的口打开，药物 分子就可W释放出来。
[0004] 目前报道的可控性释放的智能纳米容器虽然能够对外部刺激作出响应，但是存在 响应时间长，响应过程繁琐复杂，适用范围狭窄，灵敏度低等问题。此外，有的智能纳米容器 中的超分子阀口具有生物毒性，限制了其在生物医学领域中的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种响应过程快、灵敏度高、操作性好的酶刺激响应型智 能纳米容器及其制备方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0007] -种酶刺激响应型智能纳米容器的制备方法，具体步骤如下：
[000引步骤1，制备介孔二氧化娃微球；
[0009] 步骤2,将介孔二氧化娃微球超声分散在无水甲苯中，逐滴加入3-氨丙基Ξ乙氧基 硅烷后加热回流，氮气保护，揽拌进行无水无氧缩醇反应，得到产物MS化-1;
[0010] 步骤3,将MS化-1分散在二甲基亚讽中，然后加入下二酸酢和Ξ乙胺，于35°C~45 °C下反应48~60小时，反应产物先后用乙醇和甲醇清洗后烘干即得产物MS化-2;
[0011] 步骤4,将MS化-2与2-(2-丙烘氧基）乙醇、N，N-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基化 晚在二甲基亚讽中混合，于35°C~45°C下反应24~36小时，反应产物先后用二甲基亚讽和 水清洗后烘干；
[0012] 步骤5,将步骤4得到的产物加入到吸附分子的饱和水溶液中，室溫下吸附72~84 小时；
[0013] 步骤6,将含有屯-(6-脱氧-6-叠氮基)-β-环糊精、无水硫酸铜和抗坏血酸钢的N， Ν-二甲基甲酯胺溶液加入到步骤5中的吸附溶液中，反应72~84小时，产物用水洗后即得酶 刺激响应型智能纳米容器。
[0014] 本发明步骤1中所述的介孔二氧化娃微球优选为MCM-41，可参考文献【Werner Slobcr,Arthur Fink,Ernst Bohn.Controlled growth of monodisperse silica，spheres in the micron size range：Journal of Colloid and Interface Science，1968:P62- 69】制备。
[0015] 优选地，步骤2中，所述的介孔二氧化娃微球与3-氨丙基Ξ乙氧基硅烷的摩尔比为 1:1 ~1.2:1。
[0016] 优选地，步骤3，4和6中加入反应物的量为化学反应计量比，可根据反应情况适当 增加与介孔二氧化娃反应的各物质的量W达到提高产率的目的。
[0017] 优选地，步骤5中，所述的吸附分子为罗丹明B或盐酸多柔比星(D0X)。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有W下显著优点：（1)本发明的酶刺激响应型智能纳米 容器的制备方法简单方便；（2)酶刺激响应型智能纳米容器响应过程简单且迅速，灵敏度 高，应用范围广；（3)智能纳米容器中的超分子阀口具有良好的生物相容性，无毒可降解，且 不产生酸性分解物，在药物可控释放领域具有广泛的应用价值。
【附图说明】
[0019] 图巧本发明的酶刺激响应型智能纳米容器的装配图。
[0020] 图2为本发明的酶刺激响应型智能纳米容器的结构图。
[0021] 图3为酶刺激响应型智能纳米容器对罗丹明B的释放图。
[0022] 图4为酶刺激响应型智能纳米容器对盐酸柔比星(D0X)的释放图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图及具体实施例，对本发明做进一步详细说明。
[0024] 如图1所示，为本发明的酶刺激响应型智能纳米容器的制备流程图，首先制备介孔 二氧化娃，随后对其进行表面修饰，最后将环糊精与其进行封装。如图2为酶刺激响应型智 能纳米容器的结构示意图。
