一类ahr激活剂的应用方法
【专利摘要】本发明公开了一类AHR激活剂的应用方法。所述的AHR激活剂包括：钩吻总碱，indolo[3,2-b]carbazole(ICZ)和虾青素中的一种或几种，用于制备减少沙门氏菌对动物组织细胞侵染制剂，可有效减少其对人和动物健康的危害。
【专利说明】
一类AHR激活剂的应用方法
技术领域
[0001]本发明涉及一类可活化AHR受体从而减少沙门氏杆菌对机体侵染的活性物质的应用方法，属于微生物领域。
【背景技术】
[0002]沙门氏菌(salmonella)属的成员可感染多种动物和人，大部分具有很强的致病性。由沙门氏菌所致人和多种动物沙门氏菌病历史悠久(1885)，遍布世界各地。沙门氏菌血清型有2500个以上，其中许多血清型菌能在人和动物之间交叉感染。沙门氏菌感染因其对人类、畜禽饲养业造成的危害，而被广泛重视。
[0003]沙门氏菌在进入机体后有其独特的感染途径，细菌能通过自身分泌的毒力蛋白联合宿主细胞因子破坏小肠上皮细胞的细胞屏障，侵袭小肠上皮细胞并在细胞内存活、繁殖。致病性沙门氏菌在与宿主的长期相互作用中进化形成了一种复杂的致病机制，既能存活于胃内的酸性环境中，又能侵袭小肠微皱褶细胞和肠上皮细胞。在肠道黏膜表面派伊尔氏结(PP)上的滤泡上皮细胞，被认为是沙门氏菌入侵的最佳起始部位。滤泡上皮中稀疏分布着捕获抗原的微皱褶细胞(micro fo Id cell，M细胞)，M细胞被肠上皮细胞所包围。M细胞的基顶面有短而不规则的微绒毛及微褶，是其胞饮的部位。沙门氏菌具有2个侵袭途径:一个是通过PP上M细胞进入上皮下组织；另一个是直接侵袭M细胞进入上皮下组织，而且侵袭是通过细胞的基顶面来进行的。当沙门氏菌黏附到M细胞或上皮细胞顶部后，利用III型分泌系统将效应蛋白分泌到胞外并易位于宿主细胞，从而诱导宿主细胞肌动蛋白细胞骨架的重排。这时细胞质形成一个向外突起将细菌包裹在细胞膜内，以细胞摄粒的作用进入细胞。沙门氏菌侵袭非吞嚼细胞后，可以在细胞内形成一个包裹细菌的膜性小泡，称为SCV (Salwone] IcT-conlaimng vacuoles)，这种特殊结构不仅有利于细菌存活，而且可以有效地逃避宿主的免疫应答(Miao，Brittnacher et al.2003)。此外，该菌也可以在巨嚼细胞中生长、繁殖。Vazquez、Tones等学者研究发现，沙门氏菌可以通过⑶8+巨噬细胞的吞嚼作用播散，进而感染肠外组织器宫。因此，沙门氏菌侵入小肠粘膜上皮细胞，穿过上皮细胞层到达上皮下组织后，细菌虽被细胞吞噬，但不并被杀灭，并在其中继续生长繁殖进而感染其他组织器官。因此减少沙门氏菌对组织器官的侵染，可有效减少其对人和动物健康的危害。
[0004]芳香经受体(aryl hydrocarbon receptor, AhR)是配体激活的核转录因子，属于螺旋-环-螺旋(helixloop-helix, HLH)超家族中的 bHLH-PAS (Per1d-Aryl hydrocarbonreceptor nuclear translocator-single Minded, Pre-Arnt-Sim)亚家方矣成员。既往 30 多年对芳香烃受体的研究重点，大多放在了其介导的芳香烃类化合物的毒性反应上。但是AhR是一种比较古老的蛋白质，4.5亿年前的生物体中就有AhR表达，并且在海洋、淡水和陆地等各种环境中进化的物种之间存在功能上的直系同源性;AhR在各个组织及生物体发育的不同时期都有表达，提示AhR在脊椎动物发生及发育过程中是不可缺少的，而且提示生物体内应该存在某种AhR的内源性配体，但至今未找到。而最近的研究发现，芳香烃受体同时还参与机体其他重要的生物学过程，而我们所关注的是AHR受体激活后对沙门氏菌侵染的影响，并利用现有技术寻找一类可活化AHR受体从而减少沙门氏杆菌对机体侵染的活性物质，重点关注的天然活性产物。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一类激活AHR受体在制备减少沙门氏菌对组织细胞侵染制剂上的应用方法。
