一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，包括：将丝素蛋白Silk和乳酸-己内酯共聚物溶于溶剂中，溶解搅拌，得到溶液，然后加入聚苯胺PANi和樟脑磺酸，搅拌混匀，得到皮层静电纺丝溶液；将神经生长因子NGF完全溶解在超纯水中，得到芯层静电纺丝溶液；将皮层静电纺丝溶液、芯层静电纺丝溶液分别装入注射器中，进行同轴静电纺丝，然后熏蒸处理，真空干燥，即得导电型神经组织工程支架。本发明制备出的纳米纤维支架从外加电刺激导电高分子，生物化学神经生长因子以及神经再生所需的拓扑结构取向引导等途径促进神经修复速度。本发明方法操作简单，可重复性好，经济效益高，为临床中遇到的神经缺损修复提供新的实验思路。
【专利说明】一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于神经缺损修复涉及生物材料制备领域，特别涉及一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法。
【背景技术】
[0002]周围神经的再生以及功能的恢复一直是困扰临床的一个难题，每年全世界都有大量的患者需要进行神经修复。到目前为止，最常采用的方法是自体神经移植来治疗神经断裂或者缺损。但是，自体神经可供移植的来源非常有限。此外在显微外科手术中很难避免神经纤维的错向对接，从而影响神经功能的恢复。近年来随着组织工程的逐步发展，利用生物材料构建的神经再生导管，为临床神经缺损修复带来了希望。
[0003]然而周围神经再生不仅要恢复其结构，更重要的是恢复其对靶器官的支配功能，为了达到或超过自体神经移植的修复效果，近年来研究者们不断致力可控制的活性复合神经导管的制备。众所周知，神经传导的根本在于神经纤维上膜电位的变化，神经传导即为电信号的传导，近几年来有很多文献报道电刺激可以促进并引导神经细胞迁移。同时，神经生长因子(nerve growth factor, NGF)也可以对运动神经的再生起促进作用，至目前为止,未见有基于同轴静电纺丝技术制备一种负载神经生长因子(NGF)导电型神经组织工程支架的报道。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，本发明的优点在于巧妙的利用同轴静电纺丝技术，得到导电缓释型纳米纤维神经导管，其生物相容性好，能够引导神经细胞沿着取向生长，加速神经轴突的延伸，促进受损神经再生修复；本方法操作简单，可重复性好，经济效益。
[0005]本发明的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，包括:
[0006](I)将质量比为25-50:75-50的丝素蛋白和乳酸-己内酯共聚物溶于溶剂中，溶解搅拌，得到质量体积百分比为8-10%的溶液，然后加入质量比为1:1的聚苯胺PANi和樟脑磺酸，搅拌混匀，得到皮层静电纺丝溶液；
[0007](2)将神经生长因子NGF完全溶解在超纯水中，得到芯层静电纺丝溶液；
[0008](3)将皮层静电纺丝溶液、芯层静电纺丝溶液分别装入注射器中，进行同轴静电纺丝，然后熏蒸处理，真空干燥，即得导电缓释型神经组织工程支架。
[0009]所述步骤(I)中乳酸-己内酯共聚物的分子量为Mn?30万，乳酸-己内酯的比例为50:50，聚苯胺PANi的分子量Mn ^ 1.5万。
[0010]所述步骤⑴中溶剂为六氟异丙醇。
[0011]所述步骤⑴中溶解搅拌时间为5-6h，加入聚苯胺PANi和樟脑磺酸，搅拌均匀时间为24-48h，搅拌速率均为200-300r/min。
[0012]所述步骤(I)中樟脑磺酸可以使聚苯胺具有导电特性。
[0013]所述步骤(I)中皮层静电纺丝溶液中聚苯胺PANi的质量体积百分比为1.2-1.6%。
[0014]所述步骤(2)中超纯水配制的神经生子因子(NGF)溶液需现配现用，避免长时间放置影响其活性。
[0015]所述步骤⑵中芯层静电纺丝溶液中神经生长因子NGF的浓度为10 μ g/ml。
[0016]所述步骤(3)中同轴静电纺丝工艺具体为:皮层静电纺丝溶液装入注射器中，在微量推进泵的作用下进入同轴装置复合毛细喷头的内外毛细喷丝口之间的环状空隙处；将芯层静电纺丝溶液装入注射器，在微量注射泵的作用动下进入同轴装置复合毛细喷头的内毛细喷丝头，开启静电压发生器，推进泵，以及滚筒接收装置的电机，进行纺丝。
[0017]所述喷丝口为同心轴的复合毛细管，所制备的纳米纤维具有“芯-壳”结构。
