可控高速层析相位的显微方法与装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种可控高速层析相位的显微装置，包括：沿样品光光路依次布置的二维扫描系统、第一4f系统、样品、第二4f系统；设置在考光光路上的压电陶瓷控制反射镜，用于改变所述样品光光路和参考光光路的光程差；第二偏振分光棱镜，用于将样品光和参考光合束；沿所述偏振分光棱镜出射光路依次布置的偏振片和CCD。本发明还公开了一种可控高速层析相位的显微方法。本发明系统稳定性更高，可控性更强，经济性更好，能够实现复杂的角度扫描；并可将层析相位显微系统的速度提高4倍以上。
【专利说明】可控高速层析相位的显微方法与装置
【技术领域】
[0001]本发明属于光学超分辨显微领域，特别涉及一种可控高速层析相位的显微方法与装置。
【背景技术】
[0002]生物组织中不同的细胞有不同的折射率，承担着不同的组织任务；同一个细胞内细胞核、细胞质和各种细胞器都有不同的折射率，当生物的生命活动发生改变的时，其相应组织内的细胞折射率分布也会发生改变，例如癌变细胞折射率增加，被疟原虫感染的红细胞折射率分布改变等，所以对生物细胞折射率的定量三维检测是光学显微领域与生命科学领域一项重要的课题。
[0003]对细胞的折射率的观察不同于对荧光样品和染色样品的观察，细胞几乎处于透明状态，折射率对光波的调制主要体现在光程的调制上，所以必须通过干涉的方法才能对折射率信息进行采集，现在对折射率成像的方法主要有相衬显微术、干涉显微术，但这些方法只能对一个面成像，而且由于光程的改变具有累加效应，会导致这两种显微方式的成像结果会有很强的噪声，无法准确量化折射率分布。
[0004]2007年，W Choi提出一种层析相位显微术，实现了三维定量折射率成像，对透明活动生物样品成像有很好的效果，能够准确的反应样品中折射率的分布情况。层析相位显微术运用干涉四步移相的方法来定量测量相位，通过120张定量相位图来重构一张三维折射率分布。为了提高层析相位显微术的成像速度，W Choi运用声光调制器移相实现了每秒10帧的数据采集速度。声光调制器的使用限定了整个体统的数据采集频率，整个系统的控制变得单一，同时每秒10帧的数据采集速度对于观察快速变化的生物活动细胞依然不够，所以设计一种稳定的、可控的、高速的层析相位显微镜是显微光学成像和生命科学一项有意义的突破。
【发明内容】
[0005]本发明提供了可控高速层析相位的显微方法和装置，将低频相应稳定的压电陶瓷运用到层析相位显微镜中循环扫描的控制方法，提高了层析相位显微镜的采样速度和运行可控性。本发明能够以最快每秒512x512像素50帧的速度采集样品相位信息，而且系统更稳定，可控性更强，为晶体掺杂加工检测、活动生物样品三维观察和疾病诊断提供有了一种力的工具。
[0006]一种可控高速层析相位的显微方法，包括以下步骤:
[0007]( I)激光器发射出激光光束，所述光束经过扩束镜扩束照射到反射镜上，经反射镜反射的激光透射二分之一波片进入偏振分光棱镜，旋转所述二分之一波片调节光束中P偏振光和S偏振光的分量，调整样品路跟参考路的光强；
[0008](2)所述参考路激光，依靠固定反射镜与压电陶瓷控制反射镜构建“Ζ”型光路，压电陶瓷控制反射镜包括反射镜和控制反射镜发生微位移的压电陶瓷，两个透镜沿着光传播方向依次放置在所述压电陶瓷控制反射镜之前和之后，两个透镜构成4f系统，对参考路激光进行二次扩束，其中第一个透镜的前焦点和第二个透镜的后焦点在所述压电陶瓷控制反射镜反射面上。所述压电陶瓷控制反射镜在压电陶瓷控制下移动，每次改变参考路光程1/4波长的距离，实现四步移相；