[0006]—类AHR激活剂的应用方法，用于制备减少沙门氏菌对动物组织细胞侵染制剂，所述的AHR激活剂包括:钩吻总碱，indolo[3，2_b]carbinol吲哚[3，2-b]咔唑(ICZ)和虾青素中的一种或几种。优选钩吻总碱，ICZ中的一种或两种。
[0007]所述的减少沙门氏菌对动物组织细胞侵染制剂还含有能负载AHR激活剂的载体。
[0008]所述的减少沙门氏菌对动物组织细胞侵染制剂还含有抗生素。
[0009]所述抗生素包括:内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、大环内脂类、喹诺酮类、.多肽类、酰胺醇类、林可酰胺类、磺胺类、甲氧苄啶类、奎诺酮类和硝基咪唑类的一种或几种。
[0010]本发明采用Hepalclc7细胞(具备完整的AHR受体及其核转位子ARNT)来进行AHR受体激活剂的筛选，初步筛选的AHR受体激活剂有:钩吻总碱，indolo[3, 2-b]carbinol (ICZ)和4下青素。优选钩吻总碱、indolo [3，2_b] carbazole (ICZ)。这类活性物质减少沙门氏杆菌侵染机制可能与AHR受体激活后所产生的一定量活性氧有关。
[0011]本发明的减少沙门氏菌对动物组织细胞侵染制剂还含有不影响使用功能且能负载AHR激活剂的载体。还可含有抗生素，所述抗生素可以为内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、大环内脂类、喹诺酮类、.多肽类、酰胺醇类、林可酰胺类、磺胺类、甲氧苄啶类、奎诺酮类和硝基咪唑类的一种或几种，从而提高其作用效果。
[0012]本发明以保健品或药品的形式应用于人或动物。
【附图说明】
[0013]图1为钩吻总碱、ICZ和虾青素对!fepalClC7细胞AHR受体的激活作用；
[0014]图2为ICZ对沙门氏菌侵染!fepalClC7细胞的影响；
[0015]图3为钩吻总碱与抗生素合用对沙门氏菌侵染Hepalclc7细胞的影响。
【具体实施方式】
[0016]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0017]实施例1
[0018]取对数生长期的Hepalclc7细胞接种于48孔培养板中，每孔含I X 15个细胞，每组6个平行样，细胞生长覆盖培养板底部大于90%，则分别加入钩吻总碱(1.25 μ g/ml)，ICZ(1ym)和虾青素(2 μ g/ml)。其中钩吻总碱购自西安天瑞生物技术公司，ICZ购自sigma公司，4下青素购自长沙绿叶生物技术公司。作用24h之后，移去培养板中旧的培养基，磷酸缓冲液(PBS)润洗2次，每孔加入150 μ I底物反应混合液(每Iml反应底物中含有DHank’s 980 μ 1，lmmol/L双香?素10 μ I和0.8mmol/L的7_乙氧基试齒灵10 μ I)，轻摇混匀后，置于37°C，5% CO2条件下孵育过夜。使用酶标仪，在激发波长530nm、发射波长590nm的条件下检测荧光强度，其荧光强度与AHR活化程度成正比。通过本试验来进行AHR受体激活剂的筛选。
[0019]由图1可以看出钩吻总碱、ICZ和虾青素能够极为显著地激活Hepalclc7细胞的AHR 受体(P〈0.01)。
[0020]实施例2
[0021]沙门氏菌准备:将LB固体培养基上分离培养获得的单个沙门氏菌菌落，接种到5ml液体LB培养基中，37°C，225r/min震荡培养过夜后，取10 μ I含有沙门氏菌的液体LB培养基接种到5ml液体LB培养基中，37°C过夜，使得沙门氏杆菌达到指数生长期。
