一种负载亚精胺的生物活性膜及其静电纺丝制备方法与流程

本发明属于生物活性膜领域，具体涉及一种负载亚精胺的生物活性膜及其静电纺丝制备方法。

背景技术：

仿生化设计是生物制造领域近年来的一种发展趋势，原理在于借助天然生物活性分子实现更好的生物相容性和生理功能。哺乳动物受精过程中，雄性精子必须克服雌性的排异反应，方能与卵子结合。亚精胺最初是从精液中分离得到的一种多胺化合物，具有抗排异、抗氧化、抑制炎症、抑制细胞坏死、延长个体寿命等作用，因此，利用仿生思想，将亚精胺用于人工皮肤及其它人工组织和器官可能为生物制造领域排异炎症反应的解决提供一个新思路。

静电纺丝是指在高压静电场下，使带电荷的高分子溶液或熔体流动和变形，后经溶剂挥发或熔体冷却，得到连续纤维的加工技术，是目前得到纳米纤维的基本方法。静电纺丝纤维具有纤维直径小，比表面积大，具有多孔结构等显著特点。由于静电纺丝纤维薄膜具有高的表面积和孔隙率，可作为种子细胞支架材料，模仿细胞外基质的结构和功能，为细胞提供结构支撑，引导组织再生。人体细胞能够在纳米纤维周围有机结合，起到模板作用，有利于细胞粘附。一些新型聚合物和生物来源的聚合物制得的静电纺丝纳米纤维薄膜，可应用于创伤修复、药物传递、组织工程、人造器官等方面。有研究发现细胞在纳米纤维薄膜上的生长，可直接用于治疗创伤和皮肤的烧伤问题。

基于静电纺丝技术，获得纺丝薄膜，引入具有良好生物活性的亚精胺，便可获得生物学性能良好的薄膜。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种负载亚精胺的生物活性膜及其静电纺丝制备方法，其是基于静电纺丝技术，引入具有良好生物活性的亚精胺分子，获得生物学性能良好的一种新型薄膜。

本发明所述的一种负载亚精胺的生物活性膜的静电纺丝制备方法(方法一，亚精胺的负载方式为物理混合)，其步骤如下：

1)纺丝液的配制：取助纺剂聚乙烯醇、多糖及其衍生物(如壳聚糖、甲壳素、纤维素、糖胺聚糖或硫酸软骨素等)、胶原蛋白、亚精胺于稀乙酸水溶液中，然后在50～80℃水浴、转速500～1000r/min的条件下加热搅拌0.5～1h，直至全部溶解，再超声除去气泡，室温下静置1～3h，得到纺丝液；得到的纺丝液中，助纺剂的质量分数为6％～10％，多糖及其衍生物的质量分数为1％～3％，胶原蛋白的质量分数为6％～10％，亚精胺的质量分数0.1％～5％；

2)用注射器吸取适量纺丝液，调节注射器金属针头和接收滚轴间的距离为10～20cm，纺丝温度为20～30℃，纺丝湿度为25～40％，注射泵流速为0.1～1.5mm/min；将盖玻片粘在接收滚轴上，接收滚轴接负电压，调节负电压至-3kv，注射器金属针头接正电压，缓慢提高正电压为20～28kv至静电纺丝稳定，纺丝2～5h，在盖玻片上获得静电纺丝薄膜，薄膜厚度为0.5～1.0mm；

3)将静电纺丝薄膜置于20～30ml的pbs溶液(10g氯化钠、0.25g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.25g磷酸二氢钾，于去离子水中溶解，用去离子水定容至1000ml)中静置浸泡1～3h，获得在水溶液中可稳定存在的负载亚精胺的生物活性膜。

本发明所述的一种负载亚精胺的生物活性膜的静电纺丝制备方法(方法二，亚精胺负载方式为化学反应)，其步骤如下：

1)纺丝液的配制：取助纺剂聚乙烯醇、多糖及其衍生物(如壳聚糖、甲壳素、纤维素、糖胺聚糖或硫酸软骨素等)、胶原蛋白于稀乙酸水溶液(乙酸体积分数为1％～3％)中，然后在50～80℃水浴、转速500～1000r/min的条件下加热搅拌0.5～1h，直至全部溶解，再超声除去气泡，室温下静置1～3h，得到纺丝液；在得到的纺丝液中，助纺剂的质量分数为6％～10％，多糖及其衍生物的质量分数为1％～3％，胶原蛋白的质量分数为6％～10％；