[0025] 本发明的一种酶刺激响应型智能纳米容器，具体制备步骤如下：
[00%] 步骤1，制备介孔二氧化娃微球MCM-41，参考文献（WernerSt郎巧Arthur Fink, Ernst Bohn.Controlled growth of monodisperse silica,spheres in the micron size range：Journal of Colloid and Interface Science，1968:P62-69)审ij备；
[0027]步骤2,将介孔二氧化娃微球超声分散在无水甲苯中，逐滴加入3-氨丙基兰乙氧基 硅烷后加热回流，氮气保护，揽拌进行无水无氧缩醇反应，得到产物MSNs-1，其中介孔二氧 化娃微球与硅烷偶联剂3-氨丙基Ξ乙氧基硅烷的摩尔比为1:1~1.2:1;
[00%]步骤3,将MSNs-1分散在二甲基亚讽中，按化学计量比加入下二酸酢和Ξ乙胺，于 35°C~45°C反应48~60小时，反应产物先后用乙醇和甲醇清洗后烘干即得产物MS化-2;
[00巧]步骤4,将MS化-2与2-(2-丙烘氧基）乙醇、N，N-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基化 晚按化学计量比在二甲基亚讽中混合，于35°C~45°C下反应24~36小时，反应产物先后用 二甲基亚讽和水清洗后烘干；
[0030] 步骤5,将步骤4的产物加入到吸附分子的饱和水溶液中，室溫下吸附72~84小时， 所述吸附分子为罗丹明B或盐酸多柔比星(D0X);
[0031] 步骤6,将屯-(6-脱氧-6-叠氮基)-β-环糊精，无水硫酸铜，抗坏血酸钢按化学计量 比溶于Ν，Ν-二甲基甲酯胺后加入到步骤5中的吸附溶液中，继续反应72~84小时，产物用水 洗清洗，得到上述一种酶刺激响应型智能纳米容器。
[0032] 实施例1
[0033] -种酶刺激响应型智能纳米容器的制备方法，具体步骤如下：
[0034] 1.制备介孔二氧化娃微球MCM-41
[0035] 将十六烷基Ξ甲基漠化锭（CTAB，0.5g)，NaOH溶液（2mo 1/L，1.75mL)与此0(240血） 混合，80°C下揽拌30min。逐滴加入正娃酸乙醋(TE0S，2.5mL)，充分揽拌lOmin后形成白色沉 淀。80°C下揽拌化，趁热过滤，用水和甲醇充分清洗产物，90°C下真空干燥。
[0036] 称取0.3g干燥固体，超声分散于异丙醇(60mL)和浓盐酸(3mL)的混合溶液，加热回 流化，离屯、分离，用水和甲醇充分清洗，90°C下真空干燥得到介孔二氧化娃微球(MCM-41)。
[0037] 2.介孔二氧化娃的表面修饰
[003引将干燥后的MCM-41(200mg)超声分散在无水甲苯（lOmL)中，逐滴加入3-氨丙基Ξ 乙氧基硅烷（100化），加热回流，揽拌反应2地，反应结束后固体粉末通过离屯、收集并用无水 甲苯和甲醇清洗若干遍。60°C真空干燥过夜得白色粉末MS化-1。
[0039] 取MSNs-l(180mg)分散在二甲亚讽（lOmL)，加入下二酸酢（0.08g)，Ξ乙胺 (0.08g)，在35°C条件下反应48小时，反应结束后固体粉末通过离屯、收集并用乙醇和甲醇各 洗1次，干燥过夜得白色粉末MS化-2。
[0040] 取MSNs-2(100mg)分散于二甲基亚讽(90mL)加入2-(2-丙烘氧基）乙醇（0.184邑）， N，N-二异丙基碳二亚胺(0.24g)，4-二甲氨基化晚(0.24g)，在35°C条件下反应24小时，反应 结束后固体粉末通过离屯、收集并用二甲基亚讽和水各洗两遍，干燥过夜得白色粉末MSNs- 3。
[0041] 3.介孔二氧化娃中药物分子的吸附
[0042] 取MSNs-3(30mg)分散在水(4mL)中，加入50mg罗丹明B，在常溫下揽拌72小时。
[0043] 4.组装智能纳米容器
