专利名称：筛查16SrI组植原体的芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物信息学及生物检疫鉴定技术领域，尤其涉及筛查16SrI组植原体的芯片及其应用。
背景技术：
16SrI组为翠菊黄化组(Ca. Phytoplasma asteris)，组下分为11个亚组，目前 16SrI组是含有植原体种类最多的组，含有二百余个植原体株系，主要包括翠菊黄化植原体、洋葱黄化植原体、马铃薯紫顶病植原体、苜蓿矮化植原体、草莓矮化植原体、泡桐丛枝植原体等。危害症状主要包括叶片黄化(yellowing)或变红(reddening of leaves)、节间缩短(shortening of internodes), (stunt) ,/JnBf (little leaves)、|^^1贞±曾1胃帛致的丛枝(excessive proliferation of shoots resulting in a witches'broom)、变叶 (phyllody, leaf-like petals and sepals)、參录变(virescence, excess ive greening of floral tissue)、花不育(sterile flowers)，韧皮部组织坏死(necrosis)、木本植物的枯梢(diehck)以及植株的生长衰退(decline)和死亡等。与其它16SrI组植原体相比，泡桐丛枝植原体在我国发生与分布范围相对较广。 六十年代之后，大规模泡桐人工造林运动的开展和全国规模的种苗调运，泡桐丛枝病的发生和危害逐渐加重，目前除少数泡桐生长区外，各泡桐产区都普遍遭受此病的危害。在重病区的河南、山东、陕西等省区，苗期发病率为1-8 %，1-3年生幼树发病率为5 % -10 %，3-5年中幼龄树可达30-50%，10年生树可达100%。此病害造成直接经济损失包括死苗和幼树的死亡，成年树干型差和材积的减少。据报道，1990年对河南、山东、陕西、河北、安徽、甘肃、江苏和山西等省的调查显示，全国丛枝病发生面积达88万公顷，每年造成直接经济损失超过一亿元。目前用于16SrI组植原体的检测方法包括普通PCR、荧光PCR、电子显微镜技术、荧光显微镜等，该类方法存在特异性不强、步骤繁琐等局限性，而且对于未知的、新发的植原体无法进行检测与监测。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种筛查16SrI组植原体的探针。本发明提供的筛查16SrI组植原体的探针，由5条探针组成，所述5条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-5。上述探针中，16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。本发明的另一个目的是提供一种筛查16SrI组植原体的基因芯片。本发明提供的筛查16SrI组植原体的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。在上述基因芯片中，所述片基为醛基化玻璃片基，在本发明的实施例中采用的是博奥生物有限公司晶芯 微阵列基片，产品目录号420022。
在上述基因芯片中，所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。本发明的第三个目的是提供一种筛查16SrI组植原体的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述的基因芯片。在上述试剂盒中，还包括如下引物组所述引物组由如下引物对A-引物对D的4对引物对组成；所述引物对A由引物1和引物2组成；所述引物对B由引物3和引物4组成；所述引物对C由引物5和引物6组成；所述引物对D由引物7和引物8组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列7 ；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列8 ；所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列9 ；所述引物5的核苷酸序列为序列表中的序列10 ；所述引物6的核苷酸序列为序列表中的序列11 ；所述引物7的核苷酸序列为序列表中的序列12 ；所述引物8的核苷酸序列为序列表中的序列13 ；上述试剂盒由上述的基因芯片和上述引物组组成。上述试剂盒中，所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。本发明的第四个目的是提供一种用于筛查16SrI组植原体的引物组。本发明提供的引物组，由如下引物对A-引物对D的4对引物对组成；所述弓丨物对A由引物1和引物2组成；所述弓丨物对B由引物3和引物4组成；所述弓丨物对C由引物5和引物6组成；所述弓丨物对D由引物7和引物8组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列7 ；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列8 ；所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列9 ；所述引物5的核苷酸序列为序列表中的序列10 ；所述引物6的核苷酸序列为序列表中的序列11 ；所述引物7的核苷酸序列为序列表中的序列12 ；所述引物8的核苷酸序列为序列表中的序列13 ；所述16SrI组植原体具体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。本发明还提供一种用于筛查16SrI组植原体的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、dNTP、PCR缓冲液和聚合酶组成。上述PCR试剂中，上述引物组中的各条引物在所述PCR试剂中的浓度均为 0.2mmol/L。
