高分辨率3d荧光显微术的制作方法
【专利说明】高分辨率3D荧光显微术
[0001]本发明涉及一种用于产生沿深度方向也具有高分辨率的荧光样本图像的显微术方法或显微镜。
[0002]借助显微术研究样本是一个较广的技术领域，针对其存在多样的技术解决方案。由经典的光显微镜出发，开发出了各种不同的显微术方法。
[0003]用于研究生物标本的光显微镜的典型应用领域是荧光显微术。在此，将特定的色素(所谓的荧光基团)用于对样本、例如细胞部分进行特殊的标记。如上所述，样本被激励射线照明并且由此被激励产生的荧光射线用适当的探测器检测。为此，通常在光显微镜中设置与单元滤波器(Block滤波器)结合的二色性分束器，其将荧光射线与激励射线分开并且实现单独的观察。通过这种方式，能够在光显微镜中显示各个不同地染色的细胞部分。当然也可以同时通过特定地累积在标本的不同结构上的不同色素对标本的多个部分进行染色。这种方法称为多重发光术。也可以测量本身发光、也就是不具有标记添加剂的样本。
[0004]为了实现超越通过物理定律规定的衍射极限的分辨率，在近些年来开发出了不同的方法。这些显微术方法的特征在于，它们相比经典显微镜能够为使用者提供更高的侧向光学分辨率。在该描述中，这些显微术方法称为高分辨率显微术方法，因为它们实现了超越光学衍射极限的分辨率。而衍射受限的显微镜称为经典显微镜。
[0005]由T.Dertinger等人的公开出版物 “Fast，background-free，3D super-resolut1n optical fluctuat1n imaging(S0FI )，，，PNAS(2009)，S.22287-22292 以及“Achieving increased resolut1n and more pixels with Superresolut1n OpticalFluctuat1n Imaging (S0FI )，，, Opt.Express ,30.08.2010 ,18(18):18875-8 5，do 1:10.1364/IE.18.018875和S.Geissbuehler等人的 “Comparison between S0FI andSTORM”，B1med.0pt.Express 2,408-420(2011)已知一种高分辨率的远场显微术方法。该方法利用荧光基团的闪烁特性。如果样本的荧光基团彼此独立地可统计地闪烁，则对样本的成像可以通过适当滤波与所谓累加功能的结合而实现超越物理规定的光学分辨率极限的显著的分辨率提高。为了产生高分辨率图像，在远场内激励样本并且使其成像。在此，拍摄一系列单独图像并且随即通过累加功能组合为一个具有更高分辨率的单独图像。作为对术语“Super-Resoiut1n Optical Fluctuat1n Imaging” 的简称，这种方法称为S0FI方法。
[0006]在S0FI方法中需要图像序列，其具有在样本之后加入的或者样本中固有的荧光基团的尽可能不同的闪烁状态。同时，摄影机必须能够随时检测闪烁并且同时提供较高的位置分辨率。在实现S0FI原理时，必须考虑到在拍摄单个图像期间尽可能少的荧光基团转换其荧光状态，并且单个荧光基团的波动(也就是荧光状态的转换)能够针对单个图像进行检测。因此，S0FI方法在以前特别用于较薄的样本，这些样本在荧光材料方面基本不具有沿成像光轴的深度延伸。因此可以考虑对样本进行TIRF照明，以便确保在拍摄单个图像期间没有依次设置的荧光基团转换其荧光状态。
[0007]本发明所要解决的技术问题在于，提供一种按照S0FI原理的高分辨率显微术方法，通过所述方法也可以分析较厚的样本，也就是说消除了对可能样本的限制。
[0008]该技术问题按本发明通过一种用于产生样本的高分辨率图像的显微术方法解决，其中，所述方法具有以下步骤:
[0009]a)为样本配设在激励之后(可)统计闪烁地发出特定的荧光射线的物质，或者使用含有这种物质的样本，
[0010]b)使照明射线入射到样本上并且由此激励样本以发出荧光射线，
[0011]c)沿光轴将发出荧光射线的样本重复地成像在分辨位置的探测器上，从而得到图像序列，
[0012]d)借助累加功能对图像序列进行处理，所述累加功能分析图像序列内由于闪烁引起的强度波动，并且由此产生所述物质在样本内的局部分布的图像，所述图像具有比成像的光学分辨率更高的位置分辨率，
[0013]其中，
[0014]e)照明射线这样入射，使得照明射线沿光轴只在有限的深度区域内激励样本以发出荧光射线。
[0015]按照本发明将S0FI原理与光学剖面方法进行结合，以便也能够在深度方向上对荧光样板进行高分辨率的成像。由此不只避免了成像时焦点外背景所带来的影响，也避免了由于样本在完全未被成像的深度区段内被激励荧光所带来的负载。
[0016]光学切割能够以不同的方式方法进行。在一种实施形式中，使用所谓的临时聚焦，其例如在本申请人的专利文献DE 102009060793A1中描述。在另一种实施形式中，入射横向于成像光轴的光片。
[0017]另一种实施形式使用多光子过程，以便在样本中产生闪烁状态。这是令人惊讶的，因为直接的多光子激励需要点扫描仪，所述点扫描仪优选不能用于S0FI原理，因为其可能要求图像具有格栅结构。但是S0FI原理要求整个样本在不同闪烁状态下成像的同时性，并且不能与格栅状的图像结构协调。尽管如此，多光子效应仍能用于S0FI原理的光学切割，方法是使用一种物质，其可通过光学变换射线的入射在第一与第二状态之间进行变换。这种物质只能在第二状态下被激励用于发出荧光射线。由此可以通过格栅式变换这样制备样本，使得只有被选择的深度区域能够在接下来的荧光激励步骤中进行闪烁。然而样本只在事先通过格栅式多光子作用选出的深度区域内平面地发荧光。所述变换射线优选通过多光子过程格栅式地置入，因为所述多光子过程允许定义出特别紧密限定的深度区域。所述变换射线当然也可以借助临时聚焦置入，以便在不进行格栅式扫描的情况下选择深度地进行多光子激励。
[0018]如果通过变换射线选择深度地制备了样本，则接下来对样本的激励可以在不进一步结构化的情况下进行，因为样本只在之前制备的深度区域内进行变换并且因此只能在该处显示S0FI原理所需的闪烁特性。
[0019]所述借助变换射线进行样本制备的过程使得只有选出的深度区域显示出特定的闪烁特性，随即在S0FI过程中分析这种闪烁特性。在此，作为闪烁参数可以考虑一个或多个以下参量:黑暗时长、在闪烁的黑暗状态与明亮状态之间的过渡概率、闪烁的明亮/黑暗时间比。
[0020]针对S0FI原理，力求优化闪烁的黑暗和明亮时间与荧光基团的闪烁概率之比。亮与暗的荧光基团的比例最佳是1:1，因为这样平均在每个单独图像中有全部荧光基团的一半发光。如果实现了这点，则所需的单独图像的数量被最小化。
[0021]因此优选尽可能快地拍摄图像，通过适当地调节变换射线来调节闪烁的亮/暗时间比并且优选使亮/暗时间比与探测器的单个图像拍摄率适配。此外，可以通过所述照明参数使标记或样本的闪烁参数适配，所述闪烁参数影响黑暗时长和/或在闪烁的黑暗状态与明亮状态之间的过渡概率;两者均用于达到或者接近最佳比例1:1。
[0022]作为对通过照明射线进行影响的补充，也可以借助对相关分子的周期进行化学控制来实现对物质的处理，在所述分子中发出荧光射线(明亮状态)或者不发出荧光射线(黑暗状态)。在此所力求的状态占有数在亮暗状态的周期相同的情况下实现了亮暗之间为0.5的过渡概率。
[0023]以下例如根据也披露了本发明的主要特征的附图进一步阐述本发