一种木质素的生物降解方法与流程

本发明属于木质素降解技术领域，具体涉及一种木质素的生物降解方法。

背景技术：

木质纤维素是木质素、纤维素以及半纤维素组成的生物质，是木本、草本植物难以被降解的细胞壁组成成分，其中纤维素作为骨架，木质素与纤维素以包容的形式分散在纤维素之中或是周围，三者的结合十分稳定，是目前生物质研究的主要原料。但是因其紧密的结构，使其不易于降解，在生产利用方面受到很大的阻碍。目前常用的木质素处理方法主要包括物理法、化学法、生物法或者是几种方法进行联合处理。虽然这些方法在一定程度上增加了对生物质资源的利用率，但是这些方法在操作过程中仍然有许多弊端。

物理法有超声波法、微波辐射、γ射线辐射，主要是通过对木质素内部产生短暂的局部高温、高压和温度的急剧变化，破坏木质素的结构稳定性发生化学反应，但是该法效果不稳定且噪音对环境不利，难以工业化放大应用。化学法是通过一些强酸强碱等破坏木质素中的一些化学键来达到对木质素的降解，但是该法对环境不友好，此外还存在成本高，用完后试剂难以回收等问题存在。而生物法相较于以上两种方法就比较温和而且处理效果也比较好，现在的生物处理主要是通过一些具有较强的木质素降解能力的白腐真菌分泌一些具有较强活性的木质素酶、纤维素酶对木质素进行降解。

研究表明，木质素过氧化物酶在降解木质素时，首先从苯环上得到一个电子，使之形成苯自由基，然后再通过链式反应产生其他类型的自由基，使木质素中的一些化学键断裂；锰过氧化物酶的主要作用是脱除木质素甲氧基，使之形成更易被氧化的结构，导致芳香环断裂；漆酶的作用与前两种酶的作用类似都是在降解过程中使木质素的一些化学键断裂，从而达到木质素降解的效果。但生物法对菌种的培养条件高，降解过程比较缓慢，所以现在对生物处理法的研究主要是注重在寻求一种能够高效降解的菌株。

如今对生物高效降解菌的目光都放在了真菌上，所以现在大部分的研究都是真菌如何对木质素的高效降解，对细菌确是很少有研究。但是最近越来越多的研究显示细菌在某些方面比真菌更具有优势，如环境适应性和生物多样性。事实上经过大量实验发现，细菌在降解芳香类化合物方面，无论是简单的酚类化合物还是高聚复杂的木质素都具有丰富多样的代谢途径，其高度的遗传可变性成为细菌降解木质素的潜在优势。

技术实现要素：

为了实现操作方便、稳定、环境友好的高效降解木质素，本发明提供一种木质素的生物降解方法。

本发明使用的菌种解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica，购于广东省菌种保藏中心。

一种木质素的生物降解操作步骤如下：

（1）培养菌株

取解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica斜面菌种一环接种于lb固体培养基，温度28℃、培养24~72h，得到活化的菌株；

（2）制备菌悬液

将活化的菌株接种于lb液体培养基上，接种量2%~4%，温度28℃、180r/min的摇床上培养2~3天，得到发酵液；

取2ml发酵液接种于100ml的lb液体培养基中，温度28℃、180r/min摇床上培养2~3天，得到菌悬液；

（3）处理木质素材料

将木质素材料在温度45℃条件下烘干，粉碎；过筛30-40目筛，再次温度45℃条件下烘干，得到粉料；所述木质素材料为农作物秸秆或植物秸秆；

（4）降解

取10g粉料加入20ml液体无机盐培养基中，搅拌均匀，灭菌，待冷却至室温，得到发酵物；取步骤（2）菌悬液5%体积的量加入发酵物中，搅拌均匀，温度28℃、培养2~3天，得到降解物；所述降解物中木质素降解率达到20%~25%，降解物的表面呈现疏松多孔的结构状态。

通过分光光度法测量解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica中的漆酶、过氧化物酶、锰过氧化物酶、羧甲基纤维素酶活力以及滤纸酶活力，所述锰过氧化物酶的酶活为219.49u/l。

所述木质素材料为玉米秸秆或小麦秸秆或苹果枝条或水稻秸秆或稻壳。

本发明木质素降解相关酶活的测定操作如下：

1、粗酶液的制备

从活化的lb固体培养基取2~3块0.25mm²大小的菌块，接种于灭菌的100ml液体碱木质素培养基中，置于28℃，180r/min的摇床上培养2~3天，取20ml，在离心机中，室温8000rpm离心20min后，取上清液，得到后续酶活测定的粗酶液。

