丹酚酸a在制备治疗急性肾损伤药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种丹酚酸A在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，属于中药有效成分的用途技术领域。本发明通过药效学实验证明，丹酚酸A可有效减轻肾小管坏死和肾小管微血管内皮细胞损伤，增加血管内皮生长因子的表达，抑制微血管密度的减少，改善缺血缺氧程度，从而减轻急性肾损伤大鼠肾脏组织损伤。因此，丹酚酸A可以用作制备治疗急性肾损伤药物，从而开辟了丹酚酸A的新用途。
【专利说明】
丹酚酸A在制备治疗急性肾损伤药物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种丹酚酸A在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，属于中药有效成分的用途技术领域。
【背景技术】
[0002]急性肾损伤(AKI)是临床最常见的急危重症之一。AKI与患者病死率、慢性肾脏疾病(CKD)的发生以及维持性透析率密切相关。据报道，在急危重患者中，AKI的发生率高达25%，死亡率为15-60% ^KI会延长住院时长，增加医疗花费，并且影响长期肾脏功能，已经成为全球公共健康问题[1][2]。在我国，住院成人患者AKI发病率高达11.6%，显著增加住院死亡率[2]。同时，未识别的AKI患者高达74.2%，这也意味着不能及时接受治疗的患者众多。而在AKI患者中，进行肾替代治疗的患者比例(RRT)高达59.3 %[3]。可见，AKI已成为我国巨大的医疗负担。如何有效的预防和治疗AKI成为目前迫切需要解决的问题。
[0003]当前，AKI的治疗方法主要为对症支持疗法和肾替代疗法，尚无任何有效的治疗措施以减轻组织损伤、促进修复和防止慢性纤维化的发生，AKI发生后仍主要依靠肾脏自身的康复[4]。到目前为止，AKI的治疗药物无明显突破。因此，研究AKI时组织损伤和修复机制，寻找治疗靶点以改善AKI预后，已成为当前肾脏病的研究热点。
[0004]AKI时组织损伤和修复涉及多种复杂的机制和效应细胞，包括肾小管上皮细胞损伤调控的免疫炎症反应、肾小管周围微血管(PTC)内皮损伤加重缺血及炎症反应、AKI后持续免疫炎症反应失调导致炎症反应放大，进一步加重肾小管上皮损伤。而在其中，最容易让人忽略，但却非常重要的因素是PTC内皮损伤。微血管内皮结构和功能受损使肾脏微循环血量减少，炎症反应加重。同时，微血管结构破坏导致管周毛细血管网密度减低，微血管密度减低可导致肾小管间质缺氧，加重肾小管上皮细胞损伤，抑制其修复，进而促进肾间质纤维化的发生和发展[4]。因此，能够促进微血管内皮修复或保护微血管内皮、重建微循环的治疗措施对于改善AKI肾脏病变可能会有积极的作用。
[0005]丹酚酸A(SAA)为我国传统活血化瘀中药丹参的主要水溶性活性成分，具有较强的抗炎、抗氧化、抗血小板和抗血栓功能[5]。多项研究证明，丹酚酸A可有效减轻动物大脑和心肌缺血-再灌注损伤，降低组织缺血缺氧程度，改善微循环[5]。在内皮细胞保护方面，丹酚酸A能够减轻游离脂肪酸导致的血管内皮细胞损伤[6]，降低缺氧/复氧损伤的脑部微血管内皮细胞ICAM-1表达从而发挥脑保护作用m。另外，丹酚酸A还有显著的抗肝、肺纤维化的作用[8][9]。基于上述丹酚酸A的药理作用，可推测:对于AKI，丹酚酸A也可能具有一定的减轻肾组织损伤，促进修复和抑制后期肾脏纤维化的作用。目前国内外尚无丹酚酸A治疗AKI方面的报道，进行相关方面的研究，开发对AKI具有积极防治作用的药物具有重大的现实意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种丹酚酸A在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。本发明通过药效学实验证明，丹酚酸A可有效减轻肾小管坏死和肾小管微血管内皮细胞损伤，增加血管内皮生长因子的表达，抑制微血管密度的减少，改善缺血缺氧程度，从而减轻急性肾损伤大鼠肾脏组织损伤。因此，丹酚酸A可以用作制备治疗急性肾损伤药物，从而开辟了丹酚酸A的新用途。
