专利名称：：一种改进的含有淀粉酶的衣物洗涤剂组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含有具有一未在自然界中发现的氨基酸序列的新型α-淀粉酶突变体的衣物洗涤剂，这种α-淀粉酶突变体具有一氨基酸序列，其中前体α-淀粉酶的一个或多个氨基酸残基，特别是任何可氧化氨基酸，已被一种不同的氨基酸代替。本发明的衣物洗涤剂中的突变酶表现出改变的稳定性/活性形象，包括但并未局限于改变的氧化稳定性、改变的pH效能曲线，改变的比活性和/或改变的热稳定性。α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)主要随机水解淀粉中的内部α-1，4-葡糖苷键，以产生小分子量麦芽糖糊精。α-淀粉酶具有很大的商业价值，其被用于淀粉加工的初始阶段(液化)，用于酒精生产，作为洗涤剂基质中的清洁剂，和在纺织工业中用于淀粉脱浆工艺。α-淀粉酶由很多种微生物包括芽孢杆菌属和曲霉属产生，最商品化的淀粉酶产生于诸如地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌之类的细菌来源。近年在商业应用中优选的酶是那些源于地衣芽孢杆菌的酶，原因在于它们的热稳定性和效能，至少在中性和微碱性pH条件下。先前曾有研究利用重组DNA技术来探索哪些残基对于淀粉酶的催化活性是重要的和/或探索对各种淀粉酶活性位点的某些氨基酸进行修饰的效果(Vihinen，M.等(1990)《生物化学杂志》(J.Biochem.)107267-272；Holm，L.等(1990)《蛋白质工程》(ProteinEngineering)3181-191；Takase，K.等(1992)《生物化学和生物物理学学报》(BiochemicaetBiophysicaActa)1120281-288；Matsui，I.等(1992)《欧洲生物化学会联合会快报》(FebsLetters)310卷第3期216-218页)；哪些残基对于热稳定性是重要的(Suzuki，Y.等(1989)《生物学化学杂志》(J.Biol.Chem.)26418933-18938)；并且一个工作组已经利用这种方法对一地衣芽孢杆菌的淀粉酶在各组氨酸残基处引入突变，对组氨酸残基进行替换的理论基础是与其它类似的芽孢杆菌属淀粉酶相比，地衣芽孢杆菌淀粉酶(已知为热稳定)具有多余的组氨酸，因而，表明取代一个组氨酸可以影响酶的热稳定性(Declerck，N.等(1990)《生物学化学杂志》26515481-15488；FR2665178-A1；Joyet，P.等(1992)《生物技术》(Bio/Technology)10157-1583)。已经发现如这里实施例所描述的α-淀粉酶在pH为4到10.5之间被过氧化氢和其它氧化剂灭活。商业上，根据商业性用途α-淀粉酶可在显著不同的条件如高和底pH条件下使用。例如，α-淀粉酶可被用于优选在低的pH(pH＜5.5)下淀粉的液化。另一方面，淀粉酶可被用于商业性洗碗或衣物洗涤剂，其中通常含有氧化剂如漂白剂或过酸，并且被用于更碱性的条件下。为了改变淀粉酶在变换的条件下的稳定性和活性，已经发现选择性置换、取代或删除可氧化氨基酸如蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或半胱氨酸，导致变体酶与其前体相比具有一种改变了的形象。因为当前商品化的淀粉酶并不是在各种条件下都合意(稳定)，所以需要一种具有改变了的稳定性和/或活性形象的淀粉酶。与野生型或前体酶相比，在保持充分的酶活性的同时这种改变的稳定性(氧化性的、热的或pH效能曲线)是可以达到的。通过引入这种突变而被影响了的特性可能是在保持热稳定性的同时在氧化稳定性上的改变或者反之亦然。另外，在α-淀粉酶前体序列中以不同的氨基酸取代一可氧化氨基酸或删除一个或多个可氧化氨基酸可能引起在一不同与被认为对前体α-淀粉酶最佳的pH下的改变酶活性。换言之，本发明的突变体酶可能也具有改变的pH效能曲线，这或许是由于提高了酶的氧化稳定性。本发明涉及含有突变体α-淀粉酶的新型衣物洗涤剂组合物，这种α-淀粉酶突变体是编码α-淀粉酶的突变DNA序列的表达产物，这种突变的DNA序列衍生于被缺失或置换一个或多个可氧化氨基酸的前体α-淀粉酶。在本发明的一个优选实施方案中，突变体是由前体α-淀粉酶的一个或多个蛋氨酸残基被另一种氨基酸取代而来。而在本发明的另一种实施方案中，突变体包括前体α-淀粉酶的一个或多个色氨酸残基被取代或一个或多个色氨酸残基和一个或多个蛋氨酸残基联合被取代。总的来看，这种突变体是通过体外修饰一编码天然或重组的α-淀粉酶的前体DNA序列来编码前体氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的取代或缺失而得到的。在氨基酸序列中一个或多个氨基酸的置换或缺失优选是由于这种序列中一个或多个蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸或酪氨酸残基的置换或缺失，最优选改变的残基是蛋氨酸残基。可氧化氨基酸残基可被其他20个天然氨基酸的任何一个替代。如果预期的效果是改变前体的氧化稳定性，则氨基酸残基可被一个非氧化氨基酸(如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸)或另一可氧化氨基酸(如半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸或组氨酸，以最容易被氧化到不容易被氧化的顺序列出)所取代。同样，如果预期的效果是改变热稳定性，则可用其他20种天然氨基酸来置换(例如，半胱氨酸可被用来置换蛋氨酸)。优选的衣物洗涤剂包括含有置换一个等价于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中发现的任何蛋氨酸残基(+8，+15，+197，+256，+304，+366和+438)的蛋氨酸残基的突变体。最优选被取代的蛋氨酸是在一等价于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中+197或+15位点上的蛋氨酸。用于取代在+197位点上的蛋氨酸的优选的置换氨基酸是丙氨酸(A)，异亮氨酸(I)，苏氨酸(T)或半胱氨酸(C)。在+15位点上的优选置换氨基酸是亮氨酸(L)，苏氨酸(T)，天门冬氨酸(D)，丝氨酸(S)，缬氨酸(V)和异亮氨酸(I)，虽然上面没有指明的其它置换氨基酸可能也可用。本发明的两个特别优选的突变体是M197T和M15L。本发明的另一实施方案涉及包括含有取代等价于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(见图2)中发现的任何色氨酸残基的一个色氨酸残基的突变体的衣物洗涤剂。优选被置换的色氨酸在等价于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的+138位点上。可以制备单独在一个色氨酸残基上的突变(置换)或联合在其它可氧化氨基酸残基上的突变。尤其是通过联合置换至少一个色氨酸和至少一个蛋氨酸的修饰可能是有利的(例如，双突变体+138/+197)。大体上，本发明的衣物洗涤剂中所包含的α-淀粉酶突变体在过氧化氢和其它氧化剂如漂白剂或过酸，或者，更尤其是较和缓的氧化剂如氯胺-T存在时表现出改变了的氧化稳定性。具有提高了的氧化稳定性的突变体酶将对延长货架寿命和扩展用在洗涤产品中淀粉酶对漂白剂、过硼酸盐、过碳酸盐或过酸的相容性是有帮助的。相应地，本发明的一个优选的实施方案包括含有本发明的突变体α-淀粉酶还含有一种漂白剂或过酸化合物的一种衣物洗涤剂。本发明特别优选的实施方案是一含有本发明突变体α-淀粉酶的具有高于大约10且更优选介于大约10到12之间pH的衣物洗涤剂。也优选一种具有介于大约10到12之间pH的并还含有一种漂白剂或过酸化合物的颗粒性衣物洗涤剂。当与野生型或非本发明的酶相比时，根据本发明的突变体酶也令人惊奇地以在中性pH范围内具有更高的活性为特点。相应地，另一特别优选的实施方案包括含有本发明的突变体α-淀粉酶具有介于大约5.0到10.0之间的或更优选介于大约6.0到10.0之间pH的衣物洗涤剂。最优选的实施方案是pH在约6.0到10.0之间的液体洗涤剂。类似地，降低的氧化稳定性可能在需要快速和有效地将酶灭活的工业处理中有用。本发明的突变体酶也可以表现出一个拓宽了的pH效能曲线，据此，突变体如M15L对低pH的淀粉液化表现出稳定性，突变体如M197T在高pH的洗涤剂条件下表现出稳定性。本发明的突变体也可以具有改变的热稳定性，据此，突变体在高或低的温度下可能具有提高了的稳定性。不言而喻，根据预期的目的和含有突变体α-淀粉酶的衣物洗涤剂配方，与其前体相比，突变体的酶促特性的任何变化(增加或降低)可能是有益的。本发明优选的衣物洗涤剂含有源自芽孢杆菌属菌株如地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌，且最优选源自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶的突变体。本发明另一方面还提供一种含有通常由地衣芽孢杆菌产生的一种新形式的α-淀粉酶的衣物洗涤剂。这个被称为A4形式的新形式是在被分泌的淀粉酶的N-末端具有额外的四个丙氨酸(图4b)。本发明中包括A4形式α-淀粉酶的衍生物或突变体。