2)用注射器吸取适量纺丝液，调节注射器金属针头和接收滚轴间的距离为10～20cm，纺丝温度为20～30℃，纺丝湿度为25～40％，注射泵流速为0.1～1.5mm/min；将盖玻片粘在接收滚轴上，接收滚轴接负电压，调节负电压至-3kv，注射器接正电压，缓慢提高正电压为20～28kv至静电纺丝稳定，纺丝2～5h，在盖玻片上获得静电纺丝薄膜，薄膜厚度为0.5～1.0mm；

3)取适量小分子二醛(如对苯二甲醛、戊二醛、己二醛、丁二醛、丙二醛或乙二醛等)溶于无水乙醇中，加入亚精胺，亚精胺的质量分数范围为0.1％～5％，二醛与亚精胺的用量摩尔比例范围为1.05～1.5：1；震荡摇匀，得到淡黄色的交联剂溶液；将带有静电纺丝薄膜的盖玻片放在该交联剂溶液中，静置浸泡1～3h；将交联后的纺丝薄膜置于20～30ml的pbs溶液(10g氯化钠、0.25g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.25g磷酸二氢钾，于去离子水中溶解，用去离子水定容至1000ml)中静置浸泡1～3h，除去盖玻片上未被交联的聚乙烯醇等，获得在水溶液中可稳定存在的负载亚精胺的生物活性膜。

一种负载亚精胺的生物活性膜，由上述方法一或方法二制备得到。

附图说明

图1：实施例1制备得到的负载亚精胺的生物活性膜扫描电子显微镜图片(聚乙烯醇质量分数为10％，壳聚糖质量分数为2％，胶原蛋白质量分数为8％，简称为10％pva+2％cts+8％clg，亚精胺质量分数为4.625％)。图a为放大500倍，图b为放大3000倍。

由图可见，10％pva+2％cts+8％clg稀乙酸溶液在正高压25.12kv的条件下，以1.0mm/min的流速进行静电纺丝操作，纤维粗细均匀，其纤维直径在734.0nm左右。

图2：实施例1制备得到的负载亚精胺的生物活性膜倒置荧光显微镜图片。

图a为交联前，图b为交联后，图c为pbs浸泡后。a1、b1、c1放大倍数为100，a2、b2、c2放大倍数为400。交联前，纤维直径统一，且均匀分布，光滑不缠绕，层层堆积。交联后，纤维不再是简单的平面堆积，出现了很多“y”型、“x”型的交叉点，单根纤维不再处于同一平面，形成了更为稳固的三维网络立体结构。经过交联的薄膜遇水(经过pbs浸泡)后，有较为明显的纤维溶胀现象，但仍具有较好的纤维形貌和网状结构。

图3：实施例1制备得到的负载亚精胺的生物活性膜上细胞生长情况扫描电子显微镜图片。

图3a为在盖玻片上静电纺丝薄膜的细胞生长情况，图3b为在光滑培养皿上的细胞生长情况。细胞更易于吸附在静电纺丝薄膜上生长，交联后的静电纺丝薄膜具有良好的生物相容性和优异的细胞粘附性能。

图4：实施例2制备得到的负载亚精胺的生物活性膜扫描电子显微镜图片(聚乙烯醇质量分数为8％，壳聚糖质量分数为2％，胶原蛋白质量分数为8％，简称为8％pva+2％cts+8％clg，亚精胺质量分数为4.98％)。图a为放大500倍，图b为放大3000倍。

由图可见，8％pva+2％cts+8％clg稀乙酸溶液在正高压24.98kv的条件下，以0.7mm/min的流速进行静电纺丝操作，纺丝过程稳定，出现丝和纺锤形共存的形貌，纺锤形最宽部位直径在588.4nm左右。

图5：实施例4制备得到的负载亚精胺的生物活性膜上细胞生长情况扫描电子显微镜图片。(聚乙烯醇质量分数为10％，壳聚糖质量分数为2％，胶原蛋白质量分数为8％，亚精胺的质量分数为0.19％，简称为物理负载亚精胺的10％pva+2％cts+8％clg)。图a为放大500倍，图b为放大3000倍。

由图可见，物理负载亚精胺的10％pva+2％cts+8％clg稀乙酸溶液在正高压25.12kv的条件下，以1.0mm/min的流速进行静电纺丝操作，纤维粗细均匀，其纤维直径在719.0nm左右。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明的技术方案做更详细的说明，但所述实例不构成对本发明的限制。