[0007]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:丹酚酸A在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。
[0008]本发明通过药效学实验证明，丹酚酸A可有效减轻肾小管坏死和肾小管微血管内皮细胞损伤，增加血管内皮生长因子的表达，抑制微血管密度的减少，改善缺血缺氧程度，从而减轻急性肾损伤大鼠肾脏组织损伤。因此，丹酚酸A可以用作制备治疗急性肾损伤药物，从而开辟了丹酚酸A的新用途。
[0009]在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0010]进一步，所述丹酚酸A的可药用盐在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。
[0011]进一步，所述治疗急性肾损伤药物为减轻肾小管坏死和血管内皮损伤、增加血管内皮生长因子表达、降低缺氧诱导因子Ict表达改善缺氧环境的药物。
[0012]采用上述进一步的有益效果是:丹酚酸A可有效减轻肾小管坏死和肾小管微血管内皮细胞损伤，增加VEGF的表达，抑制微血管密度的减少，改善缺血缺氧程度，从而减轻急性肾损伤大鼠肾脏组织损伤，这对于促进肾病转归，改善急性肾损伤预后具有重要的临床意义。
[0013]进一步，所述急性肾损伤的原因为缺血、药物、毒素、重大创伤、外科手术中的一种或多种。
[0014]进一步，所述丹酚酸A由以下制备方法得到:以质量浓度为1.0%的丹参多酚酸盐溶液为原料，添加柠檬酸三钠调pH至6.0，于125°(:、0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后，盐酸调PH至2.0-3.0，得到丹酚酸A溶液;将上述丹酚酸A溶液依次过HPD100树脂富集与纯化、CG161树脂分离与纯化、硅胶柱色谱精细纯化，即得到所述丹酚酸A。
[0015]本发明的有益效果是:
[0016]本发明公开了丹酚酸A或其可药用盐在治疗AKI中的应用，明确丹酚酸A可有效减轻肾小管坏死和肾小管微血管内皮细胞损伤，增加VEGF的表达，抑制微血管密度的减少，改善缺血缺氧程度，从而减轻急性肾损伤大鼠肾脏组织损伤，这对于促进肾病转归，改善急性肾损伤预后具有重要的临床意义。
【附图说明】
[0017]图1为本发明的丹酚酸A对大鼠血清肌酐(SCr)含量的影响。
[0018]图中，与假手术组比较，###P〈0.001,与模型组比较，*P〈0.05，***P〈0.001。
[0019 ]图2为本发明的丹酚酸A对大鼠血清(BUN)含量的影响。
[0020]图中，与假手术组比较，###P〈0.001,与模型组比较广P〈0.0l0[0021 ]图3为本发明的丹酚酸A对大鼠尿液IQM-1含量的影响。
[0022]图中，与假手术组相比，##P〈0.01,与模型组相比，*P〈0.05广P〈0.01。
[0023]图4为本发明的丹酚酸A对肾组织病理损伤的影响。
[0024]图5为本发明的丹酚酸A对大鼠肾脏病理损伤评分的影响。
[0025]图中，与假手术组比较，###P〈0.001；与模型组比较广P〈0.01广*P〈0.001。
[0026]图6为本发明的丹酚酸A对大鼠血浆VffF含量的影响。
[0027]图中，与假手术组比较，##P〈0.01,与模型组比较，*P〈0.05广P〈0.01。
[0028]图7为本发明的丹酚酸A对大鼠肾小管周围微血管内皮的影响。
[0029]图8为本发明的丹酚酸A对大鼠肾小管周围微血管密度的影响。
[0030]图9为本发明的丹酚酸A对肾小管周围微血管密度半定量分析图。
[0031 ]图中，与假手术组比较，###P〈0.001；与模型组比较广P〈0.01广*P〈0.001。
[0032]图10为本发明的丹酚酸A对肾小管上皮细胞VEGFA表达的影响。
