一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法和用图
【专利摘要】本发明属于抗菌剂及食品添加剂或者化妆品领域，具体涉及一种酪蛋白?豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备及应用。本发明通过将豆蔻精油包裹在酪蛋白脂质体中，以实现减少豆蔻精油在施用过程中的挥发，从而减少豆蔻精油的浪费，提高其利用率，达到长效抗菌与高效利用的目的。
【专利说明】
-种酪蛋白-豆憲精油脂质体抗菌剂的制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于抗菌剂及食品添加剂或者化妆品领域，具体设及一种酪蛋白-豆違精 油脂质体抗菌剂的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 豆違，多年生常绿草本植物，是姜科植物，产出暖性精油。精油无色或黄色，甜而溫 暖，主要成分是松油醇，按油醇，姜締和巧樣締。肉豆違含挥发油、脂肪油、苯丙素、木脂素和 黄酬等多种化学成分，具有抗菌消炎、镇痛、止泻、抗肿瘤等广泛的药理作用。豆違精油有良 好的抗炎，镇痛，抑菌作用，对各种食源性病原菌有较好的抗菌效果，且安全、无毒副作用， 在肉制品加工中应用广泛，可去异味，抑细菌，增辛香。
[0003] 国内有很多关于豆違在医学应用的专利申请。CN103893226A公开了肉豆違提取物 在制备抗痛风的药物、食品或保健品的应用。CN102988333A公开了豆違明在制备防治肠炎 的药物或食品中的应用。CN102036662A公开了一种利用肉豆違衣木脂素预防和治疗ppAR介 导的疾病的方法。CN103719464A发明了一种肉豆違脾胃虚弱保健茶。CN1709467A公开了一 种复方草豆違滴丸及其制备方法。CN101508937A公开了一种超临界二氧化碳提取肉豆違精 油的方法，可W获得高品质的肉豆寇精油产品。CN103638074A公开了一种肉豆寇挥发油在 制备治疗抑郁症药物中的应用。
[0004] 虽然豆違精油在医学，食品和化妆品行业被广泛应用，具有较好的杀菌、增香等特 点，但是豆違精油易挥发，暴露在空气中不稳定，所W要寻找有效的方法降低肉桂精油在使 用过程中的挥发程度，延长其胆存期。
[0005] 纳米脂质体能将精油包裹在内，并且纳米脂质体不会对豆違精油的主要活性成分 造成破坏。纳米脂质体使豆違精油中的活性成分与外界环境隔绝开来，可W降低豆違精油 的挥发性，延长保存期。但由于脂质体的缓释作用，包裹精油的脂质体保质期有限。因此，选 用酪蛋白制成稳定性更高的酪蛋白脂质体。此外，纳米脂质体由于它们的亚细胞尺寸，能加 强脂质体的被动吸收机制，减少物质运输阻力，从而增强精油的抗菌效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是公开一种酪蛋白-豆違精油脂质体的制备方法及其用途，通过将 豆違精油包裹在酪蛋白脂质体中，W实现减少豆違精油在施用过程中的挥发，从而减少豆 違精油的浪费，提高其利用率，达到长效抗菌与高效利用的目的。本发明由豆違精油，大豆 卵憐脂，胆固醇和表面活性剂，酪蛋白制成酪蛋白-豆違精油脂质体。
[0007] 本发明的制备方法是将豆違精油，大豆卵憐脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸发 形成光滑的薄膜，加入水相介质溶解膜状物并超声成乳液，通过离屯、和微孔滤膜过滤，得到 粒径为纳米级的豆違精油脂质体，其特征在于:将纳米级的豆違精油脂质体与酪蛋白和表 面活性剂的溶液混合，揽拌均匀，通过低溫冷冻缓慢融化的方法使酪蛋白镶嵌在脂质体上， 通过溫和超声使脂质体闭合，最终形成包裹豆違精油的酪蛋白脂质体。
[0008] 本发明的大豆卵憐脂和胆固醇的质量比为5:1;用于制备精油脂质体的乳液含有 豆違精油的浓度为4.0mg/mL表面活性剂为十二烷基聚乙二醇酸(Brij-35)，得到包裹豆違 精油的酪蛋白脂质体后其最终浓度为l.Omg/mL。
[0009] 本发明中所述的有机溶剂为氯仿。