A4形式的衍生物或突变体是指本发明包括含有一个或多个其它突变，如一个或多个可氧化氨基酸的突变(置换、取代或缺失)的A4形式α-淀粉酶。本发明的一个组合物实施方案包括含有在此中所描述的α-淀粉酶突变体的液体、凝胶或颗粒的衣物洗涤剂组合物。优选单独含有一个在+197位的突变体或与其它酶如内切糖苷酶、纤维素酶、蛋白酶、脂酶或其它淀粉酶联合的洗涤剂组合物。特别优选含有一种M15X/W138X/M197X突变体，最优选含有一种M15T/W138Y/M197T(“TYT”)突变体的衣物洗涤剂组合物。另外，考虑本发明的组合物可以包括一种含有一个以上位点特异突变的α-淀粉酶。根据本发明的一种方法实施方案，本发明的衣物洗涤剂组合物用于一种洗涤脏衣物的方法。图1a-1c显示地衣芽孢杆菌(NCIB8061)中α-淀粉酶基因的DNA序列(序列号31)和如在GrayG.等(1986)《细菌杂志》(J.Bacter.)166635-643中所描述的推导出的翻译产物。图2显示地衣芽孢杆菌(NCIB8061)中成熟的α-淀粉酶的氨基酸序列(序列号32)。图3a-3b显示芽孢杆菌属α-淀粉酶一级结构的对比。地衣芽孢杆菌淀粉酶(Am-Lich)，序列号33，被GrayG.等(1986)《细菌杂志》166635-643描述；解淀粉芽孢杆菌淀粉酶(Am-Amylo)，序列号34，被Takkinen，K.等(1983)《生物学化学杂志》2581007-1013描述；嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶(Am-Stearo)，序列号35，被Ihara，H.等(1985)《生物化学杂志》9895-103描述。图4a显示突变体M197T的氨基酸序列，序列号36。图4b显示地衣芽孢杆菌NCIB8061中的A4形式α-淀粉酶的氨基酸序列，序列号37。由四个额外的丙氨酸开始，从N-末端计数。图5显示质粒pA4BL，其中BLAA代表地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因，从PstI到SstI；AmpR代表pBR322来源的氨苄青霉素抗性基因；CAT代表pC194来源的氯霉素抗性基因。图6显示地衣芽孢杆菌的(序列号38)、枯草芽孢杆菌的(序列号39)、pA4BL中的地衣芽孢杆菌的(序列号40)和pBLapr中地衣芽孢杆菌的(序列号41)信号序列-成熟蛋白连接。图7a显示在pH5.0，25℃时0.88MH2O2对某些α-淀粉酶(SpezymeAA20和M197L(A4形式))的灭活。图7b显示在pH10.0，25℃时0.88MH2O2对某些α-淀粉酶(SpezymeAA20，M197T)的灭活。图7c显示在pH5.0，25℃时0.88MH2O2对某些α-淀粉酶(SpezymeAA20，M15L)的灭活。图8显示一个制备M197X盒式突变体的模式图。图9显示M197X突变体的表达。图10显示M197X突变体在pH5.0，5mMCaCl2条件下95℃5分钟的热稳定性。图11a和11b显示某些淀粉酶在自动洗碗洗涤剂中的灭活。图11a显示65℃时在存在或不存在淀粉的条件下某些淀粉酶在CascadeTM(一种商品化的洗碗产品)中的稳定性。图11b显示65℃时在存在或不存在淀粉的条件下某些淀粉酶在SunlightTM(一种商品化的洗碗产品)中的稳定性。图12显示一个制备M15X盒式突变体的模式图。图13显示M15X突变体的表达。图14显示M15X突变体对可溶性淀粉的比活性。图15显示M15X突变体在pH5.0，5mMCaCl2条件下90℃5分钟的热稳定性。图16显示M15变体对淀粉和可溶性底物的比活性及pH5.5时在喷射液化中的效能，作为地衣芽孢杆菌野生型活性百分比的函数。图17显示与突变体M197A(1.7mg/m1)和M197L(1.7mg/ml)相比，在pH8.0时氯胺-T对地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(0.65mg/ml的AA20)的灭活。图18显示与突变体M197A(4.3mg/ml)和M197L(0.53mg/ml)相比，在pH4.0时氯胺-T对地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(0.22mg/ml的AA20)的灭活。图19显示与双突变体M197T/W138F(0.64mg/ml)和M197T/W138Y(0.60mg/ml)相比，在pH5.0时地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(0.75mg/ml的AA20)与氯胺-T的反应。图20显示掺入自动洗碗去污剂(ADD)配方中的各种α-淀粉酶多突变体在温度从室温升至65℃时的稳定性测试结果。图21显示通过剩余活性百分比测定的某些淀粉酶突变体(与野生型相比)在一自动洗碗去污剂中室温下0-30天的稳定性。图22显示某些淀粉酶突变体(与野生型相比)在一自动洗碗去污剂中38℃(100°F)和80％相对湿度下0-30天的稳定性。图23显示某些淀粉酶在25℃中性或碱性pH下对Phadebas底物的pH活性曲线。图24显示某些淀粉酶在pH9.3和52℃下对过乙酸的稳定性。图25根据反射度(与对照之差)对所加入的淀粉酶ppm显示本发明的淀粉酶(“TYT”)与TermamylTM淀粉酶相比在液体衣物洗涤剂中40℃时的相对清洁能力。图26根据反射度(与对照之差)对所加入的淀粉酶ppm显示本发明的淀粉酶(“TYT”)与TermamylTM淀粉酶相比在液体衣物洗涤剂中55℃时的相对清洁能力。图27以反射度(与对照之差)对所加入的淀粉酶ppm显示本发明的淀粉酶在商品化的洗涤剂中的洗涤效能。据认为，用于淀粉液化中的淀粉酶可能因为在淀粉匀浆中存在的一些活性而遭到某些形式的灭活(见US申请07/785，624和07/785，623及US专利5,180,669，1993年1月19日公布，这些文献并入本文作为参考)。另外，在氧化剂存在如在含有漂白剂或过酸的洗涤剂中使用淀粉酶时，可能导致淀粉酶的部分或完全失活。因而，本发明重点在于改变被加入洗衣去污剂中的淀粉酶的氧化敏感性。本发明的在洗衣去污剂中的突变体酶也可能具有一改变了的pH曲线和/或可能因为提高了酶在低或高的pH下的氧化稳定性而改变了的热稳定性。此中所用的α-淀粉酶包括天然产生的淀粉酶和重组的淀粉酶。本发明中优选的淀粉酶是来源于地衣芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，包括此中所描述的来源于地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶的A4形式，以及如那些来源于曲霉属(即米曲霉和黑曲霉)的真菌α-淀粉酶。重组α-淀粉酶指一种α-淀粉酶，其中编码天然产生的α-淀粉酶的DNA序列被修饰而产生一种在α-淀粉酶序列中编码一个或多个氨基酸的置换、插入或缺失的突变DNA序列。本文和US专利4,760,025和5,185,258中都公布了合适的修饰方法，这些文献并入本文作为参考。在迄今已被测序的几乎所有内切淀粉酶之间，从植物、哺乳动物到细菌，已发现具有同源性(Nakajima，R.t.等(1986)《应用微生物学和生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)23355-360；Rogers，J.C.(1985)《生物化学生物物理学研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)128470-476)。在某些芽孢杆菌属淀粉酶中有四个区域具有特别高的同源性，如图3所示，其中下面划线的部分是高同源性的区域。另外，还用序列对比来描绘芽孢杆菌属内切淀粉酶之间的关系(Feng，D.F.和Doolittle，R.F.(1987)《分子进化杂志》(J.Molec.Evol.)35351-360)。由Holm，L.等(1990)《蛋白质工程》3(3)181-191页确定的嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌淀粉酶之间的相对序列同源性约为66％。按照前面Holm，L.等确定的，地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌淀粉酶之间的序列同源性约为81％。虽然序列同源性是重要的，但普遍认为在比较淀粉酶或其它酶时结构的同源性也很重要。例如，已经表明在真菌淀粉酶和细菌(芽孢杆菌属)淀粉酶之间的结构同源性，因此真菌淀粉酶被包含在本发明中。一种α-淀粉酶突变体具有来源于一前体α-淀粉酶氨基酸序列的一种氨基酸序列。前体α-淀粉酶包括天然存在的α-淀粉酶和重组α-淀粉酶(如被定义的)。α-淀粉酶突变体的氨基酸序列通过置换、缺失或插入一个或多个前体氨基酸序列中的氨基酸而由前体α-淀粉酶氨基酸序列衍生来。这种修饰是对编码前体α-淀粉酶氨基酸的前体DNA序列进行的，而不是对前体α-淀粉酶本身进行的操作。对前体DNA序列进行这种操作的适宜的方法包括在这里及在US专利4,760,025和5,185,258中公开的方法。此中，与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的M197、M15和W138位点相对应的特定残基被鉴定进行置换或缺失，它们都是蛋氨酸、组氨酸、色氨酸、半胱氨酸和酪氨酸残基。氨基酸位点数(即，+197)指在图2中所列出的成熟地衣芽孢杆菌α-淀粉酶序列中给定的数字。