[0033]图11为本发明的丹酚酸A对大鼠肾小管上皮细胞VEGFA表达半定量分析图。
[0034]图中，与假手术组相比，##P〈0.01，与模型组相比，*P<0.05,林P〈0.01, *林P〈0.001。
[0035]图12为本发明的丹酚酸A对大鼠肾组织HIF-Ια表达的影响。
[0036]图13为本发明的肾组织HIF-Ια表达半定量分析。
[0037]图中，与假手术组比较，###P〈0.001;与模型组比较广*P〈0.001。
[0038]图14为本发明的丹酚酸A对血小板活化的影响。
[0039]图15为本发明的丹酚酸A对活化血小板数目定量分析。
[0040]图中，与假手术组比较，##?〈0.01;与模型组比较，>〈0.05，，〈0.01，*，〈0.001。
【具体实施方式】
[0041]以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0042]实施例1丹酚酸A的制备
[0043]丹参多酚酸盐300克加水稀释至浓度为1.0%(以丹参乙酸镁计)，用柠檬酸三钠调pH至6.0，于125°C、0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后盐酸调pH至2.0-3.0，依法测定丹酚酸A含量;样品液过HPD100树脂柱，依次用水、25 %乙醇溶液洗脱(弃去)，再用40 %乙醇溶液洗脱收集丹酚酸A，依法测定丹酚酸A含量，减压浓缩至丹酚酸A浓度约15.0-30.0mg/ml;浓缩液过CG161树脂柱，依次用20 %乙醇溶液洗脱(弃去)，再用35 %乙醇溶液洗脱收集丹酚酸A，减压浓缩至丹酚酸A浓度约50.0mg/ml;盐酸调pH至2_3，以等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩，加2.5倍量硅胶(80-120目)拌匀，干燥，湿法上硅胶柱(200-300目，2.5倍量)，以正己烷-乙酸乙酯(6:4和5:5)洗脱，收集正己烷-乙酸乙酯(5:5)洗脱液，减压浓缩至干，加水适量分散，再减压浓缩，干燥，即得丹酸酸A 180.2克，含量96.6 % (夕卜标法)。
[0044]实施例2丹酚酸A对肾缺血-再灌注引起的急性肾损伤的保护作用
[0045]1.给药
[0046]雄性SD大鼠(体重220_250g)适应性喂养一周后，随机分为6个组:正常组、假手术组、缺血-再灌注损伤模型组、丹酚酸A各给药组(2.5、5、10mg/kg)，分组结束后开始给药，正常组、假手术组及缺血-再灌注损伤组分别尾静脉注射等量葡萄糖，丹酚酸A各剂量组分别尾静脉注射给予相应剂量的药物。每天一次，连续给药5天，于第5次给药后2h开始手术。
[0047]2.肾缺血再灌注模型的建立
[0048]大鼠术前禁食不禁水12h(于第5次给药前1h禁食)，10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉，腹部备皮，碘伏消毒后，腹部正中切口 3?4cm，从耻骨联合上方Icm至剑突下方。将腹腔肠管翻至腹腔外，用生理盐水浸湿的无菌纱布包裹保护，暴露双侧肾脏，充分显露双侧肾蒂，保护输尿管，距肾门0.5cm处用无创动脉夹夹闭双侧肾蒂，观察肾脏由鲜红色逐渐变为暗红色。将肠管还纳至腹腔，用3把血管钳钳夹腹壁，夹闭腹腔，以防止体温下降和水分散失。60min后去除血管钳，打开腹腔，将腹腔肠管翻至腹腔外，暴露肾脏。松开动脉夹，恢复灌流，肉眼可见肾动脉充盈，肾脏由暗红色变为鲜红色，表明再灌注成功(紫黑色转鲜红色证明肾血流恢复)；如果松开动脉夹5min未恢复红润，则视为再灌注失败，弃去不用。然后逐层缝合切口。闭合腹后观察2h，动物能正常活动和进食说明建造模型成功。假手术组只暴露双侧肾蒂(不结扎)，暴露60min后再关闭切口，不做肾缺血处理。术后大鼠放于24-29°C环境，密切观察大鼠的生命体征，自由饮食、饮水。
[0049]3.观察指标及测定方法