[0010] 本发明中所用的水相介质是根据中国药典2000版标准配制的憐酸盐缓冲溶液，pH 值6.5~7.4,优选7.2。
[0011] 所述的酪蛋白和表面活性剂的溶液是将酪蛋白分散在化ij-35的憐酸盐缓冲液中 得到的，Br i j-35浓度为1 Omg/mL，分散后溶液中酪蛋白浓度为1. Omg/mL。
[0012] 本发明中脂质体上镶嵌的蛋白为酪蛋白，豆違精油脂质体与酪蛋白和表面活性剂 的溶液W体积比10:1混合，混合后溶液中酪蛋白浓度为0.1 mg/mL，Bri j-35浓度为1.Omg/ rnL 〇
[0013] 本发明中低溫冷冻缓慢融化是指将混合液在-18°C下冷冻化，随后在0°C下缓慢融 化化。
[0014] 本发明中溫和超声是指在低功率50W条件下超声化，溫度范围0-10°C。
【附图说明】
[001引图1酪蛋白-豆違精油脂质体的包封率。
[0016] 图2酪蛋白-豆違精油脂质体的粒径与多分散系数(PDI)。
[0017] 图3酪蛋白-豆違精油脂质体对大肠杆菌的抗菌效果。
[0018] 图4酪蛋白-豆違精油脂质体对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。
[0019]表1酪蛋白-豆違精油脂质体的Ze化电位。
【具体实施方式】
[0020] 通过下面实例说明本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护内容，不仅局限于此
[0021] 实施例1酪蛋白-豆違精油脂质体的包封率
[0022] 1实验材料 大豆卵憐脂 B及 国药集团化学试剂有限公司 胆固醇 A民 国药集团化学试剂有限公司 S氯甲烧 AR 国熟集团化学试剂有限公司
[0023] 豆寇精油 AR 法国Florihana精她 Brij-35 GR 国药集团化学试剂有限公司 酿蛋白 CP 国药集团化学试剂有限公司
[0024] 2实验方法
[0025] 1)豆違精油脂质体的制备
[00%]①称取Ig大豆卵憐脂，0.?胆固醇和200mg的豆違精油，加入50mL氯仿使其溶解。 [0027]②在旋转蒸发仪中蒸发至溶剂蒸干，蒸发溫度为10~30°C，圆底烧瓶内壁会形成 光滑的薄膜;然后将所得产品放入真空干燥箱中，30°C，真空状态下干燥2地。
[00%]③加入50mL的憐酸盐缓冲液到圆底烧瓶中进行水化，水化超声波功率为lOOW，超 声时间为化。
[0029] ④将所得混合液于细胞超微粉碎仪中W功率360W，工作10s间隙5s，粉碎30min。
[0030] ⑤将所得产品进行离屯、，400化pm，15min，取上层液体。
[0031 ]⑥将所得液体用0.22WI1滤膜进行过滤，得滤液。
[0032] 2)酪蛋白-豆違精油脂质体的制备
[0033] ①按照上述豆違精油脂质体的制备方法，制备豆違精油浓度为4mg/mL的豆違精油 脂质体。
[0034] ②将酪蛋白超声分散在含lOmg/mL Brij-35的憐酸盐缓冲液中，最终形成酪蛋 白一 Br i j-35溶液，其中酪蛋白浓度为1. Omg/mL。
[0035] ③在50mL豆違精油脂质体中添加5mL Img/mL的酪蛋白一化ij-35溶液，混合均匀。
[0036] ④将所得混合液于超声条件下扩散lOmin。
[0037] ⑤将所得混合液在-18 °C下冷冻化。
[0038] ⑥将所得混合液在(TC下缓慢融化化。
[0039] ⑦通过溫和超声（功率50W，化，KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司）使脂质体闭 合，所得溶液即为酪蛋白-豆違精油脂质体。
[0040] 3)包封率的测定
[0041] 用无水乙醇稀释豆違精油，逐级稀释成浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/血的 标准溶液。然后，分别吸取化L标准溶液进行GC-MS分析，对其主要成分的谱峰面积进行自动 积分，绘制主成分峰面积-豆違精油浓度标准曲线。取ImL酪蛋白-豆違精油脂质体样品， 13500巧m，离屯、化，倒掉上清液。接着加入ImL乙醇破乳剂，超声化。最后W100 (K)rpm的转速 离屯、15min，取上清液，用于GC-MS分析。制备好的脂质体样品，对精油主成分的峰面进行自 动积分，再根据绘制的标准曲线，计算出脂质体中豆違精油的含量。则：
