专利名称：一种来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属植物基因工程领域，具体涉及一种来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因及其应用。
背景技术：
丙烯酰胺(CH2 = CH-CONH2, Acrylamide)是一种白色晶体物质，分子量为70. 08， 是1950年以来广泛用于生产化工产品聚丙烯酰胺的前体物质。聚丙烯酰胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。由于丙烯酰胺具有潜在的神经毒性、遗传毒性和致癌性，对人类健康产生了极大的威胁。为此，如何降解环境中残留的丙烯酰胺是一个迫切需要解决的问题。植物修复(Phytoremediation)是利用绿色植物来转移、容纳或转化污染物使其对环境无害。植物修复的对象是重金属、有机物或放射性元素污染的土壤及水体。研究表明，通过植物的吸收、挥发、根滤、降解、稳定等作用，可以净化土壤或水体中的污染物，达到净化环境的目的，因而植物修复是一种很有潜力、正在发展的清除环境污染的绿色技术。中国土壤修复专家正在试验砷、铜、锌等重金属污染土壤的植物修复技术，通过在矿区及其周边重金属污染土地种植超富集植物，吸收土壤中对人体有害的重金属物质。目前还未有关于丙烯酰胺植物修复方面的文献报道，因而发掘新型的丙烯酰胺降解方法是必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因。本发明所要解决的技术问题之二，在于提供该来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因在植物修复中的应用，即将该来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因转入植物体内，并对该转基因植物进行功能验证，以证明它具有降解丙烯酰胺的功能。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。所述的来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。该丙烯酰胺水解酶基因长l(^6bp， 含10 个碱基，编码的氨基酸342个。所述的来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因，采用人工方法合成。即依照PTDS(PCR-based two-step DNA synthesis，PTDS)方法克隆源自伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺酶基因(ACMD)，进行化学合成，在保持ACMD基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成本发明的丙烯酰胺水解酶基因(ACMDI)。通过农杆菌介导将本发明的丙烯酰胺水解酶基因ACMDI转入拟南芥，可应用于丙烯酰胺降解。具体包括如下步骤
DACMDI农杆菌双元载体的构建ACMDI基因植物双元载体在pcAMBIA-1301载体的基础上构建而成，在 pCAMBIA-1301载体的多克隆位点处插入两端附加了烟草的染色质附着SAR序列的外源基因的表达单元，这有利于转基因的稳定遗传；在外源基因的表达单元内，我们在目的基因的两侧导入了 BamHI和Mcl酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由双CAMV355 启动子+TMV omegaleader sequence ^ffjlJo2)电击法转化农杆菌MicroPulser Electroporation Apparatus Operating Instructions and AppIicationGuide (BIO-RAD公司)制备农杆菌GV3101感受态，并且将构建好的农杆菌双元载体经电击法转入到农杆菌中。3)农杆菌介导转化拟南芥利用蘸花法将构建好的农杆菌转入拟南芥体内。首先将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3 5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22°C培养室，低光强度下生长M小时，即可正常培养。生长约两个月后，收集种子，4°C冰箱贮存待用。4)拟南芥转化植株种子的筛选对上述得到的种子进行筛选，包括GUS组织化学染色分析和转基因阳性植株的 PCR检测得到转入ACMDI基因的拟南芥。5)转基因拟南芥降解丙烯酰胺将得到的转ACMDI基因的拟南芥与野生型拟南芥共同栽培到含有丙烯酰胺的水溶液中，经过一周生长，测定水溶液中丙烯酰胺的含量。HPLC测定表明野生型拟南芥中丙烯酰胺没有减少，而转ACMDI基因的拟南芥水溶液中，丙烯酰胺的检测峰高由1200降低到 700以下。由此说明本发明的来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因ACMDI成功的使转基因拟南芥具有了分解丙烯酰胺的功能，这使得其他植物修复丙烯酰胺污染成为了可能。
图1为转ACMDI基因拟南芥的DNA检测电泳图，其中1为marker，2为野生型拟南芥，3-7为转ACMDI基因的拟南芥。图2为获得的转ACMDI基因拟南芥的GUS染色图，其中的4个试管均为染色阳性的转基因拟南芥。图3为转ACMDI基因拟南芥水培在含相同浓度丙烯酰胺溶液5天后HPLC检测结果，其中WT为野生型拟南芥，Tl、T2、T3为转ACMDI基因的拟南芥。