[0050]I)血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)含量:腹主动脉取血5mL，室温静置2h后，以3000r/min离心15min，分离血清，分装，采用全自动生化分析仪检测各组血清肌酐和尿素氮的含量。
[0051]2)肾组织病理损伤和定量分析:在取血前，取左肾固定在4%的多聚甲醛中，石蜡包埋，5μπι切片，HE染色，于光镜下观察肾组织病理变化，进行肾小管损伤评分。按下列标准对肾小管损伤进行评分:0分(正常)，1分(轻微损伤:肾小管受损〈5%)，2分(轻度损伤:肾小管受损5-25% )，3分(中度损伤:肾小管受损25-75% )，4分(重度损伤:肾小管受损>75% )作半定量分析，计算其平均值作为肾小管损伤程度的评价指标。
[0052]3)肾组织超微结构检查:约Imm3的皮质组织固定于2.5%的戊二醛中，然后固定于四氧化锇，梯度脱水，环氧树脂包埋。超微切片，柠檬酸铅和乙酸双氧铀染色，于电镜下观察肾组织超微结构变化。
[0053]4)免疫组织化学检测:取石蜡块，制成5μπι切片，进行脱蜡，逐级乙醇梯度脱水，然后将切片置于柠檬酸缓冲液中，于微波炉中加热进行抗原修复。之后在4°C条件下，与CD34、HIF-Ια以及VEGFA抗体孵育12-18h。然后进行DAB显色，苏木精复染，逐级乙醇梯度脱水，最后采用二甲苯透明处理，中性树脂封片后进行镜检。采用图像pro-plus 6.0软件进行半定量分析:每组内每张切片随机挑选10处视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(Ι00)<Χ034标记的切片将根据Weidner的方法进行肾小管周围微血管密度的分析:任何被抗体染色单个或成簇的内皮细胞与周围的组织和细胞清楚分离的，都记为一个单一的血管，面积大于8个红细胞面积的血管不予以计数。每一个标本先低倍镜(X 10)下选3个微血管高密度的区域即“热点”，每个高密度区计数3个400倍视野下的微血管计数，取其平均值为肾小管周围微血管密度值。
[0054]5)尿肾损伤分子-UKIM-1)和血浆血管性血友病因子(vWF)的含量:腹主动脉取血，3.8%枸盐酸钠抗凝(血量:抗凝剂=9:1)，3000rpm离心lOmin，取上清即为血楽。尿样直接从膀胱收集。采用ELISA试剂盒测定KIM-1和vWF含量。
[0055]6)血小板活化情况:腹主动脉取血，3.8%枸盐酸钠抗凝(血量:抗凝剂=9:1)，然后以100rpm离心5min，取上清即为富血小板血浆。取富血小板血浆，加入PE-CD61和APC-CD62P抗体，在21°C条件下，暗处孵育20min。然后加等体积的I %多聚甲醛固定20min，使用流式细胞仪进行检测，最后采用Flowjo软件进行数据分析。
[0056]结果
[0057]1.丹酚酸A对大鼠SCr和BUN的影响
[0058]SCr和BUN为临床常用的评价肾脏损伤的标志物，测定二者含量可反映肾脏损伤情况。实验结束时，处死大鼠，腹主动脉取血，离心，取血清，分别测定SCr和BUN含量。结果分别如图1和图2所示。模型组动物SCr和BUN水平明显升高，丹酚酸A给药能降低SCr和BUN的含量，表明丹酚酸A可减轻肾脏损伤程度。
[0059]2.丹酚酸A对尿液KIM-1含量的影响
[0060]IQM-1为肾小管损伤的特异性标志物，检测尿液中KM-1水平可间接评价肾损伤特另Ij是肾小管损伤情况。再灌注24h后，取尿，采用ELISA试剂盒检测KIM-1含量。结果如图3所示，与假手术组相比，模型组动物尿液ΙΠΜ-1含量明显升高。和模型组相比，丹酚酸A各给药组能降低尿中MM-1含量，并且呈剂量依赖性。
[0061 ] 3.丹酚酸A对大鼠肾脏组织病理损伤及损伤评分的影响
[0062]再灌注24小时后，处死大鼠，取肾组织固定于4%的多聚甲醛，石蜡包埋，切片，HE染色，于光镜下观察组织病理损伤并进行评分。如图4和图5所示，正常组和假手术组肾脏组织肾小管结构保持正常；模型组出现明显的急性肾小管坏死，主要表现为肾小管上皮细胞脱落、坏死以及管型形成。给予丹酚酸A治疗后，急性肾小管坏死程度明显减轻，肾小管坏死评分呈剂量依赖性降低。