然而，本发明并不仅仅局限于这种特殊的成熟α-淀粉酶(地衣芽孢杆菌)的突变，而且还扩展至与在地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中鉴定出的特殊的残基等价的位点上含有氨基酸残基的前体α-淀粉酶。如果一种前体α-淀粉酶的一个残基(氨基酸)同源(即在一级或三级结构上的位点相同)或类似于在地衣芽孢杆菌α-淀粉酶上的一个特定残基或那个残基所在的部分(即化学上或结构上具有相同或相似的作用能力来结合、反应或相互作用)，则这种前体α-淀粉酶的这个残基等价于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的那个残基。为了确立一级结构的同源性，将一种前体α-淀粉酶的氨基酸序列直接与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶一级序列相比，尤其是与已知对所有序列已知的α-淀粉酶都不变的一系列残基进行比较，如图3所示。也可以通过三级结构确定等价残基猪胰腺α-淀粉酶的晶体结构(Buisson，G.等(1987)《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBOJ.)63909-3916)、曲霉的Taka-淀粉酶A的晶体结构(Matsuura，Y.等(1984)《生物化学杂志》(东京)95697-702)和黑曲霉中的一种酸性α-淀粉酶的晶体结构(Boel，E.等(1990)《生物化学》(Biochemistry)296244-6249)已被报道，前两者的结构类似。虽然据推测在葡聚糖酶之间具有共同的超二级结构(MacGregor，E.A和Svensson，B.(1989)《生物化学杂志》(Biochem.J.)259145-152)以及嗜热脂肪芽孢杆菌的酶结构已被模拟成Taka-淀粉酶A的结构(Holm，L.等(1990)《蛋白质工程》3181-191)，但对芽孢杆菌属的α-淀粉酶还没有已公布的结构。在图3中展示的四个高度保守区包含许多被认为是活性位点的部分的残基(Matsuura，Y.等(1984)《生物化学杂志》(东京)95697-702；Buisson，G.等(1987)《欧洲分子生物学组织杂志》63909-3916；Vihinen，M.等(1990)《生物化学杂志》107267-272)，包括按地衣芽孢杆菌中计数的His105、Arg229、Asp231、His235、Glu261和Asp328。这里所用的表达载体指含有一个可操作地连接于一能够在合适的宿主中影响该DNA表达的适宜的控制序列的DNA构建物。这种控制序列可能含有一个用于有效转录的启动子、一个编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。优选的启动子是枯草芽孢杆菌aprE启动子。载体可以是一种质粒、一种噬菌体颗粒或简单地是一种潜在的基因组插入片段。一旦转化进入一合适的宿主，载体可以不依赖于宿主基因组而复制和发挥功能，或者在某些情况下可以整合成为基因组本身。在本说明中，质粒和载体有时被相互交换地使用，因为质粒是当前最常用的载体形式。然而本发明意在包括由能执行同样功能并且在本领域已被了解或开始被了解的其它形式的表达载体所生产的淀粉酶。在本发明中有效的宿主菌(或细胞)一般是原核或真核宿主，包括任何能够获得α-淀粉酶表达的可转化的微生物。特别是与α-淀粉酶所来源的种或属相同的宿主菌是合适的，如芽孢杆菌属菌株。优选使用一种α-淀粉酶阴性的芽孢杆菌菌株和/或一种α-淀粉酶和蛋白酶缺失的芽孢杆菌菌株，如枯草芽孢杆菌菌株BG2473(ΔamyE、Δapr、Δnpr)。宿主细胞被通过利用重组DNA技术构建的载体转化或转染。这种转化的宿主细胞能够复制编码α-淀粉酶和其它变体(突变体)的载体或者表达预期的α-淀粉酶。本发明的突变体在发酵过程中优选被分泌到培养基中。任何适宜的信号序列，如aprE信号肽，都可被用来作到分泌表达。本发明的许多α-淀粉酶突变体在配制各种洗涤剂组合物，特别是某些衣物洗涤剂的清洁组合物，尤其是那些含有已知的氧化剂如漂白剂或过酸化合物的清洁组合物的过程中是有用的。本发明的α-淀粉酶突变体可被配制成pH在大约4.5到12.0，优选大约5.0到10.0，最优选约6.0到10.0之间的已知的粉末、液体或胶体洗涤剂。另外一个优选的实施方案包括pH在大约10.0到12.0之间的衣物洗涤剂，其中漂白剂也存在于组合物中。含有颗粒状淀粉酶的适宜的组合物可按照在美国专利申请07/429,881、07/533,721和07/957,973中所描述的方法制造，所有这些文献均并入本文作为参考。这些洗涤剂清洁组合物也可含有其它酶，如已知的蛋白酶、脂酶、纤维素酶、内切糖苷酶或其它的淀粉酶和助洗剂、稳定剂或其它由本领域技术人员所了解的赋形剂。这些酶可以以共颗粒或混合物或以本领域的技术人员所了解的其它任何形式存在。另外，本发明考虑多突变体可能在清洁或其它应用中有用。例如，一个在+15和+197位有改变的突变体酶可以表现出提高了的在清洗剂中有用的效能或一个含有+197和+138位改变的多突变体可以具有改善了的效能。特别优选的用于洗涤剂，尤其是衣物洗涤剂配方中的突变体酶包括但并不局限于M15T/M197T、M15S/M197T、W138Y/M197T、M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T(“TYT”)。本发明的另一实施方案包括这里所描述的突变体α-淀粉酶与其它酶(即蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等)的联合，优选氧化稳定的蛋白酶。适宜的氧化稳定蛋白酶包括遗传工程蛋白酶如那些在USRe34,606(引入本文作为参考)中所描述的、和商品化的酶如DURAZYM(NovoNordisk)、MAXAPEM(Gist-brocades)和PURAFECTOXP(GenencorInternational，Inc.)。在USRe34606中描述有制造这些蛋白酶突变体(氧化稳定蛋白酶)，特别是这些带有一种对在一等价于解淀粉芽孢杆菌中M222位点上的蛋氨酸进行置换的突变体的适宜方法。在Re34606、EP257,446和USSN212,291中都提供有用于在其它枯草蛋白酶中确定“等价”位点的适宜的方法，所述文献引入本文作为参考。此中所用的缩写，特别是氨基酸的三个字母或一个字母的标志在Dale，J.W.，《细菌分子遗传学》(MolecularGeneticsofBateria)，JohnWiley和Sons，(1986)附录B中都有描述。实施例1地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中蛋氨酸残基的置换α-淀粉酶基因(图1)是由从国家工业细菌保藏中心((NationalCollectionofIndustrialBacteria)，阿伯丁(Aberdeen)，苏格兰)获得的地衣芽孢杆菌NCIB8061中克隆的(Gray，G.等(1986)《细菌学杂志》166635-643)。编码信号序列的最后三个残基的1.72kbPstI到SstI片段；完整的成熟蛋白和终止区被亚克隆到M13MP18中。利用一个合成的如下形式的寡核苷酸盒子BclISstI5′GATCAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT3′3′TTTTGTATTTTTTGGCCGGAACCGGGGCGGCCAAAAAATAATAAAAAC5′序列号1将一个合成的终止子加在BclI和SstI位点之间。(Wells等(1983)《核酸研究》(NucleicAcidResearch)117911-7925)。寡核苷酸的定点诱变基本上是利用Zoller，M.等(1983)《酶学方法》(Meth.Enzymol.)100468-500上的方法简单地说，通过利用表I列出的寡核苷酸来置换地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中发现的七个蛋氨酸中的每一个将5-磷酸化寡核苷酸引物用于在M13单链DNA模板上引入预期的突变。每个诱变的寡核苷酸也引入一个限制性内切酶位点用作对连接突变的筛选。表I用于置换地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中蛋氨酸残基的诱变寡核苷酸M8A5′-TGGGACGCTGGCGCAGTACTTTGAATGGT-3′序列号2ScaI+M15L5′-TGATGCAGTACTTTGAATGGTACCTGCCCAATGA-3′序列号3ScaI+KpnI+M197L5′-GATTATTTGTTGTATGCCGATATCGACTATGACCAT-3′序列号4EcoRV+M256A5′-CGGGGAAGGAGGCCTTTACGGTAGCT-3′序列号5StuI+M304L5′-GCGGCTATGACTTAAGGAAATTGC-3′序列号6AfIII+M366A5′-CTACGGGGATGCATACGGGACGA-3′序列号7NsiI+M366Y5′-CTACGGGGATTACTACGGGACCAAGGGAGACTCCC-3′序列号8StyI+M438A5′-CCGGTGGGGCCAAGCGGGCCTATGTTGGCCGGCAAA-3′序列号9SriT+粗体字母代表由寡核苷酸引入的碱基改变。