专利名称：一种胶原蛋白膜的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种胶原蛋白膜的制备方法和用途。
背景技术：
胶原是一种天然蛋白质，广泛存在于动物的皮肤、骨、软骨、牙齿、肌腱韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护肌体的功能。胶原一般是白色透明、无分支的原纤维，主要存在于生皮中，其次存在于骨头中。胶原蛋白家庭包括19种胶原蛋白及10种以上胶原样蛋白，它们由三条左手螺旋的多肽链缠绕、右旋、形成绳索样右手超螺旋结构，其I级结构的共同特点为每间隔两个氨基酸存在一个甘氨酸，Y-Gly-X-Y—序列中，X及Y位置分别为脯氨酸及羟脯氨酸，以限制多肽链旋转，三螺旋结构常有 4-羟脯氨酸，产生氢键及氧桥，使结构相对牢固，通常还有球状序列插入，使胶原分子更有弹性。胶原具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使骨、腰、软骨和皮肤具有一定的机械强度，胶原因其弱的抗原性和良好的生物相容性，在烧伤、创伤、 眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域用途广泛。
胶原蛋白的制备方法众多，如，吹膜技术、冻干技术、电流体动力学技术等。随着纳米技术的迅速发展，采用电流体动力学(Electrohydrodynamics)射流技术成为研究热点之一，电流体动力学射流过程中，在喷头与接收装置之间建立一个高压静电场，当电场强度超过临界值时，喷头处流出的聚合物溶液或熔体在电场力作用下克服自身的表面张力形成一股带电喷射细流。由于静电排斥作用，带电细流发生高速弯曲或鞭动，随着溶剂挥发或熔体冷却，最终落在接收装置上形成纤维膜或粒子簇。根据产物形貌的区别，可将静电射流分为静电纺丝(简称电纺，Electrospinning)和静电喷雾(简称电喷，Electrospraying)两种形式。
Jamil A. Matthews et al. , “Electrospinning of Collagen Nanofibers，，，Bio macromolecules, 2002, 3(2) :232 238公开了一种利用静电纺丝制备胶原膜的方法取I型胶原，采用六氟异丙醇溶解，得浓度为83mg/ml的胶原六氟异丙醇溶液；再取Iml玻璃注射器连接针头，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连，推进速度为5. Oml/ h，取20(宽)X30 (长)大小的铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为 12. 5cm;设置电压为25. 0KV，进行静电纺丝，制备得到了胶原蛋白膜。但是，该方法制备的胶原蛋白膜力学性能差，制备的胶原蛋白厚度仅为187 μ m，难以满足实际应用的需要。
很多研究者为提高胶原蛋白纤维的强度和模量，对胶原蛋白进行改性或加入其它材料，增加其力学性能，如在胶原的酸性溶液中加入了聚环氧乙烷(ΡΕ0)，利用静电纺丝制备了胶原/PEO共混纳米纤维，纤维直径在100 150nm之间。由于PEO与胶原之间的相互作用，纤维具有较好的力学性能；然而引入其他高分子材料，使其在应用方面会有诸多限制，同时也大大降低了胶原膜使用的安全性 ；另外，申请号200910209509. 6，发明名称 “胶原超细纤维膜材料的制备方法”的专利申请文件中报道利用磷酸盐和无水乙醇混合液作为胶原电纺液，尽管从技术上能实现胶原的可纺性，但是后期不容易脱盐，不仅增加了生产成本，同时在应用方面也会受限。发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种用静电纺丝技术制备纳米胶原蛋白膜的新方法，还提供了一种双层纳米胶原蛋白膜的制备方法，以及前述方法制备的胶原蛋白膜及其用途。
本发明纳米胶原蛋白膜的制备方法，包括如下步骤
(I)取胶原蛋白溶于六氟异丙醇中，得8(Tl20mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液；