[0018]所述步骤(3)中同轴静电纺丝工艺参数为:纺丝喷头为内层为8号外层为16号的同心轴喷丝头；注射泵的推进速度分别为芯层0.2ml/h和壳层1.0ml/h ;在同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间接入的调节电压为12-13kV ;同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间的距离为5-6cm ;滚筒电机提供给滚筒的转速为4000r/min。
[0019]所述步骤(3)中熏蒸处理为乙醇进行熏蒸处理。
[0020]所述乙醇的体积百分数为75%，熏蒸处理时间为24_48h。
[0021]所述步骤(3)中真空干燥时间为48_72h。
[0022]本发明的取向纳米纤维支架由负载神经生长因子(NGF)的同轴静电纺纳米纤维所构成，神经生长因子(NGF)位于纳米纤维的芯层，导电物质位于纳米纤维的皮层，纳米纤维呈现“芯-壳”结构，神经生长因子(NGF)在神经修复过程中缓慢释放，取向结构为神经细胞增殖提供良好的微环境，外加电刺激可以促进神经轴突的延伸，三者的协同作用从而加速神经修复速度；该发明制备装置简易、控制参数较少、所制得的神经支架具有良好的细胞相容性，有望在下一步的临床中得到应用。
[0023]本发明制备出的纳米纤维支架从外加电刺激(导电高分子)，生物化学(神经生长因子)以及神经再生所需的拓扑结构(取向引导)等途径促进神经修复速度，研究外加电刺激，神经生长的缓释，以及取向结构三者对神经再生的协同作用。
[0024]有益.效果
[0025](I)本发明的优点在于巧妙的利用同轴静电纺丝技术，得到导电缓释型纳米纤维神经导管，其生物相容性好，能够引导神经细胞沿着取向生长，加速神经轴突的延伸，促进受损神经再生修复；
[0026](2)本方法操作简单，可重复性好，经济效益高。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1静电纺丝接收装置示意图；
[0028]图2为丝素蛋白和乳酸-己内酯共聚物的纺丝液中加入导电材料聚苯胺后所的支架的颜色变化；
[0029]图3负载NGF的纳米纤维透射电镜照片(A)及NGF在纳米纤维中分布的激光共聚焦照片⑶；
[0030]图4负载NGF的纳米纤维的扫描电镜照片；
[0031]图5大鼠肾上腺嗜铬神经瘤细胞(PC-12)在支架上轴突的生长情况:在未加电刺激条件下，未负载神经生长因子的激光共聚焦照片(A)及负载神经生长因子的激光共聚焦照片(B);在外加电刺激条件下(沿取向方向施加lOOmV/cm的电压)，未负载神经生长因子的激光共聚焦照片(C)及负载神经生长因子的激光共聚焦照片(D)；
[0032]图6为导电型支架的循环伏安曲线图及拟合方程。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0034]实施例1
[0035]称取蛋白丝素0.lg，乳酸-己内酯共聚物0.3g，溶于5ml六氟异丙醇(HFIP)^L酸-己内酯共聚物分子量为Mw?30万，以200r/min.的速率磁力搅拌5小时混合均匀得到总浓度8% (w/v)的溶液；混合均勻后分别加入60mg的聚苯胺(Mn?1.5万)和樟脑磺酸，再以300r/min.的速率磁力搅拌48h混合均勻制得皮层静电纺溶液,取10 μ g/ml的神经生长因子(NGF)超纯水溶液Iml作为芯层静电纺溶液。将壳层静电纺丝溶液装入注射器，微量注射泵的推进速度控制为lml/h，将芯层静电纺丝溶液装入另一个注射器，微量注射泵的推进速度控制为0.2ml/h。同轴静电纺丝所用的同心轴芯层溶液通过的针头为8号针头，壳层溶液通过的针头为16号针头，针头与12kV的高压相连。用铝箔平整包缠的直径为5cm的滚筒接收纳米纤维丝，，电机控制滚筒转速4000r/min.，同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间的距离为5cm，5h后铝箔上接收到一定厚度的取向纳米纤维膜。上述支架取下后放入密闭容器，用体积分数75%的乙醇进行蒸汽处理24h，处理完毕后真空干燥48h，去除残留溶剂。在上述支架上种植大鼠肾上腺嗜铬神经瘤细胞(PC-12)，并沿纤维取向方向施加100mV/cm的电刺激。结果表明:在未电击的情况下，未负载与负载神经生长因子的支架上细胞的中间轴突长度分别为0.04 μ m和13.9 μ m ;在点击的情况下，未负载与负载神经生长因子的支架上细胞的中间轴突长度分别为7.5 μ m和19.7 μ m。
[0036]实施例2