[0009](3)所述样品光照射到二维扫描系统，所述二维扫描系统由两个振动方向相互垂直摆放的一维振镜组成，所述两个一维振镜之间有两个透镜，组成4f系统，两个振镜分别放置在4f系统的前后焦面上， 所述样品光经过二维扫描系统，能够以第二个一维振镜反射点为球心扫描转动；
[0010](4)所述经过二维扫描系统的光束入射到扫描透镜上，所述第二个一维扫描振镜的反射面在扫描透镜的焦点处，经过扫描透镜的光束与光轴平行，聚焦到会聚透镜的后焦点处，所述激光透过会聚透镜，变成平行光透射位于其前焦点处的样品；
[0011](5)透过样品的光被显微物镜接收，所述显微物镜的后焦点跟所述会聚透镜前焦点重合，样品放置在所述显微物镜后焦点处，所述被显微物镜接收的光经显微镜场镜照射到CXD成像面，所述显微物镜场镜与显微物镜构成4f系统，所述CXD处于所述显微物镜前焦面；
[0012](6)所述样品光与所述参考光通过偏振分光棱镜合束,合束后的光透过偏振片统一偏振方向，所述偏振分光棱镜与偏振片放置与CCD与显微物镜场镜之间,CCD拍摄记录样品路激光与参考路激光的干涉图样；
[0013](7)所述光路系统搭建完好的情况下，压电陶瓷控制反射镜先处于O相位差位置，二维扫描系统转动使平行光按照设定的角度轨迹透射样品，同时，CCD快速拍摄图像，扫描一个周期后，得到干涉图像包Pl ;
[0014](8)改变所述压电陶瓷控制反射镜的位置，使参考路与样品路的光程差依次改变1/4 λ，2/4 λ，3/4 λ，λ，1/4 λ，2/4 λ……，λ为光束的波长，重复如步骤(7)中的扫描和记
录方法依次得到干涉图像包ρ2, ρ3, ρ4, ρ5, ρ6, ρ7......,利用pi, ρ2, ρ3, ρ4相邻的4个干涉图
像包，运用四步移相算法与解包络算法得到各个扫描角度下的相位积分图，再运用反Radon变换得到tl时刻的折射率三维分布图；利用干涉图像包p2，p3, p4, p5，得到t2时刻的折射率三维分布图，以此类推，可以快速地对变化样品三维折射率分布进行三维记录。
[0015]系统搭建优选方案中，所述激光发出光束经扩束透镜束腰扩束到3mm ;所述参考路中两个透镜将激光扩束到IOmm左右；调整二分之一波片的角度，使入射到偏振分光棱镜中的光有50%反射、50%透射；样品路中会聚透镜与显微物镜都采用1.4NA的浸油透镜，以保证单向最大扫描角度达到60° ;在二维扫描系统施加O电压信号时,系统内所有的透镜的光轴与光路主光轴重合；
[0016]控制方法优选方案中，压电陶瓷工作在线性变化最好的区段，标定每次移动反射镜的距离，实现准确的相位移动；CCD拍摄速度为每秒5000帧，角度扫描周期为20ms，角度扫描轨迹为覆盖-60°~60°的线性角度扫描照明。
[0017]本发明还提供了一种实现层析相位的显微装置，包括:
[0018](I)激光器，发出激光；
[0019](2)所述激光器发出的光束在分束之前依次通过扩束镜，反射镜，二分之一波片和第一偏振分光棱镜，光束在第一偏振分光棱镜中发生反射与透射，其中所述的反射光构成光路的参考路，所述透射光构成光路的样品路；
[0020](3)所述的参考路上的参考光在与样品路上的样品光合束前依次通过反射镜、聚焦透镜、压电陶瓷控制反射镜和准直透镜。其中，聚焦透镜的前焦点和准直透镜的后焦点重合在压电陶瓷控制反射镜的反射点上；
[0021](4)所述的样品路在与参考路合束前依次通过二维扫描系统、扫描透镜、会聚透镜、样品、显微物镜、反射镜和显微场镜，其中扫描透镜、会聚透镜、显微物镜、显微场镜连续的任意两个构成4f系统,二维扫描系统的扫描中心点位于扫描透镜的后焦点处,样品位于会聚透镜的前焦点处；其中二维扫描系统由两个一维扫描振镜和两个等焦距透镜组成，两个一维振镜扫描角度相互垂直，分别处于沿光路传播方向第一个透镜的后焦点和第二个透镜的前焦点，当振镜转动时，激光光束能够以第二个一维扫描振镜的反射点为中心，呈辐射状转动；