2、木质素相关酶活的测定

2.1过氧化物酶的测定

1)在试管中加入250mm、ph4.5酒石酸-酒石酸钠缓冲液2.7ml和10mmol/l藜芦醇溶液0.1ml；

2)再加入0.1ml的粗酶液，在28℃下加入20mmol/l过氧化氢溶液0.1ml启动整个反应；

3)反应2min后于310nm波长处测定吸光度od值；

4)在上述实验条件下进行酶促反应一个酶活力单位（u）为每分钟产生1.0μmol藜芦醇；

通过分光光度法测定过氧化物酶酶活为28.28u/l。

2.2锰过氧化物酶的测定

1)在试管中加入0.2m、ph5.0乳酸-乳酸钠缓冲液3.4ml和0.4mol/l硫酸锰溶液0.1ml；

2)再准确加入稀释的待测粗酶液0.4ml，在28℃下加入3.2mmol/l过氧化氢溶液0.1ml启动整个反应；

3)反应3min后于240nm波长处测定吸光度od值；

4)在上述实验条件下进行酶促反应一个酶活力单位（u）为每分钟产生1.0μmolmn³⁺；

通过分光光度法测定锰过氧化物酶酶活为219.49u/l。

2.3漆酶的测定

1)在试管中加入50mm、ph5.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液2.7ml和1.0mmol/labts溶液0.2ml；

2)再准确加入待测粗酶液0.1ml，在28℃下加入20mmol/l过氧化氢溶液0.1ml启动整个反应；

3)反应2min后于430nm波长下测定吸光度od值；

4)在上述实验条件下进行酶促反应，一个酶活力单位（u）为每分钟产生1.0μmolabts；

通过分光光度法测定漆酶酶活为1.31u/l。

3、纤维素相关酶活的测定

3.1葡萄糖标准曲线测定

1)称取干燥葡萄糖1g，溶解在1000ml蒸馏水中，配制成葡萄糖标准溶液浓度为1mg/ml；

2)取干净烘干的6支25ml具塞刻度试管分别加入0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml葡萄糖标准溶液定容至1ml，稀释成浓度分别为0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的稀释液，进行编号；

3)向各试管中加入3mldns溶液（每个管平行三个样）；

4)摇匀后沸水浴10min，取出迅速冷却后用蒸馏水定容至25ml，充分混匀；

5)以未加葡萄糖的试管进行调零，在540nm波长下，测定其他各管溶液的吸光度；

以葡萄糖浓度为x轴，测定的吸光值为y轴绘制葡萄糖标准曲线见图1。

3.2滤纸酶(fpase)活力的测定

1)样品的制备：取粗酶液于试管中混匀，待测；

2)滤纸条的制备：将滤纸制成1.0×6.0cm的大小，放入烘箱中烘干，质量在0.5g备用；

3)操作过程：

取4支洗净烘干的25ml具塞刻度试管（一支空白，三支样品管），编号；

样品管：在三支试管中分别加入0.5g滤纸条、1ml粗酶液、1ml醋酸缓冲液；

空白管：加入1ml粗酶液、1ml醋酸缓冲液；

将4支试管同时在50℃水浴中保温1h，取出立即向各个试管中加入3mldns溶液以终止酶反应，待其冷却后用蒸馏水定容至25ml，充分混匀。以空白管调零，在540nm波长下测定试管的吸光度并记录。在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，计算滤纸酶活力。在上述条件下，每小时由1ml酶液消耗底物，生成相当于1umol葡萄糖的还原糖，定义为一个酶活力单位（u）；

通过分光光度法测得的滤纸酶酶活为1.03u/l。

3.3羧甲基纤维素酶(cmcase)活力的测定

1)样品的制备：取粗酶液于试管中混匀，待测；

2)羧甲基纤维素钠-醋酸缓冲液的制备：称取2g羧甲基纤维素钠加热溶解于50mm、ph5.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，冷却后补足至100ml；