(2)取步骤(I)的胶原蛋白六氟异丙醇溶液进行静电纺丝，电压为15 19KV，接收距离12. 5 15cm，推进速度为O. 5^1. 2ml/h，挥去六氟异丙醇，即得纳米胶原蛋白膜。
优选地,步骤(I)所述胶原蛋白六氟异丙醇溶液的浓度为110mg/m ;步骤(2)所述电压为16KV，接收距离12. 5cm，推进速度为1. 2ml/h。
进一步优选地,包括如下步骤
(I)取胶原蛋白，加入六氟异丙醇，25°C搅拌至溶液澄清透明，配制浓度为IlOmg/ ml的胶原蛋白六氟异丙醇溶液；
(2)取玻璃注射器分次吸取步骤(I)的胶原蛋白六氟异丙醇溶液，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连，推进速度为1. 2ml/h，取铝箔固定在平板接收器， 将其接地，设置其与针头的距离为12. 5cm ;设置电压为16. 0KV，进行静电纺丝，在25°C真空干燥，将电纺膜从铝箔上取下，即得纳米胶原蛋白膜。
本发明双层胶原蛋白膜的制备方法，包括如下步骤
①按照前述方法制备纳米胶原蛋白膜；
②取胶原蛋白，采用吹膜技术或者静电喷雾技术在步骤①的胶原蛋白膜表面制备另一层胶原蛋白膜，得双层胶原蛋白膜。
其中，所述静电喷雾技术包括如下步骤
a、取胶原蛋白，溶于六氟异丙醇中，得5(Tl20mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液；
b、取步骤a的胶原蛋白六氟异丙醇溶液进行静电喷雾，喷于步骤①的纳米胶原蛋白膜表面，电压为15 19KV，接收距离12. 5 15cm，推进速度为O. 5^1. 2ml/h，挥去六氟异丙醇，即得双层胶原蛋白膜。
其中，步骤a所述胶原蛋白六氟异丙醇溶液的浓度为50mg/ml ;步骤b所述电压为 16KV，接收距离12. 5cm，推进速度为1. 2ml/h。
所述吹膜技术是制备胶原蛋白膜的常规技术，如张焰等，“重建胶原纤维对细胞的影响”，中国组织工程研究与临床修复，
12(41). 8095-8098. 2008公开的方法；也可以采用如下方法
取胶原蛋白溶于六氟异丙醇中，得O. 01-80mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液，置于前述方法制备的胶原蛋白膜表面，干燥，干燥温度为4°C 37°C，干燥时间为4 48h，即得双层胶原蛋白膜。优选地，胶原蛋白溶液的浓度为O. 01-80mg/ml ;干燥温度为20°C 26°C，干燥时间为8 24h。
其中，所述胶原蛋白是I型或III型胶原蛋白。
其中，所述胶原蛋白来源于天然活性胶原或重建活性胶原。
其中，所述胶原蛋白来源于水生物或其他哺乳类动物。
其中，所述胶原蛋白来源于牛或者猪。
本发明还提供了前述方法制备的胶原蛋白膜。
本发明还提供了上述的胶原蛋白膜在制备修复创面、止血的药物或保健品中的用途。
本发明还提供了上述的胶原蛋白膜在制备组织工程体内植入胶原膜中的用途。
本发明以六氟异丙醇为溶剂，通过对静电纺丝工艺的改进，制备得到单层纳米胶原蛋白膜和双层胶原蛋白膜，其力学性能显著优于现有胶原蛋白膜，厚度最高可达 2000 μ m,是现有纳米胶原蛋白厚度的10. 7倍，显著优于现有方法制备的纳米胶原蛋白膜， 无细胞毒性，溶血性和抗原性低，能促进细胞增殖，可用于牙科、骨科、皮肤科等多个医学领域。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1胶原电纺膜照片
图2扫描电镜下的胶原纳米纤维
图3胶原电纺+电喷双层膜照片
图4细胞增殖试验结果
图5豚鼠致敏试验局部注射点
图6豚鼠致敏试验结果(生理盐水)
图7豚鼠致敏试验(实施例2胶原膜浸提液)具体实施方式
静电纺丝设备型号NS LAB200，市售。
静电喷雾设备型号SS_1332Ucalery，市售。
实施例1本发明纳米胶原蛋白膜的制备方法
1、制备方法
(I)精确称量胶原海绵1. 3531g，放入小烧杯中，吸取12. 3ml六氟异丙醇溶液加入到小烧杯中，25°C在磁力搅拌器上搅拌约6小时至溶液澄清透明，配制浓度为110mg/ml 的胶原六氟异丙醇溶液；