具体实施例方式以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.R.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社。)实施例1丙烯酰胺水解酶基因ACMDI的人工合成依照PTDS(PCR-basedtwo-step DNA synthesis，PTDS)方法克隆源自伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺酶基因(ACMDI)，进行化学合成，在保持ACMDI基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成本发明的丙烯酰胺水解酶基因(ACMDI)。设计的引物如下1. Acmdi-I :Tm = 54,60merTCA，GTC，TTC，GTG，CGG，GAT，TCC，TTC，GAT，CGG，ACA，CTC，CGG，CGT，GCC，AGG， GGT, TGG, ACG, CGT2. Acmdi-2 :Tm = 54，60merTGT，GGA，TCC，AGA，CGC，CAC，GCG，TCG，CCG，CGT，CGA，AGC，GCT，CAC，GCG，TCC， AAC, CCC, TGG, CAC3. Acmdi-3 :Tm = 54，60merGCG，TGG，CGT，CTG，GAT，CCA，CAA，TCC，AGT，CGC，GAT，AGA，AGC，CGA，ATG，GAC， AGT，CCG，CGA，CGC4. Acmdi-4 :Tm = 54，60merGGT，TAT，ACC，GGC，ACC，ATT，CAT, TCC，GGC，GAT，GGC，GTG，AAT，GGC，GTC，GCG， GAC, TGT, CCA, TTC5. Acmdi-5 :Tm = 54，60merTGA，ATG，GTG，CCG，GTA，TAA，CCG，CGA，TGC，AGC，AGC，TTG，TAT，AGA，TGG，TTC， TGC，GAC，TGC，ATG 6. AcmdiA-6 :Tm = 54，60merCGG，AGC，TGT，CGC，TCG，TCA，TGA，TTC，GCG，ACG，CGC，GGC，GTA，ACA，TGC，AGT， CGC，AGA，ACC，ATC7. Acmdi-7 :Tm = 54，60merCAT, GAC，GAG, CGA，CAG，CTC，CGC，ATA，CTG，CAC，GCC，CAT, TTC，CTC，CTC，GCC， GCA, CTC, GCC, GAG8. Acmdi-8 :Tm = 54，60merCTT, CGG, CCA, TTC, GGC, GAT, CGT, GGG, GTT, CGA, CGG, GCG, CAC, GCT, CGG, CGA, GTG, CGG, CGA, GGA9. Acmdi-9 :Tm = 54，60merTCC，TCG，CCG，CAC，TCG，CCG，AGT，ACG，AAT，ACA，CGC，CGT，CCC，AGC，CCG，TTG， CGT, TGG, CCA, CTG10. Acmdi-10 :Tm = 54，60merGTC，GCG，AAG，GCT，ATG，GCG，TGG，ATG，AAC，AAC，ACA，TAC，GTG，GCA，GTG，GCC， AAC，GCA，ACG，GGC11. Acmdi-Il :Tm = 54,60mer
5
CAC，GCC，ATA，GCC，TTC，GCG，ACC，ATC，ACC，TGC，TGC，TCC，TTC，GCT，GGG，TAC， ATA，TAG, CCC，TGA12. Acmdi-12 :Tm = 54，60merGCG，ACT, GCG，CGA，TGA，ATG，GCG，CGG，AGC，TCA，TCG，TGC，GCT，GTC，AGG，GCT， ATA，TGT，ACC，CAG13. Acmdi-13 :Tm = 54，60merGCC，ATT，CAT, CGC，GCA，GTC，GCG，CCA，GAT，CTC，CGG，ATA，ATT，TCC，GTC，ATC， GCA，GAT，GAT，CAA14. Acmdi-14 :Tm = 54，60merCAC，CTA，CGT，GAC，GGA，CGG，GCC，GAA，GGG，CCT，CAA，GAT，CAG，CTT，GAT，CAT, CTG, CGA, TGA, CGG15. Acmdi-15 :Tm = 54，60merGCC，CGT，CCG，TCA，CGT，AGG，TGC，GGT，CGC，CCG，GAT，ACC，AGC，CTT，CGA，TCG， GTG，TCC，ACG，GCA 16. Acmdi-16 :Tm = 54，60merGAC，AAT，CGC，GGC，GAG，ATC，GTG，CAA，AAG，TAC，CGC，AAG，ATC，ATG，CCG，TGG， ACA，CCG，ATC，GAA17. Acmdi-17 :Tm = 54，60merACG，ATC，TCG，CCG，CGA，TTG，TCG，ATC，AGC，ACG，AGC，GTG，TTG，TAC，GGC，ACC， TTG, TGC, GGA, TGC18. Acmdi-18 :Tm = 54，60merTGT，GGG，GTG，TGT，TCT，CGA，TCA，CGG，GCG，AGC，GCC，ACG，AGC，AGC，ATC，CGC， ACA，AGG，TGC，CGT19. Acmdi-19 :Tm = 