3)操作过程：

取4支洗净烘干的25ml具塞刻度试管（一支空白，三支样品管），编号；

样品管：在三支试管中分别加入1ml粗酶液，1ml羧甲基纤维素钠-醋酸缓冲液；

空白管：加入1ml蒸馏水、1ml羧甲基纤维素钠-醋酸缓冲液；

将4支试管同时在50℃水浴中保温30min，取出立即向各个试管中加入3mldns溶液以终止酶反应，待其冷却后用蒸馏水定容至25ml，充分混匀。以空白管调零，在540nm波长下测定试管的吸光度并记录。在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，在上述条件下，每小时由1ml酶液消耗底物，生成相当于1umol葡萄糖的还原糖，定义为一个酶活力单位（u）；

通过分光光度法测得的羧甲基纤维素酶酶活为0.89u/l。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果体现在以下方面：

（1）本发明利用了一种生物法解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica进行木质素降解的处理，通过微生物在发酵过程中产生的酶，主要是锰过氧化物酶来破坏木质素间的芳香环化学键，从而达到对木质素的降解效果，该菌产的锰过氧化物酶相比较其他木质素降解菌酶活是相对较高的，达到219.49u/l。解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica广泛存在于水、土壤和植物中，最近有生物信息学研究结果显示该类菌株具有木质素降解通路中重要的酶类编码基因，如过氧化物酶、fe-mn型超氧化物歧化酶、邻苯二酚1，2-双加氧酶和原儿茶酸-3，4-双加氧酶等，这些基因在不同的培养条件下有着不同程度的表达。这对于推动木质纤维素应用产业的发展具有重要的意义。

（2）本发明利用生物法解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica对木质素进行处理，相比较物理、化学法，更具温和性，且稳定性较好，易于操作，木质素降解效果好，参见图2与图3，可以看出未经处理的玉米秸秆表面较光滑完整、排列规则、致密有序有着典型的纤维态特征，而经过处理的玉米秸秆致密结构被破坏呈现粗糙、疏松多孔且有杂乱无章的细小纤维。经过对比说明解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica在生长过程中能够对木质素结构造成破坏，达到一个很好的降解效果。

（3）本发明是利用细菌解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica对木质素降解的一种方式，相比较之前的真菌降解木质素的处理方式，培养条件易于达到，降解效果理想且细菌生长的周期短，与真菌相比，细菌产生的过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶具有更好的稳定性和更宽的最适ph范围以及更耐受氯离子等优良的特性。

（4）本发明发现该株木质素降解菌同时具有固氮的功能，所以在生长过程中无需添加额外的氮源就可以生长，见图4。

附图说明

图1为葡萄糖标准曲线图。

图2为玉米秸秆未降解前的电镜结构图。

图3为玉米秸秆发酵3天后的电镜结构图。

图4为无氮培养基生长图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步地描述。

以下实施例所用原料来源说明如下：

所用菌株解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica购于广东省菌种保藏中心，锰过氧化物酶的酶活达到219.49u/l；lb固体培养基购于阿拉丁生化试剂商店；lb液体培养基购于阿拉丁生化试剂商店；无机盐液体培养基购于阿拉丁生化试剂商店。

实施例1

一种木质素的生物降解操作步骤如下：

（1）培养菌株

取解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica斜面菌种一环接种于lb固体培养基，温度28℃、培养24~72h，得到活化的菌株；

（2）制备菌悬液

将活化的菌株接种于lb液体培养基上，接种量2%，温度28℃、180r/min的摇床上培养2~3天，得到发酵液；

取2ml发酵液接种于100ml的lb液体培养基中，温度28℃、180r/min摇床上培养2~3天，得到菌悬液；

（3）处理木质素材料

本实施例的木质素材料为玉米秸秆；

将玉米秸秆在温度45℃条件下烘干，粉碎；过筛30-40目筛，再次温度45℃条件下烘干，得到玉米秸秆粉料；

（4）降解

取10g玉米秸秆粉料加入20ml液体无机盐培养基中，搅拌均匀，灭菌，待冷却至室温，得到发酵物；取步骤（2）菌悬液5%体积的量加入发酵物中，搅拌均匀，温度28℃、培养2~3天，得到降解物。

用vansoestpj的木质纤维素定量方法对降解物进行检测，参见图2与图3，对比降解后玉米秸秆表面有许多孔隙生成，玉米秸秆木质素的降解率达到22.76%。

实施例2

一种木质素的生物降解操作步骤如下：

（1）培养菌株

取解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica斜面菌种一环接种于lb固体培养基，温度28℃、培养24~72h，得到活化的菌株；