[0042]
[0043] 3酪蛋白-豆違精油脂质体的包封率
[0044] 包封率是评价脂质体制剂质量好坏的最重要的指标，也是脂质体能否发挥较普通 制剂高效、低毒等特点的关键。由图1可看出，豆違精油脂质体的包封率为41.21%，酪蛋白- 豆違精油脂质体的包封率为78.62%。因此制备酪蛋白-豆違精油脂质体可W明显提高脂质 体的包封率。
[0045] 实施例2酪蛋白-豆違精油脂质体的粒径与多分散系数(PDI)
[0046] 1实验材料
[0047] ①空白脂质体 [004引②豆違精油脂质体 [0049]③酪蛋白-豆違精油脂质体 [(K)加]2实验方法
[0051] 用美国布鲁克海文仪器公司产的，型号为BI-9000的高浓度激光粒度仪测定酪蛋 白-豆違精油脂质体的粒径和多分散系数(PDI)值，所测样品放入样品池直接测量即可。
[0052] 3酪蛋白-豆違精油脂质体的粒径与多分散系数(PDI)
[0053] 多分散系数(PDI)直接反映酪蛋白-豆違精油脂质体的稳定性，因此是主要参考指 标，脂质体的PDI在0~0.3范围内属于最好，在0.3~0.7范围内较差，但可W接受，当PDI〉 0.別寸，不予考虑。如图2所示，空白脂质体的粒径为86.4nm、PDI为0.353,豆違精油脂质体的 粒径为160.7皿、PDI为0.217，酪蛋白-豆違精油脂质体的粒径为601.5皿、PDI为0.019。酪蛋 白-豆違精油脂质体的多分散系数(PDI)最小，因此制备酪蛋白-豆違精油脂质体可W明显 提高脂质体的稳定性。
[0054] 实施例3酪蛋白-豆違精油脂质体的Zeta电位 [0化日]1实验材料
[0056] ①空白脂质体
[0057] ②豆違精油脂质体
[0058] ③酪蛋白-豆違精油脂质体
[0化9] 2实验方法
[0060] 用英国马尔文仪器有限公司生产的型号为Zetasirer nano ZSZeta的电位仪测 量，直接将待测脂质体样品放入电位仪中测量即可。
[0061] 3酪蛋白-豆違精油脂质体的Ze化电位
[0062] 表1酪蛋白-豆違精油脂质体的Zeta电位
[0063]
[0064] Zeta电位也可W直接反映酪蛋白-豆違精油脂质体的稳定性，因此也是主要参考 指标，脂质体的Zeta电位的绝对值越大说明脂质体越稳定性，Zeta电位的绝对值在0~30范 围内属于不稳定，在大于30时脂质体较稳定性。如表1所示，Ξ种脂质体均带负电，空白脂质 体的Zeta电位为-22.8mV，其绝对值小于30，脂质体不稳定;豆違精油脂质体的Zeta电位为- 21. ImV，其绝对值小于30脂质体，不稳定;酪蛋白-豆違精油脂质体的Zeta电位为-38.2mV， 其绝对值大于30且最大，脂质体最稳定。
[0065] 实施例4酪蛋白-豆違精油脂质体的抗菌性能
[0066] 1实验材料
[0067] ①豆違精油脂质体(保存7天、30天、60天、90天）
[006引②酪蛋白-豆違精油脂质体(保存7天、30天、60天、90天）
[0069] 2实验方法
[0070] 采用平板菌落计数法，W大肠杆菌化scherichia coli)和金黄色葡萄球菌 (51曰地如〇(3〇(3(3118 aureus)为模式菌种测定酪蛋白-豆違精油脂质体的残存菌数。将大肠杆 菌和金黄色葡萄球菌接种到液体培养基中，分别置于空气摇床中在37°C、150rpm的条件下 震荡培养24~4她，获得对数生长期的菌悬液。取适量处于对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄 球菌分别加入含有一定量无菌憐酸盐缓冲液的试管中（细菌浓度约为1〇5~106CFU/mL)，然 后再向试管中加入浓度为20%(v/v)的豆違精油脂质体及酪蛋白-豆違精油脂质体。同时另 取两个分别含有w上两种菌的试管并向其中加入等量无菌水(不加脂质体)作为对照。将各 试管均置于空气摇床中在37°C、150rpm的条件下震荡反应2地。分别于不同时间点的取适量 培养液进行十倍梯度稀释到合适的浓度，然后移取10化L稀释液滴到无菌固体平板培养基 上，涂布均匀之后放入37Γ恒溫恒湿培养箱中倒置培养。24~4她后进行平板菌落计数，从 而对豆違精油脂质体和酪蛋白-豆違精油脂质体的抗菌活性进行评价。实验重复Ξ次，结果 取平均值。