54，60merGAT，CGA，GAA，CAC，ACC，CCA，CAC，GTT，GGC，CTT，GCG，GCA，CGC，CGC，CGA，AAA, AAT, GTC, GGT, CTC20. Acmdi-20 :Tm = 54，60merCCA，AGA，GAT，GTT，CGA，TAC，GGC，ATC，GGC，GAT，TCC，CGG，CGA，AGA，GAC，CGA， CAT, TTT，TTC，GGC21. Acmdi-21 :Tm = 54,60merCCG，TAT，CGA，ACA，TCT，CTT，GGC，GGT，CGT，ACA，TGA，TGC，CGT，GGG，TCG，AAT， ACT, CGG，GGA，ACA22. Acmdi-22 :Tm = 54，60merGTC，GGC，ATG，AAG，CAG，GGT，TTG，CCG，GGC，ATG，GAT，CTC，GTG，GTG，TTC，CCC， GAG，TAT，TCG，ACC23. Acmdi-23 :Tm = 54，60merAAA, CCC，TGC，TTC，ATG，CCG，ACC，ACC，ATG，TCG，GCG，ATA，TGG，CGC，GCG，TTG， TCG, AGC, ACC, TCC24. Acmdi-24 :Tm = 54，60mer
CGG，TGG，TCA，ACT, ACA，AGA，TGC，CGC，GTC，TGC，ACA，CGA，AGG，CGT，CGG，CAT, GAA，GCA，GGG，TTT25. Acmdi-25 :Tm = 54，60merCAT, CTT，GTA，GTT，GAC，CAC，CGC，GAC，ACC，TAC，ACA，ATC，GCG，GCT，ACT, CGA， AAT，ATC，ACC，ATG 26. Acmdi-26 :Tm = 54，60merATG，CGA，CAT, GGT，GAT，ATT，TCG，AGT，AGC，CGC，GAT，TGT利用PCR进行ACMDI基因扩增，在100 μ 1反应体系中，Acmdi-2_Acmdi-25共M个引物的添加量为2ng，外侧引物Acmdi-I和A Acmdi-沈添加量为30ng，扩增条件为94°C预热 Imin ；94"C 30s, 50°C 30s, 72°C 2min，使用的 Taq DNA 聚合酶为 KOD FX taq 酶 CToyobo 公司，日本)，共25个循环。PCR结束后，琼脂糖胶回收，取10 μ 1直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4°C连接过夜，高效转化DH5ci感受态中，获得阳性克隆经过上海桑尼公司测序比对， 所得序列即为本发明的丙烯酰胺水解酶基因(ACMDI)，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示， 其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。该丙烯酰胺水解酶基因长l(^6bp，含10 个碱基，编码的氨基酸342个。实施例2 ACMDI农杆菌双元载体的构建上述人工合成的ACMDI基因的ORF经PCR扩增后头尾分别加入Bam HI和I 切点，经Bam HI+Sac I双酶切，回收DNA片段与相应酶切的载体相连，经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体PYM6032。实施例3电击法转化农杆菌1)制备农杆菌 GV3101 感受态，方法参照 MicroPulser Electroporation ApparatusOperating Instructions and Application Guide (BIO-RAD 公司)(Raineri et al.，1990)。2)取50 μ L GV3101感受态细胞，加入1 μ L DNA,转入0. 2cm电击杯转化000 Ω， 2. 5KV，25 μ f)。加入ImL含有1 %甘露醇的LB培养基恢复培养2小时(28°C，250rpm)。分别取10 μ L、100 μ L涂LB平板(利福平50 μ g/mL,庆大霉素50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)。3)从步骤2中LB板上生长的菌中挑取几个克隆，碱法抽提农杆菌质粒，酶切鉴定， PCR检测。实施例4农杆菌介导转化拟南芥A拟南芥的培养1)拟南芥种子在4°C进行2-3天的春化处理，目的是有利于种子的一致萌发和花期的提前。2)将蛭石、黑土、珍珠岩按9 3 0. 5 (ν/ν)的比例拌勻，经高温灭菌后装于IOcm 的塑料小盆，以营养液PNS浸湿待用。3)以牙签将拟南芥种子点播于湿润的基质上，保鲜膜封口。放置于22°C暗培养 2-3天，待种子萌发后，揭开保鲜膜，置于22°C培养室中进行16小时光照培养。4)拟南芥抽苔后及抽苔后两周以及转化后需再以PNS营养液浸湿一次。中途可视情况适当浇水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生长，当次生苔长至2-lOcm(少数已经开花)可用于转化。B农杆菌的准备1)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250rpm 培养 20 小时。2)取ImL菌液转接入20_30mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250rpm 培养约 12 小时，测 0D600 1. 5。3)8000rpm，4°C，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5%蔗糖， 0. 