[0022](5)所述样品路光与参考路光在第二偏振分光棱镜合束,合束后的激光透过偏振片入射到CXD成像面上，CXD成像面位于显微场镜的前焦面上；
[0023]其中在优选方案里，扩束镜将激光器发出的光束扩束到3_，参考路中聚焦透镜与准直透镜将参考路光束扩束到IOmm;样品路中扫描透镜采用两英寸，焦距150mm双胶合透镜；会聚透镜采用I英寸入瞳，1.4NA浸油透镜；显微物镜采用1.4NA, 100X浸油透镜；显微物镜场镜采用两英寸，焦距200mm双胶合透镜；
[0024]本发明的工作原理如下:
[0025]激光器发出激光经扩束镜扩束照射到反射镜上，由反射镜反射后透过二分之一波片照射到第一偏振分光棱镜中，由于激光器发出的光是偏振光通过调整二分之一波片的角度可以调整激光光束中P，s分量进而调整第一偏振分光棱镜的透反比例；
[0026]激光在第一偏振分光棱镜处被分为样品光与参考光，参考光依次照射到反射镜、聚焦透镜、压电陶瓷控制反射镜、准直透镜，其中聚焦透镜和准直透镜能够将光束进一步扩束，反射镜与压电陶瓷控制振镜使光路“Z”型弯折，压电陶瓷施加不同电压时能够改变参考路的光程，每次移动四分之一波长，实现四步移相；
[0027]样品路激光依次通过二维扫描系统、扫描透镜、会聚透镜、样品、显微物镜、反射镜和显微场镜，其中二维扫描系统由两个一维振镜和两个等焦距透镜组成，两个等焦距透镜构成4f系统，两个一维振镜的转动轴相互垂直，分别位于4f系统的共轭面上，当两个一维振镜转动时，光束能够以第二个透镜的反射点为球心呈辐射状转动。第二个一维振镜的反射点位于扫描透镜的焦点处，当二维扫描系统转动时透过扫描透镜的光为平行于主光轴的聚焦光，会聚透镜与扫描透镜构成4f系统，透过会聚透镜的光为过会聚透镜前焦点的平行光，样品放置在会聚透镜的前焦点上，会聚透镜为NA等于1.4的浸油透镜，且焦距只有扫描透镜的百分之一，所以当聚焦在会聚透镜后焦面上且主光线与主光轴平行的光能够以很大角度扫描透射样品，理论上可以实现-67°?67°的扫描。显微物镜与会聚透镜构成4f系统，透过样品的光进入显微物镜后成为聚焦在其前焦面上的平行于主光轴的光，显微物镜与显微场镜构成4f系统,显微场镜的出射光为平行光。
[0028]样品光与参考光在第二偏振分光棱镜处合束，合束后的激光透过偏振片照射到CCD成像面上，其中CCD成像面中心位于显微镜场镜前焦点处，调整偏振片角度能够改变干涉条纹的对比度。[0029]系统运行时，设定压电陶瓷电压依次为V0，VI，V2，V3，V4，V5，V6……，使参考路依次改变光程1/4 λ，2/4 λ，3/4 λ，λ，1/4 λ，2/4 λ……，并处于不断循环中。当电压为VO时，维持压电陶瓷电压不变，振镜扫描，同时CCD拍摄，按照扫描轨迹得到干涉图像I (x，y)
OOOi?I (X，y) 0002? I (X，y) _3，I (x，y)。。。4，I (x，y)。。。5......1 (x，y)。_，n 的大小根据母次
测量的要求来设定，以后为了简便起见将(X，y)忽略不写；改变压电陶瓷电压到VI，维持压电陶瓷电压不变，振镜扫描，同时C⑶拍摄，按照扫描轨迹得到干涉图像Iltltll, I1002, I1003,I1004j I1005……11(1_，扫描轨迹跟之前完全一样，C⑶拍摄的照片数量也完全一样；参照这种
方式，随着压电陶瓷不断改变得到的数据依次为Ι2Μ1，I2002, I2003j 12_， 工2005......12000η? 13001?