[0063]4.丹酚酸A对血浆VffF的作用
[0064]再灌注24h后，取血，采用ELI SA试剂盒检测血浆vWF含量。如图6所示，与假手术组相比，模型组血浆vWF含量明显升高。和模型组相比，丹酚酸A各给药组能降低血浆中vWF的含量。
[0065]5.丹酚酸A对肾小管周围微血管内皮的作用
[0066]透射电镜结果显示，正常组和假手术组肾小管周围微血管保持正常，内皮细胞无损伤出现。模型组肾小管周围微血管内皮出现明显损伤，内皮表面不平滑，内皮细胞间接触不紧密，基底膜增厚分层以及内皮细胞表面有微绒毛突起的形成。与模型组相比，丹酚酸A各给药组能明显减轻微血管内皮损伤，内皮细胞间接触紧密，内皮细胞表面的微绒毛突起减少，如图7所示。
[0067]6.丹酚酸A对肾小管周围微血管密度的影响
[0068]与假手术组相比，模型组肾小管周围微血管密度明显降低。丹酚酸A各给药组呈剂量依赖性抑制肾小管周围微血管密度的降低，如图8和图9所示。
[0069]7.丹酚酸A对VEGFA表达的影响
[0070]VEGFA在肾小管上皮细胞上的表达情况与肾小管周围的微血管密度密切相关。模型组动物肾小管上皮细胞VEGFA表达明显降低。与模型组相比，丹酚酸A明显增加VEGFA的表达量，如图10和图11所示。
[0071 ] 8.丹酚酸A对HIF-Ια表达的影响
[0072]HIF-1a对低氧环境非常敏感，可以作为反映低氧水平的一个标志物。模型组中，HIF-1a在肾小管细胞核中高表达。然而，在丹酚酸A组中，HIF-1a的表达明显降低。丹酚酸A明显改善肾低氧环境，如图12和13所示。
[0073]9.丹酚酸A对血小板活化的作用
[0074]结果显示，与假手术组相比，模型组的P-选择素阳性表达的血小板数明显增多，表明活化血小板数增多。与模型组相比，丹酚酸A各给药组P-选择素阳性表达的血小板数呈剂量依赖性减少。丹酚酸A能明显抑制血小板的活化，如图14和15所示。
[0075]由此可见，丹酚酸A可有效减轻肾小管坏死和肾小管微血管内皮细胞损伤，增加血管内皮生长因子的表达，抑制微血管密度的减少，改善缺血缺氧程度，从而减轻急性肾损伤大鼠肾脏组织损伤。因此，丹酚酸A可以用作制备治疗急性肾损伤药物中，从而开辟了丹酚酸A的新用途。
[0076]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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【主权项】
1.丹酚酸A在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述丹酚酸A的可药用盐在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗急性肾损伤药物为减轻肾小管坏死和血管内皮损伤、增加血管内皮生长因子表达、降低缺氧诱导因子Ia表达改善缺氧环境的药物。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述急性肾损伤的原因为缺血、药物、毒素、重大创伤、外科手术中的一种或多种。5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述丹酚酸A由以下制备方法得到:以质量浓度为1.0%的丹参多酚酸盐溶液为原料，添加柠檬酸三钠调pH至6.0，于125 °C、.0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后，盐酸调pH至2.0-3.0，得到丹酚酸A溶液;将上述丹酚酸A溶液依次过HPD100树脂富集与纯化、CG161树脂分离与纯化、硅胶柱色谱精细纯化，即得到所述丹酚酸A。
【文档编号】A61K31/216GK106074487SQ201610495121
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】范华英, 刘珂, 杨明艳, 张作凯, 高振芳, 王学凯, 郎跃武
【申请人】烟台大学