[0037]称取蛋白丝素0.125g,乳酸-己内酯共聚物0.375g,溶于5ml六氟异丙醇(HFIP),乳酸-己内酯共聚物分子量为Mw?30万，以200r/min.的速率磁力搅拌5小时混合均勻得到总浓度10% (w/v)的溶液；混合均勻后分别加入80mg的聚苯胺(Mn?1.5万)和樟脑磺酸，再以300r/min.的速率磁力搅拌48h混合均勻制得皮层静电纺溶液,取10 μ g/ml的神经生长因子(NGF)超纯水溶液Iml作为芯层静电纺溶液。将壳层静电纺丝溶液装入注射器，微量注射泵的推进速度控制为lml/h，将芯层静电纺丝溶液装入另一个注射器，微量注射泵的推进速度控制为0.2ml/h。同轴静电纺丝所用的同心轴芯层溶液通过的针头为8号针头，壳层溶液通过的针头为16号针头，针头与13kV的高压相连。用铝箔平整包缠的直径为5cm的滚筒接收纳米纤维丝，电机控制滚筒转速4000r/min.，同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间的距离为6cm，5h后铝箔上接收到一定厚度的取向纳米纤维膜。上述支架取下后采用放入密闭容器、用体积分数75%的乙醇进行蒸汽处理48h，处理完毕后真空干燥72h， 去除残留溶剂。
【权利要求】
1.一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，包括: (1)将质量比为25-50:75-50的丝素蛋白和乳酸-己内酯共聚物共混物溶于溶剂中，完全溶解搅拌均匀后得到质量体积百分比为8-10%的溶液，然后加入质量比为1:1的聚苯胺PANi和樟脑磺酸，搅拌混匀，得到皮层静电纺丝溶液； (2)将神经生长因子NGF完全溶解在超纯水中，得到芯层静电纺丝溶液； (3)将将皮层静电纺丝溶液、芯层静电纺丝溶液分别装入注射器中，进行同轴静电纺丝，然后熏蒸处理，真空干燥，即得导电缓释型神经组织工程支架。
2.根据权利要求1所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中乳酸-己内酯共聚物的分子量为Mn ^ 30万，聚苯胺的分子量Mn?1.5万。
3.根据权利要求1所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中溶解搅拌时间为5-6h，加入聚苯胺PANi和樟脑磺酸，搅拌均匀时间为24-48h，搅拌速率均为 200-300r/min。
4.根据权利要求1所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中皮层静电纺丝溶液中聚苯胺PANi的质量体积百分比为1.2-1.6%。
5.根据权利要求1所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中芯层静电纺丝溶液中神经生长因子NGF的浓度为10μ g/ml。
6.根据权利要求1所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中同轴静电纺丝工艺具体为:皮层静电纺丝溶液装入注射器中，在微量推进泵的作用下进入同轴装置复合毛细喷头的内外毛细喷丝口之间的环状空隙处；将芯层静电纺丝溶液装入注射器，在微量注射泵的作用动下进入同轴装置复合毛细喷头的内毛细喷丝头，开启静电压发生器，推进泵，以及滚筒接收装置的电机，进行纺丝。
7.根据权利要求1所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中同轴静电纺丝工艺参数为:纺丝喷头为内层为8号外层为16号的同心轴喷丝头；注射泵的推进速度分别为芯层0.2ml/h和壳层1.0ml/h ;在同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间接入的调节电压为12_13kV ;同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间的距离为5-6cm ;滚筒电机提供给滚筒的转速为4000r/min。
8.根据权利要求1所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中熏蒸处理为乙醇进行熏蒸处理。
9.根据权利要求8所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，其特征在于:所述乙醇的体积百分数为75%，熏蒸处理时间为24-48h。
10.根据权利要求1所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中真空干燥时间为48-72h。
【文档编号】D01D5/00GK104225685SQ201410478759
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】莫秀梅, 张建光, 孙彬彬, 宋炜 申请人:东华大学