在M8A形式中显示的密码子的改变是在+8位点上的蛋氨酸(M)被变换为丙氨酸(A)。下划线表示由寡核苷酸引入的限制性内切酶位点。用异源双链转染大肠杆菌mutL细胞(Kramer等(1984)《细胞》(Cell)38879)，并在噬斑纯化后，通过RF1的限制性酶切分析来鉴定克隆。阳性克隆通过双脱氧测序(Sanger等(1977)《美国国家科学院学报》(ProC.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)745463-5467)并且每个克隆的PstI-SstI片段都被亚克隆到大肠杆菌载体质粒pA4BL中。质粒DA4BL按照在US申请860,468中(Power等)描述的方法，此文引入本文作为参考文献，一个沉默PstI位点被引入在源自pS168-1的aprE基因(Stahl，M.L.和Ferrari，E.(1984)《细菌杂志》158411-418)的+1密码子处(信号切割位点后的第一个氨基酸)。aprE启动子和信号肽区然后被以HindIII-PstI片段的形式从pJH101质粒(Frrari，F.A.等(1983)《细菌杂志》1541513-1515)中克隆出来并亚克隆至pUC18衍生的质粒JM102(Ferrari，E.和Hoch，J.A.(1989)《芽孢杆菌属》(Bacillus)C.R.Harwood编，Plenum出版，57-72页)中。地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的PstI-SstI片段的插入使pA4BL(图5)具有如图6所示结果的aprE信号肽-淀粉酶接头。向枯草芽孢杆菌中的转化pA4BL是一种能在大肠杆菌中复制并能整合入枯草芽孢杆菌染色体的质粒。含有不同突变体的质粒被转化入枯草芽孢杆菌(Anagnostopoulos，C.和Spizizen，J.(1961)《细菌杂志》81741-746)并通过一种坎贝尔型(Campbell-type)机制整合进入染色体的aprE基因座(Young，M.(1984)《微生物学遗传杂志》(J.Gen.Microbiol.)1301613-1621)。枯草芽孢杆菌BG2437是缺失了淀粉酶(ΔamyE)和两个蛋白酶(Δapr，Δnpr)的I168菌株的衍生株(Stahl，M.L.和Ferrari，E.，《细菌杂志》158411-418及US专利5,264,366，此文引入这里作为参考)。转化后，通过由PBS-1介导的转导(Hoch，J.A.(1983)1541513-1515)将sacU32(Hy)(Henner，D.J.等(1988)《细菌杂志》170296-300)突变引入。在枯草芽孢杆菌中由pA4BL表达的淀粉酶的N-末端分析表明，它将被加工成在分泌的淀粉酶的N-末端具有四个额外的丙氨酸(A4形式)。这些额外的残基对A4形式的活性或热稳定性并没有明显的有害效应，而且在一些应用中可以提高效能。在随后的试验中，地衣芽孢杆菌淀粉酶和突变体M197T的正确加工形式都由一个非常相似的构建获得(见图6)。尤其是为了使下面的诱变寡核苷酸5′-CATCAGCGTCCCATTAAGATTTGCAGCCTGCGCAGACATGTTGCT-3′序列号10获得一个编码链模板，将A4结构的5端在EcoRI-SstII片段上从pA4BL(图5)亚克隆到M13BM20(BoehringerMannheim)上。这个引物清除了编码额外四个N-末端丙氨酸的密码子，通过缺少PstI位点来筛选正确的形式。将EcorI-SstI片段亚克隆回pA4BL载体(图5)中形成pBLapr。M197T的置换可在SstII-SstI片段上被移出pA4BL(M197T)而移入互补的pBLapr载体形成pBLapr(M197T)。在枯草芽孢杆菌中由pBLapr表达的淀粉酶的N-末端分析表明它将被加工成与在地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中发现的相同的N-末端。实施例2蛋氨酸变异体的氧化敏感性地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，如SpezymeAA20(购自GenencorInternational，Inc.)在过氧化氢存在时迅速被灭活(图7)。各种蛋氨酸变异体在枯草芽孢杆菌的摇瓶培养中被表达，其粗上清通过硫酸铵切换纯化。从一个20％饱和的硫酸铵上清通过将硫酸铵提高至70％饱和度而将淀粉酶沉淀下来，然后重悬。随后在25℃pH5.0条件下将变异体暴露于0.88M的过氧化氢。在地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的六个蛋氨酸位点上的变异体仍然遭到过氧化物的氧化，而在+197位点上的置换(M197L)则表现出对过氧化物氧化作用的抗性(见图7)。然而，下面被更加细致地描述的随后的分析则表明，一个变异体可能在pH5.0、25℃条件下对氧化作用敏感，但在不同条件下(即液化作用)，却可表现出改变/提高了的效能。实施例3在197位点上的所有可能变异体的构建所有的M197变异体(M197X)都是通过盒式诱变以A4形式产生的，如在图8中所概括的1)利用下面所示的诱变寡核苷酸M197A5′-GATTATTTGGCGTATGCCGATATCGACTATGACCAT-3′EcoRV+ClaI-序列号11将定点诱变(通过在M13中引物的延伸〕用于产生M197A，这同时也插入一个EcoRV位点(密码子200-201)来取代ClaI位点(密码子201-202)。2)然后利用引物LAAM12(表II)在密码子186-188上引入另一沉默限制性酶切位点(BstBI)。3)所获得的M197A(BstBI+，EcoRV+)变异体然后再被亚克隆(PstI-SstI片段)到质粒pA4BL中，所获得的质粒用BstBI和EcoRV消化，大的含有载体的片段通过从琼脂糖凝胶中电洗脱而被分离出来。4)每个合成的引物LAAM14-30(表II)都与大的互补通用引物LAMM13I(表II)退火。所形成的在+197位点编码剩余所有天然氨基酸的盒子，分别被连接到上面制备的载体片段中。表II用于进行盒式诱变来制备M197X变异体的合成寡核苷酸LAAM12GGGAAGTTTCGAATGAAAACG序列号12LAAM13X197bs序列号13(EcoRV)GTCGGCATATGCATATAATCATAGTTGCCGTTTTCATT(BstBI)LAAM14I197序列号14(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATCTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM15F197序列号15(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTTCTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM16V197序列号16(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGTTTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM17S197序列号17(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAGCTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM18P197序列号18(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCCTTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM19T197序列号19(Bst8I)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGACATATGCCGAC(EcoRV-)LAAM20Y197序列号20(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTACTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM21H197序列号21(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCACTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM22G197序列号22(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGGCTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM23Q197序列号23(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCAATATGCCGAC(EcoRV-)LAAM24N197序列号24(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAACTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM25K197序列号25(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAAATATGCCGAC(EcoRV-)LAAM26D197序列号26(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGATTATGCCGAC(EcoRv-)LAAM27E197序列号27(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGAATATGCCGAC(EcoRV-)LAAM28C197序列号28(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTGTTATGCCGAC(EcoRy-)LAAM29W197序列号29(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTGGTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM30R197序列号30(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAGATATGCCGAC(EcoRV-)盒子被设计成在连接时破坏EcoRV位点，因此用这个单一位点的缺失来筛选从大肠杆菌转化体中所获得的质粒。另外，盒子的共同底链含有一个读框移位，并编码一个NsiI位点，因此，这条链来源的转化体能通过筛选单一NsiI位点的存在而被清除，而且在任何情况下它都被认为不会表达有活性的淀粉酶。经限制性酶切分析阳性的克隆通过测序和转化枯草芽孢杆菌获得在摇瓶培养中的表达(图9)而得到证实。然后通过一个可溶性底物检测来测定某些M197X突变体的特异性活性。利用随后的检测方法所获的资料在下面表III中列出。可溶性底物检测以由Megazyme(澳大利亚)Pty.Ltd提供的终点检测试剂盒为基础，进行了速率检测每小瓶底物(对硝基苯基麦芽糖庚糖苷，BPNPG7)被溶于10ml无菌水中，随后在测试缓冲液(50mk马来酸缓冲液，pH6.7，5mM氯化钙，0.002％吐温20)中进行1-4倍稀释。在25℃通过向样品池中的790μl底物中加入10μl淀粉酶来进行检测。根据在410nm处每隔75秒的吸收值的变化率测定水解效率。检测是线性的直到变化率高至0.4吸收单位/分钟。基于利用牛血清白蛋白标准品的方法(Bradford，M.(1976)《分析生物化学》(Anal.Biochem.)72248)通过标准的Bio-Rad检测(Bio-Rad实验室)来测定淀粉酶的浓度。淀粉水解检测利用检测SpezymeAA20α-淀粉酶活性的标准方法。这个方法在USSN07/785,624的实施例1中被详细的描述，该文献引入本文作为参考。天然淀粉与碘作用产生蓝色，但当它水解成短的糊精分子后，就失去这个能力。底物是在pH6.2的磷酸盐缓冲液(42.53克/升磷酸二氢钾、3.16克/升氢氧化钠)中的5克/升的可溶性Lintner淀粉。将样品加入25mM氯化钙中并根据在30℃进行阴性碘测试孵育所消耗的时间来测定其活性。活性以根据公式其中LU＝力规分单位(liquefouunit)V＝样品的体积(5ml)t＝糊精化时间(分钟)D＝稀释因子＝稀释体积/加入的酶量毫升或克数所计算的每克或每毫升力规分(LU)记录表III比活性(以AA20值的％表示)α-淀粉酶可溶性底物淀粉SpezymeAA20100100A4形式105115M15L(A4形式)9394M15L85103M197T(A4形式)7583M197T6281M197A(A4形式)8889M197C8585M197L(A4形式)5117实施例4变异体M15L的鉴定根据前面的实施例产生的变异体M15L没有表现出增加的淀粉酶活性(表III)而且仍被过氧化氢灭活(图7)。然而，它在淀粉喷射液化中确实表现出显著增加的效能，尤其是在低pH时，如下面表IV所示。典型地是利用一个在混和室后装有一个2.5升延迟旋管和一个末端返压阀的HydroheaterM103-M蒸气喷射器来进行淀粉的液化。通过一个Moyno泵将淀粉加入喷射器，蒸气通过一个150psi的蒸气线供应，并降低至90-100psi。温度探针被安装在Hydroheater喷射器之后和返压阀之前。淀粉匀浆由玉米湿法研磨机制备，并在两天内使用。用去离子水将淀粉稀释至预期的固形物水平，并用2％的NaOH或饱和Na2CO3调节淀粉的pH。典型的液化条件是淀粉32％-35％固形物钙离子40-50ppm(加入30即m)pH5.0-6.0α-淀粉酶12-14LU/g干淀粉以大约350ml/min的速率将淀粉引入喷射器。喷射器的温度被保持在105-107℃。将淀粉样品从喷射器加热器转至95℃第二阶段液化，并持续90分钟。在第二阶段液化作用后立即通过测定样品中的葡萄糖当量(DE)和检测原始淀粉的存在来评价淀粉液化的程度，这两种方法都是按照在《玉米精炼者协会成员公司标准分析方法》(StandardAnalyticalMethodsoftheMemberCompaniesoftheCornRefinersAssociation，Inc.)第六版中所描述的方法进行。在大体上是上面所给的条件和pH6.0条件下处理淀粉时，将产生一种DE大约为10的且没有原始淀粉的液化了的淀粉。利用本发明的突变体进行的淀粉液化测试结果在表IV中列出。表IV变异体M15L(A4形式)和M15L在淀粉液化中的效能pH90分钟后的DESpezymeAA205.99.9M15L(A4形式)5.910.4SpezymeAA205.21.2M15L(A4形式)5.22.2SpezymeAA205.99.3*M15L5.911.3*SpezymeAA205.53.25**M15L5.56.7*SpezymeAA205.20.7*M15L5.23.65***三次试验的平均值**两次试验的平均值实施例5M15X变异体的构建大体上按照上面实施例3中所描述的过程，在M15处的所有变异体(M15X)都是如在图12中所概括的通过盒式诱变在天然地衣芽孢杆菌中制备1)定点诱变(通过在M13中引物的延伸)被用于在M15密码子侧翼引入单一限制性位点，以便于插入一个诱变盒。特别是通过利用下面列出的两个寡核苷酸M15XBstB15′-GATGCAGTATTTCGAACTGGTATA-3′BstB1序列号48M15XMsc15′-TGCCCAATGATGGCCAACATTGGAAG-3′Msc1序列号4949引入在密码子11-13处的BstB1和在密码子18-20处的Msc1位点。2)然后通过从诱变了的淀粉酶(BstB1+，Msc1+)中将Sfi1-SstII片段通过亚克隆至质粒pBLapr中构建用于M15X盒式诱变的载体。然后用BstB1和Msc1消化所获得的质粒，并通过从聚丙烯酰胺凝胶中电洗脱分离大的载体片段。3)按照与产生M197X变异体一样的方法制备诱变盒。将合成的每个分别编码一种在15位密码子处的置换的寡聚物与一个共同的底链引物退火。通过盒子与载体适宜地连接使Msc1位点被破坏，这就允许通过这个位点的丧失来筛选阳性转化体。底链引物含有一个单一的SnaBI位点，这允许通过筛选SnabI位点而将由底链衍生来的转化体被清除。这个引物也含有一个读框移位，这也能清除由通用底链衍生的突变体淀粉酶的表达。合成的盒子在表V中列出，总的盒式诱变策略在图12中阐明。表V用于盒式诱变来产生M15X变异体的合成寡核苷酸M15A(BstB1)CGAATGGTATGCTCCCAATGACGG(Msc1)序列号50M15R(BstB1)CGAATGGTATCGCCCCAATGACGG(Msc1)序列号51M15N(BstB1)CGAATGGTATAATCCCAATGACGG(Msc1)序列号52M15D(BstB1)CGAATGGTATGATCCCAATGACGG(Msc1)序列号53M15H(BstB1)CGAATGGTATCACCCCAATGACGG(Msc1)序列号54M15K(BstB1)CGAATGGTATAAACCCAATGACGG(Msc1)序列号55M15P(BstB1)CGAATGGTATCCGCCCAATGACGG(Msc1)序列号56M15S(BstB1)CGAATGGTATTCTCCCAATGACGG(Msc1)序列号57M15T(BstB1)CGAATGGTACACTCCCAATGACGG(Msc1)序列号58M15V(BstB1)CGAATGGTATGTTCCCAATGACGG(Msc1)序列号59M15C(BstB1)CGAATGGTATTGTCCCAATGACGG(Msc1)序列号60M15Q(BstB1)CGAATGGTATCAACCCAATGACGG(Msc1)序列号61M15E(BstB1)CGAATGGTATGAACCCAATGACGG(Msc1)序列号62M15G(BstB1)CGAATGGTATGGTCCCAATGACGG(Msc1)序列号63M15I(BstB1)CGAATGGTATATTCCCAATGACGG(Msc1)序列号64M15F(BstB1)CGAATGGTATTTTCCCAATGACGG(Msc1)序列号65M15W(BstB1)CGAATGGTACTGGCCCAATGACGG(Msc1)序列号66M15Y(BstB1)CGAATGGTATTATCCCAATGACGG(Msc1)序列号67M15x(Msc1)CCGTCATTGGGACTACGTACCATT(BstB1)序列号68(底链)下划线表示在位点15处氨基酸的密码子改变。