05% SilwetL-77)并稀释至 0D600 0. 8。C蘸花法转化拟南芥1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3 5秒后取出，全部转化完毕后， 托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22°C培养室低光强度下生长M小时，即可正常培养。2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以在花发育的不同时期进行转化，提高转化效率。3)生长约两个月后，收集种子，4°C冰箱贮存待用。实施例5拟南芥转化植株种子的筛选1)称25_30mg种子放入1. 5mL离心管。2) ImL 75%乙醇消毒Imin (不停摇晃振荡)，8000rpm离心5秒，去上清。3)加入ImL过滤后的漂白粉消毒15min (不停摇晃振荡，充分消毒)，SOOOrpm离心
5秒，去上清。4)无菌水洗涤3-4次。5)将种子均勻的播撒到1/2MS平板(Hyg 50 μ g/mL)上，ParafiIm膜封口，4°C冰箱放置两天，220C，16小时光照培养6天。6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(Tl) 继续培养，并收集种子进行T2代和T3代筛选。实施例6转基因阳性植株的检测1)⑶S组织化学染色分析按Jefferson(1978)的方法，将待测拟南芥叶片样品与X-Gluc染色反应液(50m mo VLNaH2PO4, pH7. 0 ；0. 5m mol/L K4 [Fe (CN) 6], 0. 1% Triton X-100，20% 甲醇，0. 5mg/mL X-Gluc[X-glucuronide])于37°C保温2-4小时后，用75%乙醇脱色观察(参看图2)。2)转基因阳性植株的PCR检测A、拟南芥总DNA的提取1)取0. 1-0. 2g拟南芥叶片液氮研磨，转移至1.5mL离心管中。2)加入800 μ L抽提缓冲液，Vortex剧烈振荡，充分裂解细胞，60°C水浴1小时，每隔10分钟颠倒一次。3) 11000rpm，4°C，20min离心，取上清，加入等体积异丙醇及1/3体积的IOmol/L NH4Ac,室温放置15分钟。4) 1 IOOOrpm, 4 V，20min离心，弃上清，沉淀以70 % %乙醇洗涤，稍晾干，加入 100 μ LTE溶解(若不易溶解，可放于65°C助溶，不可用移液器吹吸)。
幻用酚、氯仿抽提一次，提高纯度，异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤，溶于50yL TE
中，-20°C保存，用于PCR检测。
B、PCR扩增
正向引物5，-GCACGCCCATTTCCTCC-3’
反向引物:5，-CAGCTTGATCATCTGCGATGAC-3’
PCR反应体系
10 PCR buffer 5. 0 μ L
dNTPS4μ L(2. 5m mol/L)
模板1 μ L(20ng-50ng)
引物11 μ L
引物21 μ L
iTaq 酶0. 2μ L
加无菌水定容至50 μ L0
反应程序:94°C 5min ；94°C 20S ；56°C 30S ；72°C 30S ；94°C IOmin ；32 个循环。检测
结果参看图1，其中1为marker，2为野生型拟南芥，3-7为转ACMDI基因的拟南芥。实施例7转基因拟南芥降解丙烯酰胺为了分析ACMDI基因能否分解丙烯酰胺，本申请比较了转ACMDI基因植株和野生型拟南芥植株对丙烯酰胺的分解效果。在22°C生长三个星期的野生型和转基因植株分别取10棵水培。其中水培营养液中含IOOmM丙烯酰胺，将野生型和转基因植株培养5天后， 然后用HPLC检测培养液中丙烯酰胺含量，结果参看图3。可以看出野生型拟南芥基本没有降解丙烯酰胺的能力，而转ACMDI基因的拟南芥水培液中，丙烯酰胺含量大幅度降低。
权利要求
1.一种来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。
2.根据权利要求1所述的来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.权利要求1或2所述的来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因采用农杆菌蘸花法转化拟南芥。
4.权利要求1或2所述的来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因在植物修复中的应用。
5.权利要求1或2所述的来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因在丙烯酰胺降解中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因及其应用。所述丙烯酰胺水解酶基因采用人工方法合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。将该丙烯酰胺水解酶基因采用农杆菌蘸花法转化拟南芥，结果发现该丙烯酰胺水解酶基因成功的使得转基因拟南芥具有了分解丙烯酰胺的功能，这使得其他植物修复丙烯酰胺污染成为了可能。
文档编号A62D3/02GK102533814SQ20101059850
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 彭日荷, 熊爱生, 田永生, 赵伟, 金晓芬, 陈晨, 韩红娟, 高建杰 申请人:上海市农业科学院