(2)取5ml玻璃注射器分次吸取12ml六氟异丙醇溶液，连接针头，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连，推进速度为1.2 ml/h，取20(宽)X30 (长)大小的铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为12. 5cm ;设置电压为16. OKV, 进行静电纺丝，在25°C真空干燥箱干燥2小时，将胶原纤维电纺膜从铝箔上取下，即得纳米胶原蛋白膜。
用千分尺测量所得胶原蛋白膜，厚度达到163μ m ;如图1所示，质地柔软，韧性好，易剪裁，能满足不同的临床需求；如图2所示，扫描电镜测定其纳米直径约为200nm。
本发明中的原料胶原蛋白来源较为广泛，可以来源于水生物或牛、猪等或其他哺乳类动物，也可以是重建胶原，其重建胶原是通过生物化学反应去掉两边端肽，重建纤维的可溶性胶原如ZL200810045663.1中提到的。
实施例2本发明双层胶原蛋白膜的制备方法
将实施例1所获得的纳米胶原电纺膜，固定在平板接收器上；
配置浓度为50mg/ml的胶原六氟异丙醇溶液,取5ml玻璃注射器分次吸取六氟异丙醇溶液胶原溶液，连接针头，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连， 推进速度为1.2ml/h，取20(宽)X30 (长)大小的铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为12. 5cm;设置电压为16. 0KV，利用电喷工艺喷涂胶原六氟异丙醇溶液， 使其在胶原电纺膜上形成一层纳米颗粒，在25°C真空干燥箱干燥2小时，即可；
在电镜下可见其胶原膜为双层膜，并且电喷形成的胶原颗粒填补了电纺形成的胶原膜空隙，减小了电纺胶原膜的孔隙率，使该双层胶原膜具有一面粗糙，一面光滑的效果， 从而更有利于引导单侧细胞再生。
测定发现,该双层胶原膜厚度为164. 5um。
实施例3本发明双层胶原蛋白膜的制备方法
将实施例1所获得的纳 米胶原电纺膜，固定在平板接收器上；
配置浓度为80mg/ml的胶原六氟异丙醇溶液,取5ml玻璃注射器分次吸取六氟异丙醇溶液胶原溶液，连接针头，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连， 推进速度为O. 5ml/h，取20(宽)X30 (长)大小的铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为12. 5cm;设置电压为15. 0KV，利用电喷工艺喷涂胶原六氟异丙醇溶液， 使其在胶原电纺膜上形成一层纳米颗粒，在25°C真空干燥箱干燥2小时，即可。
实施例4本发明双层胶 原蛋白膜的制备方法
将实施例1所获得的纳米胶原电纺膜，固定在平板接收器上；
配置浓度为120mg/ml的胶原六氟异丙醇溶液，取5ml玻璃注射器分次吸取六氟异丙醇溶液胶原溶液，连接针头，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连， 推进速度为O. 8ml/h，取20(宽)X 30 (长)大小的铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为15cm;设置电压为19. 0KV，利用电喷工艺喷涂胶原六氟异丙醇溶液，使其在胶原电纺膜上形成一层纳米颗粒，在25°C真空干燥箱干燥2小时，即可。
实施例5本发明双层胶原蛋白膜的制备方法
将实施例1所获得的胶原蛋白膜，放置于洁净台上；
配置浓度为50mg/ml的胶原六氟异丙醇溶液，置于前述方法制备的胶原蛋白膜表面，干燥，干燥温度为4°C °C，干燥时间为48h，在胶原蛋白膜上形成一层胶原膜，挥干六氟异丙醇，形成胶原双层膜。
测定发现，该双层I父原I吴厚度为230um。
实施例6本发明单层纳米胶原蛋白膜制备方法的参数筛选试验
1、实验方法
按照实施例1所述方法制备胶原蛋白膜，其中，胶原蛋白六氟异丙醇溶液浓度、静电纺丝方法的电压、接收距离和推进速度如表I所示
表I参数筛选
权利要求