[0044] 取屯-(6-脱氧-6-叠氮基)-β-环糊精（25mg)分散在N，N-二甲基甲酯胺（2mL)中，加 入罗丹明B(30mg)，无水硫酸铜（130mg)，抗坏血酸钢(201.5mg)，将上述溶液加到上步吸附 的溶液中，常溫下揽拌72小时，反应结束后固体粉末通过离屯、收集并用水洗到基本无色，得 到上述一种酶刺激响应型智能纳米容器MSNPs 1。
[0045] 5.智能纳米容器的可控性释放
[0046] 在石英比色皿中加入pH=7.4的憐酸盐缓冲溶液3.8mL，称取2.0mg MSNPs 1置于 折成锥形的已活化的半透膜中，将半透膜尖端朝下放入比色皿中，确保所有MSNPs 1都浸于 缓冲溶液液面W下，加入脂肪酶（Img/mL)，利用巧光分光光度计测其动力学变化化M = 572nm EX = 553nm)，如附图3所示，释放量达到40.3ymol/g。
[0047] 实施例2
[004引本发明一种酶刺激响应型智能纳米容器的制备方法，步骤如下：
[0049] 1.制备介孔二氧化娃微球MCM-41
[(K)加]同实施例1步骤1方法制备。
[0051] 2.介孔二氧化娃的表面修饰
[0052] 将干燥后的MCM-41(240mg)超声分散在无水甲苯（lOmL)中，逐滴加入3-氨丙基Ξ 乙氧基硅烷（100化），加热回流，揽拌反应2地，反应结束后固体粉末通过离屯、收集并用无水 甲苯和甲醇清洗若干遍。60°C真空干燥过夜得白色粉末MS化-1。
[005；3] 取MSNs-l(180mg)分散在二甲亚讽（lOmL)，加入下二酸酢（0.08g)，Ξ乙胺 (0.08g)，在40°C条件下反应48小时，反应结束后固体粉末通过离屯、收集并用乙醇和甲醇各 洗1次，干燥过夜得白色粉末MS化-2。
[0054] 取MSNs-2(100mg)分散于二甲基亚讽(90mL)加入2-(2-丙烘氧基）乙醇（0.184邑）， N，N-二异丙基碳二亚胺(0.24g)，4-二甲氨基化晚(0.24g)，在40°C条件下反应24小时，反应 结束后固体粉末通过离屯、收集并用二甲基亚讽和水各洗两遍，干燥过夜得白色粉末MSNs- 3。
[0055] 3.介孔二氧化娃中药物分子的吸附
[0056] 取MSNs-3(30mg)分散在水(4mL)中，加入50mg罗丹明B，在常溫下揽拌72小时。
[0057] 4.组装智能纳米容器
[005引取屯-(6-脱氧-6-叠氮基)-β-环糊精（25mg)分散在N，N-二甲基甲酯胺（2mL)中，加 入罗丹明B(30mg)，无水硫酸铜（130mg)，抗坏血酸钢(201.5mg)，将上述溶液加到上步吸附 的溶液中，常溫下揽拌72小时，反应结束后固体粉末通过离屯、收集并用水洗到基本无色，得 到上述一种酶刺激响应型智能纳米容器MSNPs 1。
[0059] 5.智能纳米容器的可控性释放
[0060] 在石英比色皿中加入pH=7.4的憐酸盐缓冲溶液3.8mL，称取2.0mg MSNPs 1置于 折成锥形的已活化的半透膜中，将半透膜尖端朝下放入比色皿中，确保所有MSNPs 1都浸于 缓冲溶液液面W下，加入脂肪酶（Img/mL)，利用巧光分光光度计测其动力学变化化M = 572nm EX = 553nm)，释放量达到40.5ymol/g。
[0061] 实施例3
[0062] 本发明一种酶刺激响应型智能纳米容器的制备方法，步骤如下：
[0063] 1.制备介孔二氧化娃微球MCM-41
[0064] 同实施例1步骤1方法制备。
[00化]2.介孔二氧化娃的表面修饰
[0066] 将干燥后的MCM-41(200mg)超声分散在无水甲苯（lOmL)中，逐滴加入3-氨丙基Ξ 乙氧基硅烷（100化），加热回流，揽拌反应36h，反应结束后固体粉末通过离屯、收集并用无水 甲苯和甲醇清洗若干遍。60°C真空干燥过夜得白色粉末MS化-1。
[0067] 取MSNs-l(180mg)分散在二甲亚讽（lOmL)，加入下二酸酢（0.08g)，Ξ乙胺 (0.08g)，在45°C条件下反应60小时，反应结束后固体粉末通过离屯、收集并用乙醇和甲醇各 洗1次，干燥过夜得白色粉末MS化-2。