[0022]沙门氏杆菌侵染实验，将!fepalClC7细胞接种于24孔细胞培养板，每孔含5 X 14个细胞，每组3个平行样，细胞生长覆盖培养板底部大于90%后，分为3个药物处理组进行实验，分别是对照组，ICZ组(10 μ M)和ICZ(10 μ M) +a -NF(10 μ M，AHR受体抑制剂)组，处理24小时。将之前准备的沙门氏菌1000r/min，离心lOmin，弃去上清，用5ml的DMEM培养液(不含青/链霉素)重新悬浮细菌。每孔接种100 μ I含沙门氏菌的DMEM培养基，并将培养板800r/min，离心lOmin，从而将细菌沉淀至培养板底充分与Hepalclc7细胞接触。在37°C,5% CO2细胞培养箱中孵育60min。60min后移去培养基，用PBS洗涤2遍，每孔加入Iml含有100 μ g/ml Gentamicin，在37°C，5% CO2细胞培养箱中孵育120min以除去未侵染进细胞内的沙门氏菌。用PBS洗涤3遍后，每孔加入200ul I % Triton X-100，在37°C的孵箱中裂解5min，再于每孔加入800 μ I PBS充分混匀。再将获得的裂解液稀释I X 13后，取100 μ I接种于固体LB培养基，培养过夜后计数。
[0023]由图1可以看出AHR受体激活剂ICZ和虾青素能够显著地减少沙门氏菌对Hepalclc7细胞的侵染(P〈0.01)，而加入AHR受体抑制剂a-NF后则抑制了 ICZ的作用，细菌侵染显著增加，说明ICZ对细菌侵染的抑制作用有部分是通过激活AHR受体来实现的。
[0024]实施例3
[0025]本实施例中，我们关注的是钩吻总碱与抗生素合用对沙门氏菌侵染Hepalclc7细胞的影响。实验分为5组，分别为对照组，抗生素组(1%的青/链霉素)，钩吻总碱组(1.25 μ g/ml)，钩吻总碱(1.25 μ g/ml) +抗生素(1%的青/链霉素)组和钩吻总碱(1.25 μ g/ml)+ a-NF (10 μ Μ, AHR受体抑制剂)组。沙门氏菌准备和沙门氏菌侵染实验同实施例2。
[0026]由图3可以看出，添加抗生素能在一定程度上减少沙门氏菌对H印alclc7细胞的侵染，与对照组比较差异显著(P〈0.05)。而AHR受体激活剂钩吻总碱与对照组和抗生素组比较均能够极显著的减少沙门氏菌的侵染(P〈0.01)。钩吻总碱与抗生素联合使用的效果与抗生素组和钩吻总碱组比较均能够显著减少沙门氏菌的侵染(P〈0.05)，表明AHR受体激活剂钩吻总碱与抗生素合用的效果要好于单独使用抗生素或钩吻总碱；而加入AHR受体抑制剂a-NF后则抑制了钩吻总碱的作用，细菌侵染显著增加，说明钩吻总碱对细菌侵染的抑制作用有部分是通过激活AHR受体来实现的。
【主权项】
1.一类AHR激活剂的应用方法，其特征在于，用于制备减少沙门氏菌对动物组织细胞侵染制剂，所述的AHR激活剂包括:钩吻总碱，吲哚[3，2-b]咔唑和虾青素中的一种或几种。2.根据权利要求1所述的AHR激活剂的应用方法，其特征在于，所述的AHR激活剂包括:钩吻总碱，吲哚[3，2-b]咔唑中的一种或两种。3.根据权利要求1所述的AHR激活剂的应用方法，其特征在于，所述的减少沙门氏菌对动物组织细胞侵染制剂还含有能负载AHR激活剂的载体。4.根据权利要求1或3所述的AHR激活剂的应用方法，其特征在于，所述的减少沙门氏菌对动物组织细胞侵染制剂还含有抗生素。5.根据权利要求4所述的AHR激活剂的应用方法，其特征在于，所述抗生素包括: 内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、大环内脂类、喹诺酮类、.多肽类、酰胺醇类、林可酰胺类、磺胺类、甲氧苄啶类、奎诺酮类和硝基咪唑类的一种或几种。
【文档编号】A61K36/56GK106063814SQ201510404744
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2015年7月10日 公开号201510404744.4, CN 106063814 A, CN 106063814A, CN 201510404744, CN-A-106063814, CN106063814 A, CN106063814A, CN201510404744, CN201510404744.4
【发明人】田亚南, 邬静, 柯穗
【申请人】湖南农业大学