在某些情况下产生保守性置换来阻止新的限制性位点的引入。实施例6利用M15X变异体的桌面液化通过利用桌面液化系统与SpezymeAA20(购自GenencorIntermational，lnc.)在pH5.5时的液化作用相比，对按照实施例5制备的11种带有M15置换的α-淀粉酶变异体检测活性。桌面规模的液化系统由一个在距前端大约12英寸处装有一个7英寸长的静态混和元件和在后端装有一个30psi返压阀的不锈钢旋管(直径0.25英寸，容积大约350ml)组成。除两端外，旋管都浸于一装有温度控制加热元件的甘油-水浴中，保持浴器温度在105-106℃。通过搅拌保持悬浮状态的含有酶的淀粉匀浆经一个活塞驱动计量泵以大约70ml/min的速度注入反应旋管。淀粉从旋管的末端被回收，并被移入第二级反应(95℃90分钟)。第二级反应后，立即按照实施例4中描述的方法测定液化淀粉的DE。结果见图16。实施例7M197X变异体的鉴别正如在图9中可看到的，M197X(A4形式)变异体表达很大范围的淀粉酶活性(在可溶性底物检测中测定的)。通过用两倍容积的乙醇沉淀和重悬从上清中部分纯化淀粉酶。然后在pH5.0的醋酸盐缓冲液中在5mM氯化钙存在下通过加热至95℃5分钟来筛选它们的热稳定性；A4野生型在孵育后保持28％的活性。对于M197W和M197P，我们无法从上清中回收活性蛋白。经测序发现M197H变异体含有第二个突变，N190K。M197L在一独立的试验中被鉴定，它是热稳定性最低的变异体之一。在淀粉酶活性的表达和热稳定性之间似乎有一种广泛的相关性。在保持或提高热稳定性上，地衣芽孢杆菌淀粉酶被限定于在197位点上可容纳的残基在这些条件下优选半胱氨酸和苏氨酸来获得最高的热稳定性，而丙氨酸和异亮氨酸具有中等的稳定性。然而，在+197位点上其它的置换则导致可能在其它用途中有用的降低了的稳定性。另外，在+197位点上的不同的置换可能具有其它的有益的性质，如改变了的pH效能曲线或改变了的氧化稳定性。例如，M197C变异体被发现很容易被空气所氧化灭活，但却有提高了的热稳定性。相反地，与M197L变异体相比，M197T和M197A在pH5.0到pH10之间保持对过氧化物灭活作用的抗性(图7)同时，不仅保持有高的热稳定性(图10)，而且还保持有高的活性(表III)。实施例8在洗涤剂配方中的稳定性和效能在自动洗碗剂(ADD)基质中测定了M197T(A4形式)、M197T和M197A(A4形式)的稳定性。2ppmSarinaseTM(在ADD中被广泛使用的类型的蛋白酶，购自NovoIndustries)被加入两种商品化的含有漂白剂的ADD中CascadeTM(ProcterandGamble，Ltd.)和SunlightTM(Unilever)，追踪在65℃淀粉酶变异体和TermamylTM(一种购自NovoNordisk的热稳定α-淀粉酶，A/S)灭活的时间过程。在这两种情况下所用的ADD产品的浓度都等于“预浸泡”条件每升水(每加仑7克的硬度)中14克产品。正如可被看到的(图11a和11b)，M197A变异体的两种形式都比TermamylTm和M197T(A4形式)稳定的多，TermamylTM和M197A(A4形式)在第一个测试将要进行前便被灭活。如通过下面的方法确定的，这种稳定性的益处在淀粉存在或不存在时都可看到。淀粉酶被加到5mlADD和SavinaseTM中，在一试管中预热，旋振后，利用可溶性底物检测方法作为时间函数测定其活性。“+淀粉”试管有被烘烤到内表面的套管状淀粉(140℃，60分钟)。结果展示于图11a和11b中。实施例9M15X变异体的鉴定所有的M15X变异体在枯草芽孢杆菌中都被繁殖。所检测的其表达水平如图13所示。通过20-70％硫酸铵的切换将淀粉酶分离和部分纯化。按照实施例3测定这些变异体对可溶性底物的比活性(图14)。许多M15X淀粉酶具有比SpezymeAA20更高的比活性。在pH5的醋酸盐缓冲液中，在5mM氯化钙存在的条件下，通过将淀粉酶加热至90℃持续5分钟来对变异体进行桌面热稳定性检测(图15)。大部分的变异体和SpezymeAA20都进行了这个检测。那些在检测中表现出适当稳定性的变异体(适当的稳定性被定义为保持至少大约SpezymeAA20热稳定性60％的热稳定性)被用来测试其对淀粉的比活性和在pH5.5时的液化效能。那些变异体中最有趣的表现在图16中。M15D、N和T，与L一起在pH5.5条件下的液化作用中比SpezymeAA20表现出更高的效能，而且在可溶性底物和淀粉水解检测中都具有增加的比活性。总的来说，我们已经发现通过置换15位上的蛋氨酸可以使变异体具有增加了的低pH下的液化效能和/或增加了的比活性。实施例10对氧化作用的色氨酸敏感性氯胺-T(N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐)是一种选择性氧化剂，在中性或碱性pH下它可将蛋氨酸氧化为蛋氨酸亚砜。在酸性pH下，氯胺-T修饰蛋氨酸和色氨酸(Schechter，Y.，Burstein，Y.和Patchornik，A.(1975)《生物化学》(Biochemistry)14(20)4497-4503)。图17显示的是在pH8.0下氯胺-T对地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的灭活(AA20＝0.65mg/ml，M197A＝1.7mg/ml，M197L＝1.7mg/ml)。数据表明，通过将197位上的蛋氨酸改变为亮氨酸或异亮氨酸，α-淀粉酶的灭活可被阻止。相反，如图18所示，在pH4.0时，M197A和M197L的灭活仍继续，但需要更多当量的氯胺-T(图18，AA20＝0.22mg/ml，M197A＝4.3mg/ml，M197L＝0.53mg/ml；pH4.0的200mM醋酸钠)。这表明，一个色氨酸残基也参与氯胺-T介导的灭活作用。另外，胰酶图谱和随后的氨基酸序列分析表明在138位点上的色氨酸被氯胺-T氧化(资料未附)。为了证明这一点，按照下面提供的方法制备在138位上色氨酸的定点突变体。α-淀粉酶双突变体W138和M197的制备某些W138(F，Y和A)的变异体被制备成带有M197T的双突变体(按照实施例3公开的方法制备)。按照在实施例1和3中描述的方法制备双突变体。通常，DNA的单一负链是由从地衣芽孢杆菌α-淀粉酶M197T突变体的1.72kb编码序列(PstI-SstI)的一个M13MP18克隆制备。利用下面列出的引物进行定点诱变，除了T4基因32蛋白和T4聚合酶被用来置换klenow外基本上是通过Zoller，M.等《1983)的方法。为了鉴别这些带有适宜突变的克隆，引物都含有单一的位点和预期的突变。色氨酸138到苯丙氨酸133134135136137138139140141142143CACCTAATTAAAGCTTTCACACATTTTCATTTT序列号42HindIII色氨酸138到酪氨酸133134135136137138139140141142143CACCTAATTAAAGCTTACACACATTTTCATTTT序列号43HindIII色氨酸138到丙氨酸-这个引物也在138位的上游和下游构建单一位点。127128129130131132133134135136137138139140141142CCGCGTAATTTCCGGAGAACACCTAATTAAAGCCGCAACACATTTTCATBspEI143144145146147TTTCCCGGGCGCGGCAG序列号44XmaI通过限制性酶切分析鉴定突变体，并对W138F和W138Y利用DNA测序证实。W138A序列显示了一个在单一BspI和XmaI之间的核苷酸缺失，然而，其余的基因被测序是正确的。含有W138X和M197T突变的1.37kb的SstII/SstI片段被从M13MP18中移出并转入表达载体pBLapr，形成pBLapr(W138F，M197T)和pBLapr(W138Y，M197T)。含有单一BspEI和XmaI位点的片段被克隆到pBLapr(BspEI，XmaI，M197T)中，因为这对在138位置上含有其它氨基酸置换的克隆盒子是有帮助的。在138位氨基酸的单突变按照在前面实施例中描述的总的方法，制备某些W138(F，Y，L，H和C)的单突变体。在实施例7中的质粒pBLapr(W138X，M197T)上含有M197T突变的1.24kb的Asp718-SstI片段被在197位点上为蛋氨酸的野生型片段取代，结果产生pBLapr(W138F)、pBLapr(W138Y)和pBLapr(BspEI，XmaI)。利用下面的引物色氨酸138到亮氨酸CCGGAGAACACCTAATTAAAGCCCTAACACATTTTCATTTTC序列号45色氨酸138到组氨酸CCGGAGAACACCTAATTAAAGCCCACACACATTTTCATTTTC序列号46色氨酸138到半胱氨酸CCGGAGAACACCTAATTAAAGCCTGCACACATTTTCATTTTC序列号47通过将合成的盒子连接到pBLapr(BspEI，XmaI)载体中，制备出突变体W138L、W138H、和W138C。双突变体M197T/W138F和M197T/W138Y与氯胺-T的反应同野生型相比(AA20＝0.75mg/ml，M197T/138F＝0.64mg/ml，M197T/W138Y＝0.60mg/ml；pH5.0的50mM醋酸钠)。图19中所示的结果表明，色氨酸138的诱变导致变异体对氯胺-T的抗性更强。