[0068] 取MSNs-2(100mg)分散于二甲基亚讽(90mL)加入2-(2-丙烘氧基）乙醇（0.184邑）， N，N-二异丙基碳二亚胺(0.24g)，4-二甲氨基化晚(0.24g)，在45°C条件下反应36小时，反应 结束后固体粉末通过离屯、收集并用二甲基亚讽和水各洗两遍，干燥过夜得白色粉末MSNs- 3。
[0069] 3.介孔二氧化娃中药物分子的吸附
[0070] 取MSNs-3(30mg)分散在水(4mL)中，加入盐酸多柔比星(D0X)(50mg)，在常溫下揽 拌84小时。
[0071] 4.组装智能纳米容器
[0072] 取屯-(6-脱氧-6-叠氮基)-β-环糊精（25mg)分散在N，N-二甲基甲酯胺（2mL)中，加 入多盐酸柔比星(D0X)(30mg)，无水硫酸铜（130mg)，抗坏血酸钢(201.5mg)，将上述溶液加 到上步吸附的溶液中，常溫下揽拌84小时，反应结束后固体粉末通过离屯、收集并用水洗到 基本无色，得到上述一种酶刺激响应型智能纳米容器MSNPs 2。
[0073] 5.智能纳米容器的可控性释放
[0074] 在石英比色皿中加入pH=7.4的憐酸盐缓冲溶液3.8mL，称取2.Omg MSNPs 2置于 折成锥形的已活化的半透膜中，将半透膜尖端朝下放入比色皿中，确保所有MSNPs 2都浸于 缓冲溶液液面W下，加入脂肪酶（Img/mL)，利用巧光分光光度计测其动力学变化化M = 480nm EX = 420nm)，如附图4所示，释放量达到37.祉mol/g。
【主权项】
1. 一种酶刺激响应型智能纳米容器的制备方法，其特征在于，具体步骤如下： 步骤1，制备介孔二氧化娃微球； 步骤2,将介孔二氧化硅微球超声分散在无水甲苯中，逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷 后加热回流，氮气保护，搅拌进行无水无氧缩醇反应，得到产物MSNs-I; 步骤3,将MSNs-I分散在二甲基亚砜中，然后加入丁二酸酐和三乙胺，于35°C~45°C下 反应48~60小时，反应产物先后用乙醇和甲醇清洗后烘干即得产物MSNs-2; 步骤4，将MSNs-2与2-( 2-丙炔氧基）乙醇、N，N-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶在 二甲基亚砜中混合，于35°C~45°C下反应24~36小时，反应产物先后用二甲基亚砜和水清 洗后烘干； 步骤5,将步骤4得到的产物加入到吸附分子的饱和水溶液中，室温下吸附72~84小时； 步骤6,将含有七-(6-脱氧-6-叠氮基)-β-环糊精、无水硫酸铜和抗坏血酸钠的N，N-二 甲基甲酰胺溶液加入到步骤5中的吸附溶液中，反应72~84小时，产物用水洗后即得酶刺激 响应型智能纳米容器。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述的介孔二氧化硅微球优 选为 MCM-41。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述的介孔二氧化硅微球与 3_氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为1:1~1.2:1。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5中，所述的吸附分子为罗丹明B 或盐酸多柔比星。5. 根据权利要求1至4任一所述的制备方法制得的酶刺激响应型智能纳米容器。
【文档编号】A61K31/704GK105920613SQ201610465176
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】傅佳骏, 姜昊, 王婷
【申请人】南京理工大学