路(通过元件17至19实现)的结合实现。在这种实施形式中，变换射线的扫描不是必须的，因为临时聚焦已经实现了深度选择。
[0044]图3针对按照图4的方法的实施形式示出了显微镜，在此用于通过多光子过程的扫描的样本制备。在这个实施形式中，元件9至11这样变型(未示出)，使得它们实现了通过激励射线对样本2的远场照明。所述激励可以横向于光轴6进行，但备选地也可以沿着光轴6进行。附加地设置分束器20，其由来自扫描仪21的射线供给，所述扫描仪扫描地使来自变换射线源22的原始射线转向。因此存在扫描经过样本2的变换射线23。所述变换射线借助多光子效应使得物质样本2变换到能够被激励射线激励的状态。基于多光子过程，变换物质所需的强度只存在于样本2的紧密限定的深度区域内。因此，步骤S2a通过适当地控制扫描仪21和变换射线源22进行，步骤S2b通过适当地控制射线源9进行。
[0045]在显微镜的所有实施形式中，设有(未示出的)控制设备，其适当地控制显微镜的部件以实施按照图1或者图4的方法。
[0046]由单个图像组成的图像序列In在S0FI处理步骤S4中转换为高分辨率图像If。在此例如应用由Dertinger等人描述的原理。同样也可以应用相对于Dertinger等人的原理进行了扩展设计的按照WO 2010/141608A1的方案。在此，这些公开出版物也在这方面完全包含在本发明中。
[0047]S0FI原理所需的荧光基团的闪烁通过从发荧光的第一状态向不发荧光的第二状态的过渡定义。在此，不发荧光的状态理解为不发出针对图像被分析的荧光射线的状态。因此，不发荧光的状态是荧光基团在另一荧光光谱范围内发光的状态。
[0048]从第一状态向第二状态的过渡概率可以如由Heilemann等人的公开出版物Angewandte Chemie 121,S.7036,2009已知的那样进行修改，例如通过化学影响、温度影响或者照明影响修改。
[0049]如果用于相应的图像拍摄率或图像整合时间的发光和不发光的荧光基团之间的比例是1:1，则S0FI原理是特别有效的。在这两种状态的周期相同的情况下，第一和第二状态之间以及第二和第一状态之间的过渡概率在理想情况下是0.5。这可以通过借助化学作用、温度作用或者照明作用相应地处理样本来实现。在此，可以通过优化入射的光谱分布来优化过渡概率，以便达到所述的最佳比例1:1。因此，S0FI原理所要求的过渡概率与其它显微术方法明显不同。在PALM原理例如(也称为dSTORM)要求的状态中，荧光基团在很大比例下处于黑暗状态。
[0050]为了实现尽可能有一半的荧光基团处于明亮状态，除了过渡概率还必须考虑黑暗时长。即使从亮至暗的过渡概率为0.5，如果黑暗状态的周期非常长，也不能达到1:1的最佳比例。因此，在现有技术中使用的用于修改过渡概率和黑暗时长的方法特别优选地(并且与可小于样本场的像场的成像完全无关地)用于将发光与不发光的荧光基团的比例朝最佳值1:1的方向进行优化，方法是对过渡概率和/或黑暗周期(或者明亮周期)进行适当调节并且与图像拍摄率或整合时间适配。相反地也可以使拍摄率与周期适配。
【主权项】
1.一种用于产生样本(2)的高分辨率的图像(If)的显微术方法，其中，所述方法具有以下步骤: a)为样本(2)配设在激励之后可统计闪烁地发出特定的荧光射线的物质，或者使用含有这种物质的样本(2)， b)使照明射线(10)入射到样本(2)上并且由此激励样本(2)以发出荧光射线， c)沿光轴(OA)将发出荧光射线的样本(2)重复地成像在分辨位置的探测器(5)上，从而得到图像序列(In)， d)借助累加功能对图像序列(In)进行处理，所述累加功能分析图像序列(In)内由于闪烁引起的强度波动，并且由此产生所述物质在样本(2)内的局部分布的图像(If)，所述图像具有比成像的光学分辨率更高的位置分辨率， 其特征在于， e)照明射线(10)这样入射，使得照明射线(10)沿光轴(OA)只在有限的深度区域内激励样本(2)以发出荧光射线。2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，借助暂时地聚焦(12-14)在有限的深度区域上来限制照明射线(10)的入射。3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，为照明射线提供具有脉冲长度的脉冲的原始射线并且指向散射元件(12)，所述散射元件处于借助光学器件(13、14、3)成像在图像平面(15)内的平面中，所述图像平面处于样本(2)内，由此照明射线在样本(2)内只在该图像平面(15)中具有最小脉冲长度，并且在图像平面(15)与散射元件(12)之间的脉冲长度大于最小脉冲长度和原始射线的脉冲长度。4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述照明射线(10)只入射到横向于光轴(6)的光片(16)内并且由此被限制在有限的深度区域上。5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述物质能够通过光学变换射线的入射在第一和第二状态之间变换，其中，所述物质在第一状态下不能被激励用于发出荧光射线，并且在第二状态下能够被激励用于发出荧光射线，并且在步骤b)中，照明射线的入射包括光学变换射线(10)的入射，其中，所述光学变换射线(10)调节所述特定的荧光射线的闪烁参数。6.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述光学变换射线(10)通过双光子效应进行物质的变换，并且通过所述光学变换射线(10)扫描样本(2)，其中，扫描样本(2)中的定义深度区域的聚焦平面。7.按权利要求5所述的方法，其特征在于，借助暂时地聚焦在有限的深度区域上来限制光学变换射线(10)的入射。8.按权利要求2所述的方法，其特征在于，为了光学变换射线(10)提供具有脉冲长度的脉冲的原始射线并且指向散射元件(12)，所述散射元件处于借助光学器件(13、14、3)成像在图像平面(15)内的散射平面(15)中，所述图像平面处于样本(2)内，由此光学变换射线(10)在样本(2)内只在该图像平面(15)中再次具有原始射线的脉冲长度。9.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述光学变换射线(10)只入射到横向于光轴(6)的光片(16)内并且由此被限制在有限的深度区域上。10.按权利要求5至9之一所述的方法，其特征在于，所述闪烁参数包括:黑暗时长和/或在闪烁的黑暗状态与明亮状态之间的过渡概率和/或闪烁的明亮/黑暗时间比。
【专利摘要】本发明涉及一种用于产生样本(2)的高分辨率图像(If)的显微术方法，所述方法具有以下步骤：a)为样本(2)配设在激励之后可统计闪烁地发出特定的荧光射线的物质，或者使用含有这种物质的样本(2)，b)使照明射线(10)入射到样本(2)上并且由此激励样本(2)以发出荧光射线，c)沿光轴(OA)将发出荧光射线的样本(2)重复地成像在分辨位置的探测器(5)上，从而得到图像序列(In)，d)借助累加功能对图像序列(In)进行处理，所述累加功能分析图像序列(In)内由于闪烁引起的强度波动，并且由此产生所述物质在样本(2)内的局部分布的图像(If)，所述图像具有比成像的光学分辨率更高的位置分辨率，其中，e)照明射线(10)这样入射，使得照明射线(10)沿光轴(OA)只在有限的深度区域内激励样本(2)以发出荧光射线。
【IPC分类】G02B21/36, G02B27/58, G02B21/16
【公开号】CN105452931
【申请号】CN201480043416
【发明人】T.卡尔克布伦纳, I.克莱普
【申请人】卡尔蔡司显微镜有限责任公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年7月18日
【公告号】DE102013216124A1, EP3033647A1, US20160195704, WO2015022146A1