1.一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)取胶原蛋白溶于六氟异丙醇中，制得8(Tl20mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液；(2)用步骤(I)的胶原蛋白六氟异丙醇溶液进行静电纺丝，电压为15 19KV，接收距离为12. 5 15cm，推进速度为O. 5^1. 2ml/h，挥去六氟异丙醇，即得纳米胶原蛋白膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(I)所述胶原蛋白六氟异丙醇溶液的浓度为110mg/ml ；步骤(2)所述电压为16KV，接收距离12. 5cm，推进速度为1. 2ml/h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)取胶原蛋白，加入六氟异丙醇中，25°C搅拌至溶液澄清透明，配制浓度为110mg/ml 的胶原蛋白六氟异丙醇溶液；(2)用玻璃注射器分次吸取步骤(I)的胶原蛋白六氟异丙醇溶液，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连，推进速度为1. 2ml/h，取铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为12. 5cm ;设置电压为16. 0KV，进行静电纺丝，在25°C真空干燥，将电纺膜从铝箔上取下，即得纳米胶原蛋白膜。
4.一种双层胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤①按照权利要求Γ3任意一项所述方法制备纳米胶原蛋白膜；②取胶原蛋白，采用吹膜技术或者静电喷雾技术在步骤①的纳米胶原蛋白膜表面制备另一层胶原蛋白膜，得双层胶原蛋白膜。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述静电喷雾技术包括如下步骤a、取胶原蛋白溶于六氟异丙醇中，制得5(Tl20mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液；b、取步骤a的胶原蛋白六氟异丙醇溶液进行静电喷雾，喷于步骤①的纳米胶原蛋白膜表面，电压为15 19KV，接收距离12. 5 15cm，推进速度为O. 5^1. 2ml/h，挥去六氟异丙醇，即得双层胶原蛋白膜。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤a所述胶原蛋白六氟异丙醇溶液的浓度为50mg/ml ；步骤b所述电压为16KV，接收距离12. 5cm，推进速度为1. 2ml/h。
7.根据权利要求Γ6任意一项所述的方法，其特征在于所述胶原蛋白是I型或III型胶原蛋白；所述胶原蛋白来源于天然活性胶原或重建活性胶原；所述胶原蛋白来源于水生物或其他哺乳类动物。
8.根据权利要求7所述的纳米胶原蛋白膜，其特征在于所述胶原蛋白来源于牛或者猪。
9.权利要求Γ8任意一项方法制备的胶原蛋白膜。
10.权利要求9所述的胶原蛋白膜在制备修复创面、止血的药物或保健品中的用途。
11.权利要求9所述的胶原蛋白膜在制备组织工程体内植入胶原膜中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，包括如下步骤(1)取胶原蛋白溶于六氟异丙醇中，得80~120mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液；(2)取步骤(1)的胶原蛋白六氟异丙醇溶液进行静电纺丝，电压为15~19KV，接收距离12.5~15cm，推进速度为0.5~1.2ml/h，挥去六氟异丙醇，即得纳米胶原蛋白膜。本发明还公开了双层胶原蛋白膜的制备方法与制备得到的胶原蛋白膜及其用途。本发明胶原蛋白膜力学性能优良，无细胞毒性，溶血性和抗原性低，生物活性高。
文档编号D04H13/00GK103046225SQ20131001755
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月17日 优先权日2012年1月19日
发明者孙莉嫚, 彭红卫, 陈春会, 李好雨, 刘富俊, 张风豪, 朱小舟 申请人:苏州达普生物技术有限公司