实施例11多突变体的制备按照实施例1、3、5和10的方法，制备如下的多突变体M15T/M197T；M15S/M197T；W138Y/M197T；M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T。这些多突变体中的一些曾被举例说明，例如在实施例10中W138Y/M197T的制备和测试。通过限制性酶切分析鉴定多突变体。在本发明范围内的各种多突变体被进一步测试其作为清洁剂(自动洗碗剂)的添加剂的效能。下面详细描述了这些测试。稳定性测试在硬度为7gpg的水中制备一含有过硼酸盐和TAED的4000ppm的自动洗碗剂(ADD)。将上面描述的某些淀粉酶突变体加入到这种ADD溶液中产生一个当利用Ceralpha方法(Megazyme(Austri.)Pty.Ltd.，Parramatta，NSW，澳大利亚)检测时为0.4的速率。将一系列样品在室温(21-23℃)下保持大约30分钟(未被加热)。将另一系列样品从室温加热至大约65℃(被加热)。在加入酶30分钟后测定淀粉酶突变体的活性，并计算与在加入时酶活性的相对活性(相对活性％)。图20所示的结果表明，为了在含有ADD+过硼酸盐+TAED的配方中的稳定性，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶在+197位点上的蛋氨酸应该被修饰。淀粉水解检测在硬度为7gpg的水中制备一含有过硼酸盐和TAED的4000ppm的自动洗碗剂(ADD)溶液并加入三块烹制过的弯形空心面。上面描述的淀粉酶突变体被加入到这种ADD溶液中以制备一终浓度为5ppm的活性酶。利用二硝基水杨酸法一葡萄糖标准曲线为对照测定试管在50℃孵育大约30分钟所释放出的还原糖的浓度。结果见表VI。表VI</tables></tables>表VI所示的结果表明，M15T/M197T、M15S/M197T、W138Y/M197T、M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T与不加酶和野生型α-淀粉酶对照相比效果更好。燕麦片污迹用一烹制过的混合的燕麦片糊将碟子均匀弄脏，并在37℃过夜烘干。将碟子放入一个ASKOModel770洗碗机中利用10g的含有5％过硼酸盐、3％TAED的自动洗碗剂和11mg某种淀粉酶在45℃以快洗周期进行洗涤。在弄脏前、弄脏后和清洗后都将碟子称重，计算从所有碟子上清除的脏污的平均％。数据见下面表VII。表VII</tables>这些数据表明，突变体酶提供了一个比由野生型提供的更大的效益。野生型淀粉酶在清除燕麦片中提供了比不加淀粉酶的ADD高20％的清洁效益。实施例12洗碗清洁剂组合物按照Korex自动化洗碗剂(KorexAutomaticDishwasherDetergent)配方制造1％(w/w)野生型和突变体淀粉酶颗粒，其中加有5％(w/w)单水过硼酸钠和3％(w/w)的TAED。将这些配方的样品置于室温(21-23℃)或在38℃和相对湿度80％的环境中4周。结果见图21和22所示。资料表明，在洗涤剂中通过Ceralpha方法测定的野生型淀粉酶活性随着储存时间的增加而降低。在室温下，突变体酶则非常稳定。在38℃和相对湿度80％的条件下，所有突变体都比野生型更稳定。用这些突变体淀粉酶配制自动化洗碗剂的优点是这些淀粉酶在过硼酸盐和TAED存在下显著地比野生型更稳定，并且它们在洗涤中为清除淀粉性食物污迹提供了一个重要的效能益处。实施例13氧化稳定蛋白酶/氧化稳定淀粉酶稳定性的研究将含有1)野生型蛋白酶和野生型淀粉酶，或者2)按照在USRe34606中描述的方法制备的漂白剂稳定蛋白酶(GG36-M222S)和漂白剂稳定淀粉酶(AA20-M15T/W138Y/M197T)的酶颗粒以每种酶12.5mg的量溶于含有pH10.2的0.1M硼酸钠和0.005％吐温80缓冲液中。向9ml这种溶液中加入1ml蒸馏水或1ml30％过氧化氢。将溶液置25℃孵育30分钟后，测定每种溶液中的蛋白酶和淀粉酶的活性，并以最初活性的％来记录。资料见下面表VIII。表VIII</tables>资料表明，在对氧化作用敏感的氨基酸残基上都有突变的一种漂白剂稳定淀粉酶突变体和一种漂白剂稳定蛋白酶突变体的联合使用，在对漂白剂的灭活作用有抗性的配方中提供蛋白酶和淀粉酶联合的益处。一种漂白剂稳定淀粉酶和一种漂白剂稳定蛋白酶的联合使用在漂白剂中30分钟后保持了它们大部分的初始活性，而野生型酶的联合使用则在同样的时间内失去80％以上的初始活性。实施例14淀粉酶变异体的比较活性曲线获得了淀粉酶变异体的活性曲线。将两个Phadebas片(Phadebas淀粉酶测试试剂盒，PharmaciaDiagnostics)溶于分别装有12毫升pH为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液(0.05硼酸盐/0.05M磷酸钾/0.005M氯化钙)的小瓶中来测定每种被测试酶的相对淀粉水解活性。在加入两片后，所得pH值分别为6.21、7.0、7.68、8.75、9.72和10.63。将每个小瓶通过磁力搅拌混匀，混匀时用移液器吸200ul放入一Costar聚苯乙烯96孔板中。酶样品从含有9.9mg/mlTermamyl(购自丹麦NovoNordisk的野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)、5.2mg/mlSpezymeAA20(购自加州南旧金山GenencorInternational，Inc.的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)或4.1mg/ml根据本发明的突变体淀粉酶(M15T/W138Y/M197T)的溶液中获得。每个样品在一淀粉酶检测缓冲液(pH6.7的50mM醋酸盐缓冲液、5mMCaCl2、0.002％吐温20)中被稀释到1/5000。用多通道移液器将10微升稀释后的酶加入底物溶液。用Ika-SchuttlerMTS2板振荡器以1100rpm30分钟将反应混合物混匀。用0.45微米亲水96孔过滤板(由Millipore的多筛选过滤系统提供，Bedford，Mass.)通过从含有酶和溶解了蓝色染料的上清中过滤不可溶的底物颗粒来中止反应。用一多通道移液器移走样品。每个只含有底物而没有酶的pH设立一个200微升的对照。从过滤后的上清中，再用多通道移液器从每个样品吸取100微升放入另一个Costar聚苯乙烯96孔板中，在620nm处读取光吸收值。通过活性百分比对孵育时间作图，结果见图23。如图23所示，与Termamyl或SpezymeAA20相比，根据本发明的突变体酶在从至少6到8.5之间的pH范围内具有更大的活性。实施例15淀粉酶对过乙酸的氧化稳定性在25℃将12.3微升淀粉酶稀释于装有977.7微升pH10.0的含0.1MCHES(2-n-环己基氨基乙烷-磺酸)和0.005M氯化钙的溶液的Eppendorf管中。通过旋振将样品混匀，移走10微升用来在麦芽糖庚糖上测定初活性。其余的980微升与10微升32％的过乙酸混和。测试过程中，将样品置于以甘油作为导热液体的加热器中孵育。测量反应管内部温度为52℃。反应过程中试管的盖子被密封。缓冲液的pH在52℃时约为9.3，这个值与在《酶学方法》(MethodsofEnzymology)87卷(1982)中报道的CHES缓冲液在较高温度时预期的pH位移一致。样品被旋匀，在0、15、30、45和60分钟时分别取出10微升进行活性检测。通过相对活性(基于向溶液中释放的水解的淀粉量)对pH值作图，结果显示于图24中。如图24所示，与Termamyl相比，在pH9.3下与氧化剂孵育时，根据本发明的突变体酶与其初活性相比保持一种特别高的活性百分比。实施例16在液体衣物洗涤剂中的比较淀粉酶清洗效能与商品化的野生型淀粉酶相比较，对根据发明的突变体淀粉酶在典型的液体衣物洗涤剂条件下的清洗效能进行了测试。将被玉米淀粉/墨汁弄脏的棉花样品PEPD7435WRL(从ScientificServicesS/D，Inc.，SparrowBush，N.Y.获得)用于测试淀粉酶添加剂的清洗效能。将油脂释放性TIDE浓缩洗涤剂(商品化的并购自Proctor&Gamble，CincinnatiOhio)加热至90℃一个小时来灭活存在的任何酶(如蛋白酶或脂肪酶)。所用的淀粉酶是Termamyl60T淀粉酶(购自丹麦NovoNordisk的野生型地衣芽孢杆菌淀粉酶)和本发明的淀粉酶，M15T/W138Y/M197T。对1.0克的液体洗涤剂和足以在最终清洗溶液中产生0.05、0.1、0.5或1.0ppm淀粉酶浓度的淀粉酶(Termamyl或M15T/W138Y/M197T)进行定量并放置备用。设立一不加淀粉酶的对照。洗涤测试是在一个Model7243STerg-o-tometer(美国测试公司(UnitedStatesTestingCo.)，Hoboken，N.J.)中进行。清洗液为加有10ml硬水浓缩物至100ppmCa2+离子和50ppmMg2+终浓度的蒸馏水。将1升清洗液加入每个Terg-o-tometer罐中。在清洗液达到适宜的温度时，打开搅拌器，并将洗涤剂和淀粉酶同时加入清洗液中。经3分钟溶解后，将棉花样品加入清洗液中。以100rpm搅拌15分钟后，关闭搅拌器并从Terg-o-tometer罐中取出棉花样品，放入洗衣机中用冷水漂洗10分钟。漂洗后，取出沾淀粉的棉花样品并压干。然后用一反射测试仪读取样品来测定清洁的量。