[0071] 3酪蛋白-豆違精油脂质体的抗菌性能
[0072] 不同保存期的酪蛋白-豆違精油脂质体的抗菌活性的变化也可W间接反映脂质体 的稳定性。因此对保存7天、30天、60天、90天的豆違精油脂质体及酪蛋白-豆違精油脂质体 进行了抗菌性能评价，结果如图3、图4所示。保存时间为7天时，豆違精油脂质体与酪蛋白- 豆違精油脂质体的抗菌活性相近，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均显示了良好的抗菌效 果。保存时间为30天时，豆違精油脂质体的抗菌效果明显降低，而酪蛋白-豆違精油脂质体 仍然显示出良好的抗菌效果。保存时间为60天和90天时，豆違精油脂质体几乎没有显示抗 菌效果，而酪蛋白-豆違精油脂质体仍然保持良好的抗菌效果。
【主权项】
1. 一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法，将豆蔻精油，大豆卵磷脂，胆固醇 混合于有机溶剂，减压蒸发形成光滑的薄膜，加入水相介质溶解膜状物并超声成乳液，通过 离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的豆蔻精油脂质体，其特征在于:将纳米级的豆蔻 精油脂质体与酪蛋白和表面活性剂的溶液混合，搅拌均匀，通过低温冷冻缓慢融化的方法 使酪蛋白镶嵌在脂质体上，通过温和超声使脂质体闭合，最终形成包裹豆蔻精油的酪蛋白 脂质体。2. 如权利要求1所述的一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法，其特征在于： 大豆卵磷脂和胆固醇的质量比为5:1;用于制备精油脂质体的乳液含有豆蔻精油的浓度为 4.0mg/mL;表面活性剂为十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35)，得到包裹豆蔻精油的酪蛋白脂质 体后其最终浓度为1 .Omg/mL。3. 如权利要求1所述的一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法，其特征在于： 所述的有机溶剂为氯仿。4. 如权利要求1所述的一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法，其特征在于： 所用的水相介质是根据中国药典2000版标准配制的磷酸盐缓冲溶液，pH值6.5~7.4,优选 7.2。5. 如权利要求1所述的一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法，其特征在于： 所述的酪蛋白和表面活性剂的溶液是将酪蛋白分散在Brij-35的磷酸盐缓冲液中得到的， Br i j-35浓度为1 Omg/mL，分散后溶液中酪蛋白浓度为1. Omg/mL。6. 如权利要求1所述的一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法，其特征在于： 脂质体上镶嵌的蛋白为酪蛋白，豆蔻精油脂质体与酪蛋白和表面活性剂的溶液以体积比 10:1混合，混合后溶液中酪蛋白浓度为0. lmg/mL，Bri j-35浓度为1 .Omg/mL。7. 如权利要求1所述的一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法，其特征在于： 低温冷冻缓慢融化是指将混合液在_18°C下冷冻2h，随后在0°C下缓慢融化2h。8. 如权利要求1所述的一种酪蛋白-豆蔻精油脂质体抗菌剂的制备方法，其特征在于： 温和超声是指在低功率50W条件下超声2h，温度范围0-10°C。
【文档编号】A61K47/42GK105999039SQ201610521758
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】崔海英, 李伟, 林琳
【申请人】江苏大学