13。02，I3OO3^ 13_，I3005......Ι3_η，......，命名规则为下标后三位代表一个周期内拍摄的第几张
图，前面的数代表压电电压改变次数。根据得到的干涉图利用四步移相的方法得到相位分布图，公式为
[0030]
【权利要求】
1.一种可控高速层析相位的显微装置，其特征在于，包括: 沿样品光光路依次布置的二维扫描系统、第一 4f系统、样品、第二 4f系统； 设置在考光光路上的压电陶瓷控制反射镜，用于改变所述样品光光路和参考光光路的光程差； 第二偏振分光棱镜，用于将样品光和参考光合束； 沿所述偏振分光棱镜出射光路依次布置的偏振片和CCD。
2.如权利要求1所述的可控高速层析相位的显微装置，其特征在于，还包括激光器，及沿所述激光器光路依次布置的扩束镜、反射镜、二分之一波片和第一偏振分光棱镜；第一偏振分光棱镜用于将激光器光路分为所述的样品光光路和参考光光路。
3.如权利要求1所述的可控高速层析相位的显微装置，其特征在于，所述的压电陶瓷控制反射镜包括反射镜和控制反射镜发生微位移的压电陶瓷。
4.如权利要求1所述的可控高速层析相位的显微装置，其特征在于，所述的第一4f系统包括依次布置的扫描透镜和会聚透镜；所述第二 4f系统包括依次布置的显微物镜和显微场镜。
5.如权利要求4所述的可控高速层析相位的显微装置，其特征在于，所述扫描透镜采用两英寸，焦距150mm双胶合透镜；所述会聚透镜采用I英寸入瞳，1.4NA浸油透镜；所述显微物镜采用1.4NA, 100X浸油透镜；所述显微场镜采用两英寸，焦距200mm双胶合透镜。
6.一种可控高速层析相位的显微方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将样品路上的光束聚焦在样品上，并收集透过样品的透射光，将参考路上的光束与所述透射光合束，统一偏振方向后发生干涉，再利用CCD采集干涉图样； 2)根据光程差该变量1/4λ，2/4 λ，3/4 λ，λ，依次并循环改变所述样品路与参考路的光程差，且在每次改变时，利用所述样品路上的光束对样品进行扫描，通过CCD采集到与每个光程差该变量相对应的干涉图像包Pi ； 3)以干涉图像包pi为起点，依次提取pi,p(i+l), p(i+2), p(i+3)四个干涉图像包,运用四步移相算法与解包络算法得到各个扫描角度下的相位积分图，再运用反Radon变换得到对应时刻的折射率三维分布图。
7.如权利要求6所述的可控高速层析相位的显微方法，其特征在于，所述的参考路设有用于改变所述样品路与参考路的光程差的压电陶瓷控制反射镜。
8.如权利要求7所述的可控高速层析相位的显微方法，其特征在于，所述的压电陶瓷控制反射镜包括反射镜和控制反射镜发生微位移的压电陶瓷。
9.如权利要求6所述的可控高速层析相位的显微方法，其特征在于，所述的样品路和参考路由同一激光器发出的光束扩束后经偏振分光棱镜分束而成。
10.如权利要求9所述的可控高速层析相位的显微方法，其特征在于，所述激光器发出的光束扩束到3mm后分束，所述参考路上的光束扩束到IOmm后与所述样品路上的光束合束。
【文档编号】G02B21/00GK103743707SQ201310721772
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】匡翠方, 修鹏, 刘旭, 葛剑虹 申请人:浙江大学