在40℃和55℃都进行试验。通过以反射度的变化(仅用清洁剂标准化了的)对加入的淀粉酶的ppm作图，结果分别表现于图25和26。如在图25和26中所示，突变体淀粉酶在清洗能力上明显比商品化的淀粉酶表现得更出色。实施例17本发明的淀粉酶在液体洗涤剂中的洗涤效能联合应用两种商品化的液体洗涤剂组合物，SA8(购自AmwayCorp.，Ada，Michigan)和Purex(购自DialCorp.，Phoenix，Arizona)对根据本发明的突变体淀粉酶的洗涤效能进行测试。在清洗液中将突变体淀粉酶(M15T/W138Y/M197T)加至0.0，0.05，0.1，0.5，1.0和5.0ppm的终浓度。将SA8以0.75克/升的量加入清洗液使洗涤溶液的pH为6.5，温度为55℃。Purex以1.0克/升的量加入清洗液，使洗涤溶液的pH为9.0，温度为40℃。其它方面的洗涤程序按照实施例16进行。对样品进行检测以确定反射度的变化(仅同洗涤剂标准化了的)。在图27中给出结果。如在图27中可看到的，淀粉酶的加入显著改善了洗涤剂的清洗能力。序列表(1)一般信息(i)申请人GENENCORINTERNATIONAL，INC.(ii)发明目题一种改进的含有淀粉酶的衣物洗涤剂组合物(iii)序列数68(iv)联系地址(A)收信人GenencorInternational(B)街180Kimball路(C)城市南旧金山(D)州加州(E)国家美国(F)邮编94080(V)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBMPC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，版本#1.25(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Stone，ChristoDherL.(B)注册号35,696(C)参考/案卷号GC220-4(ix)通讯信息(A)电话(415)742-7555(B)传真(415)742-7217(2)序列号1的资料(i)序列特征(A)长度56个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号1GATCAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT56(2)序列号2的资料(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号2TGGGACGCTGGCGCAGTACTTTGAATGGT29(2)序列号3的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号3TGATGCAGTACTTTGAATGGTACCTGCCCAATGA34(2)序列号4的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号4GATTATTTGTTGTATGCCGATATCGACTATGACCAT36(2)序列号5的资料(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号5CGGGGAAGGAGGCCTTTACGGTAGCT26(2)序列号6的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号6GCGGCTATGACTTAAGGAAATTGC24(2)序列号7的资料(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号7CTACGGGGATGCATACGGGACGA23(2)序列号8的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号8CTACGGGGATTACTACGGGACCAAGGGAGACTCCC35(2)序列号9的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号9CCGGTGGGGCCAAGCGGGCCTATGTTGGCCGGCAAA36(2)序列号10的资料(i)序列特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号10CATCAGCGTCCCATTAAGATTTGCAGCCTGCGCAGACATGTTGCT45(2)序列号11的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号11GATTATTTGGCGTATGCCGATATCGACTATGACCAT36(2)序列号12的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号12GGGAAGTTTCGAATGAAAACG21(2)序列号13的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号13GTCGGCATATGCATATAATCATAGTTGCCGTTTTCATT38(2)序列号14的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号14CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATCTATGCCGAC41(2)序列号15的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号15CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTTCTATGCCGAC41(2)序列号16的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号16CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGTTTATGCCGAC41(2)序列号17的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号17CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAGCTATGCCGAC41(2)序列号18的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号18CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCCTTATGCCGAC41(2)序列号19的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号19CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGACATATGCCGAC41(2)序列号20的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号20CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTACTATGCCGAC41(2)序列号21的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号21CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCACTATGCCGAC41(2)序列号22的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号22CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGGCTATGCCGAC41(2)序列号23的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号23CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCAATATGCCGAC41(2)序列号24的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号24CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAACTATGCCGAC41(2)序列号25的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号25GCAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAAATATGCCGAC41(2)序列号26的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)成链类型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(xi)序列描述序列号26CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTG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