实施例1

1)取1g聚乙烯醇、0.2g壳聚糖、0.8g胶原蛋白，至10ml体积分数为2％的稀乙酸水溶液中，在60℃水浴，转速600r/min的条件下，加热搅拌1h，直至全部溶解，超声除去气泡，室温下静置1h，获得10％pva+2％cts+8％clg的纺丝液。超声除去气泡，室温下静置1h。

2)用注射器吸取2ml纺丝液，调节金属针头和接收滚轴间的距离为15cm，开启电源，设置温度为25℃，湿度为30％。注射泵控制流速为1.0mm/min。接收滚轴接负电压，将盖玻片粘在接收滚轴上，调节负电压至-3kv，注射器接正电压，缓慢提高正电压的参数至25.12kv，纺丝3h，在盖玻片上获得静电纺丝薄膜，获得的薄膜厚度为0.6mm。

3)取0.103g对苯二甲醛溶于20ml无水乙醇中，加入100μl亚精胺，震荡摇匀，得到淡黄色的交联剂溶液。将静电纺丝薄膜放在交联剂溶液中静置浸泡2h。将交联后的纺丝薄膜置于25ml的pbs溶液中静置浸泡1h，除去盖玻片上未被交联的聚乙烯醇等。从而得到本发明所述的负载亚精胺的生物活性膜。

4)将pbs缓冲溶液中浸泡得到的纺丝薄膜取出后立即置于培养皿中，在培养皿中晾干，盖玻片即固定在培养皿中，在带有纺丝薄膜的培养皿中培养小鼠胚胎成纤维细胞(可以购买得到)18h，观察细胞生长情况。

实施例2

1)取0.8g聚乙烯醇、0.2g壳聚糖、0.8g胶原蛋白，至10ml体积分数为2％的稀乙酸水溶液中，在60℃水浴，转速600r/min的条件下，加热搅拌1h，直至全部溶解，超声除去气泡，室温下静置1h，获得8％pva+2％cts+8％clg的纺丝液。超声除去气泡，室温下静置1h。

2)用注射器吸取2ml纺丝液，调节金属针头和接收滚轴间的距离为15cm，开启电源，设置温度为25℃，湿度为30％。注射泵控制流速为0.7mm/min。接收滚轴接负电压，将盖玻片粘在接收滚轴上，调节负电压至-3kv，注射器接正电压，缓慢提高正电压的参数至24.98kv，纺丝3h，在盖玻片上获得静电纺丝薄膜，获得的薄膜厚度为0.6mm。

3)取0.103g对苯二甲醛溶于20ml无水乙醇中，加入100μl亚精胺，震荡摇匀，得到淡黄色的交联剂溶液。将静电纺丝薄膜放在交联剂溶液中静置浸泡2h。将交联后的纺丝薄膜置于25ml的pbs溶液中静置浸泡1h，除去盖玻片上未被交联的聚乙烯醇等。从而得到本发明所述的负载亚精胺的生物活性膜。

4)将pbs缓冲溶液中浸泡得到的纺丝薄膜取出后立即置于培养皿中，在培养皿中晾干，盖玻片即固定在培养皿中，在带有纺丝薄膜的培养皿中培养小鼠胚胎成纤维细胞(可以购买得到)18h，观察细胞生长情况。

实施例3

1)取1g聚乙烯醇、0.2g壳聚糖、0.8g胶原蛋白，20μl亚精胺至10ml体积分数为2％的稀乙酸水溶液中，在60℃水浴，转速600r/min的条件下，加热搅拌1h，直至全部溶解，超声除去气泡，室温下静置1h，获得物理负载亚精胺的10％pva+2％cts+8％clg的纺丝液。超声除去气泡，室温下静置1h。

2)用注射器吸取2ml纺丝液，调节金属针头和接收滚轴间的距离为15cm，开启电源，设置温度为25℃，湿度为30％。注射泵控制流速为1.0mm/min。接收滚轴接负电压，将盖玻片粘在接收滚轴上，调节负电压至-3kv，注射器接正电压，缓慢提高正电压的参数至25.12kv，纺丝3h，在盖玻片上获得静电纺丝薄膜，获得的薄膜厚度为0.6mm。将纺丝薄膜置于25ml的pbs溶液中静置浸泡1h，从而得到本发明所述的负载亚精胺的生物活性膜。

3)将纺丝薄膜取出后立即置于培养皿中，在培养皿中晾干，盖玻片即固定在培养皿中，在带有纺丝薄膜的培养皿中培养小鼠胚胎成纤维细胞(可以购买得到)18h，观察细胞生长情况。