（2）制备菌悬液

将活化的菌株接种于lb液体培养基上，接种量2%，温度28℃、180r/min的摇床上培养2~3天，得到发酵液；

取2ml发酵液接种于100ml的lb液体培养基中，温度28℃、180r/min摇床上培养2~3天，得到菌悬液；

（3）处理木质素材料

本实施例的木质素材料为小麦秸秆；

将小麦秸秆在温度45℃条件下烘干，粉碎；过筛30-40目筛，再次温度45℃条件下烘干，得到小麦秸秆粉料；

（4）降解

取10g小麦秸秆粉料加入20ml液体无机盐培养基中，搅拌均匀，灭菌，待冷却至室温，得到发酵物；取步骤（2）菌悬液5%体积的量加入发酵物中，搅拌均匀，温度28℃、培养2~3天，得到降解物。

用vansoestpj的木质纤维素定量方法对降解物进行检测，小麦秸秆木质素的降解率达到23.58%。

实施例3

一种木质素的生物降解操作步骤如下：

（1）培养菌株

取解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica斜面菌种一环接种于lb固体培养基，温度28℃、培养24~72h，得到活化的菌株；

（2）制备菌悬液

将活化的菌株接种于lb液体培养基上，接种量2%，温度28℃、180r/min的摇床上培养2~3天，得到发酵液；

取2ml发酵液接种于100ml的lb液体培养基中，温度28℃、180r/min摇床上培养2~3天，得到菌悬液；

（3）处理木质素材料

本实施例的木质素材料为苹果枝条；

将苹果枝条在温度45℃条件下烘干，粉碎；过筛30-40目筛，再次温度45℃条件下烘干，得到苹果枝条粉料；

（4）降解

取10g苹果枝条粉料加入20ml液体无机盐培养基中，搅拌均匀，灭菌，待冷却至室温，得到发酵物；取步骤（2）菌悬液5%体积的量加入发酵物中，搅拌均匀，温度28℃、培养2~3天，得到降解物。

用vansoestpj的木质纤维素定量方法对降解物进行检测，苹果枝条木质素的降解率达到20.06%。

实施例4

一种木质素的生物降解操作步骤如下：

（1）培养菌株

取解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica斜面菌种一环接种于lb固体培养基，温度28℃、培养24~72h，得到活化的菌株；

（2）制备菌悬液

将活化的菌株接种于lb液体培养基上，接种量2%，温度28℃、180r/min的摇床上培养2~3天，得到发酵液；

取2ml发酵液接种于100ml的lb液体培养基中，温度28℃、180r/min摇床上培养2~3天，得到菌悬液；

（3）处理木质素材料

本实施例的木质素材料为水稻秸秆；

将水稻秸秆在温度45℃条件下烘干，粉碎；过筛30-40目筛，再次温度45℃条件下烘干，得到水稻秸秆粉料；

（4）降解

取10g水稻秸秆粉料加入20ml液体无机盐培养基中，搅拌均匀，灭菌，待冷却至室温，得到发酵物；取步骤（2）菌悬液5%体积的量加入发酵物中，搅拌均匀，温度28℃、培养2~3天，得到降解物。

用vansoestpj的木质纤维素定量方法对降解物进行检测，水稻秸秆木质素的降解率达到23.01%。

实施例5

一种木质素的生物降解操作步骤如下：

（1）培养菌株

取解鸟氨酸拉乌尔菌raoultellaornithinolytica斜面菌种一环接种于lb固体培养基，温度28℃、培养24~72h，得到活化的菌株；

（2）制备菌悬液

将活化的菌株接种于lb液体培养基上，接种量2%，温度28℃、180r/min的摇床上培养2~3天，得到发酵液；

取2ml发酵液接种于100ml的lb液体培养基中，温度28℃、180r/min摇床上培养2~3天，得到菌悬液；

（3）处理木质素材料

本实施例的木质素材料为稻壳；

将稻壳在温度45℃条件下烘干，粉碎；过筛30-40目筛，再次温度45℃条件下烘干，得到稻壳粉料；

（4）降解

取10g稻壳粉料加入20ml液体无机盐培养基中，搅拌均匀，灭菌，待冷却至室温，得到发酵物；取步骤（2）菌悬液5%体积的量加入发酵物中，搅拌均匀，温度28℃、培养2~3天，得到降解物。

用vansoestpj的木质纤维素定量方法对降解物进行检测，稻壳木质素的降解率达到21.59%。