所述16SrI组植原体具体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。上述探针、上述基因芯片、上述的试剂盒、上述的引物组或上述的PCR试剂在鉴定或辅助鉴定16SrI组植原中的应用也是本发明保护的范围。上述探针、上述基因芯片、上述的试剂盒、上述的引物组或上述的PCR试剂在制备鉴定或辅助鉴定16SrI组植原产品中的应用也是本发明保护的范围。所述16SrI组植原体具体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。本发明的第五个目的是提供一种筛查或辅助筛查待测样品感染16SrI组植原体的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)将待测样品的基因组DNA进行标记，得到标记后产物；2)将步骤1)得到的标记后产物与上述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；2)将步骤1)得到的杂交后芯片扫描；若所述基因芯片上至少一条所述探针的信号绝对值大于5000且信噪比大于3. 0， 则待测样品感染或候选感染16SrI组植原体。所述至少一条所述探针为5条探针。在上述方法中，步骤1)中，所述标记为以待测样品的基因组DNA为模板，以上述引物组进行PCR扩增，得到标记后产物；在上述方法中，步骤2)中，所述杂交的温度为42°C，所述杂交的时间为12h。在上述方法中，在所述步骤2、后和步骤幻前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤。在上述方法中，所述16SrI组植原体具体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。本发明的实验证明，本发明提供的筛查16SrI组植原体的芯片中的探针具有 16SrI组植原体组水平上的高兼容性和植原体组内的特异性，数小时内完成对待检样品中可能存在的新发植原体的筛查，所需的样品量极少，一般仅需0. lg。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直观化、可视化。本发明采用生物信息学方法对 16SrI组植原体的16S rDNA、16S_23S rDNA spacer、imp、tuf核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准植原体样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查16SrI组植原体的芯片可用于16SrI组植原体的检疫鉴定。
图1为16SrI组植原体筛查芯片探针点阵示意图(5X6)图2为应用草莓枝状果植原体标准样品验证16SrI组植原体筛查芯片的结果图3为应用泡桐丛枝植原体标准样品验证16SrI组植原体筛查芯片的结果图4为筛查芯片灵敏度检测结果图5为PCR灵敏度检测结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、筛查16SrI组植原体的芯片的制备1、组级高兼容性寡核苷酸探针的设计1)从美国国立生物技术信息中心(NCBI)及核糖体数据库项目官方网站(RDP)数据库下载16SrI组植原体全基因组及核酸序列数据用于设计探针。2)整理植原体核酸序列，去除小于200bp长度的核酸序列并分组；同一组内所有植原体序列简称为组内序列，非本组的所有植原体序列简称为组外序列。3)使用ClusterW联配组内序列，寻找序列保守区域设计探针。探针设计时在序列保守区域内以2 3个碱基作为间隔，连续提取所有19bp的核酸序列，对选取的核酸序列进行筛选，标准为GC含量在40%及60%之间，没有大于!3bp的连续重复碱基，以及不会形成大于:3bp的发卡结构。4)使用自编程序将通过步骤幻筛选的探针序列与组外序列联配，程序计算二级结构的自由能、MMPD(The distance of the mismatch in the middle position)、最长相同片段等条件进行综合打分，弃用高于模拟杂交标准分的探针。5)使用自编程序将通过步骤4)筛选的探针序列与组内序列进行比对，程序计算打分，弃用低于模拟杂交标准分的探针。6)使用BLASTN将通过步骤5)筛选得到的探针序列与步骤2)得到的特异性数据库进行特异性比对，Word size设为7，筛选标准为Max Score小于15分，并且无7bp以上的相同片段7)对于剩余的每一条探针进行排序，排序标准依次为探针对组内序列模拟杂交总分、探针对组外序列模拟杂交总分及探针对特异性数据库的BlastN Max Score总分，取排名前两名的两条探针为组特异性探针。8)如果经过步骤7)无法达到每组至少2个探针对应的标准，则在步骤3)降低序列保守性标准，重新设计，依此循环直到所有16SrI组序列都有2个探针对应。如果无法从保守区域设计探针，或16SrI组内序列无保守区域，则使用所有16SrI组全长序列设计探针。探针设计标准与步骤幻到步骤7)相同。根据上述原则设计了 16S rDNA区域的1条探针(探针1)、tuf的2条探针(探针 57和探针58)、16S-23S rDNA spacer的1条探针(探针73)、及imp基因的1条探针(探针76)，其核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、2、3、4、5所示。可以人工合成上述5条探针。2、芯片的制备将上述1得到的5条探针用点样缓冲液(博奥生物有限公司晶芯 芯片点样液，产品目录号440010)溶解，浓度为50 μ Μ,每条探针横向重复3点点在醛基化玻璃片基芯片 (博奥生物有限公司晶芯 微阵列基片，产品目录号420022)上，每点约0. 25nL,点直径约 180 μ m，点间距为300 μ m，点样均勻度的标准方差为15%。将芯片点有探针的一面在65°C 水浴锅上水合10s，芯片距水面距离为3cm，在空气中室温自然干燥，在进行一次水合。将点有探针的一面向上，放在紫外交联仪中250mJ交联。将芯片放在42°C预热，0. 5% SDS清洗lOmin。将芯片转移到42°C预热蒸馏水中清洗aiiin。把芯片放在50ml锥形离心管中， 2000rpm离心lmin，以去除芯片表面的液体，获得筛查16SrI组植原体的芯片。
筛查16SrI组植原体的芯片如图1所示，图1中1、57、58、73、76为16SrI组植原体筛查芯片探针1、57、58、73、76(对应序列1_5)，Hex为芯片固定阳性质控，PC为杂交阳性质控，NC为杂交阴性质控。实施例2、筛查16SrI组植原体的芯片的应用一、筛查16SrI组植原体的芯片检测样品1、用于检测的样品总DNA提取1)取感染草莓枝状果植原体的草莓叶片(拉丁名=Strawberry Phylloid Fruit Phytoplasma, id^ci :Molecular Identification and Classification of Strawberry Phylloid Fruit Phytoplasma in Group 16SrI, New Subgroup.Plant disease,2002, 86(8) :920.，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。)和感染泡桐丛枝植原体的泡桐叶片(拉丁名Paulownia witches' broom phytoplasma.记载在泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白抗血清的制备及应用，植物病理学报，2011,41 ) :161-170.)各0. lg，取适量液氮研磨， 再加入研磨液2ml充分研磨，4°C 20000rpm离心20min，弃上清。2)加入ImlDNA提取液，40ul蛋白酶K(5mg/ml)，轻轻混勻，加入160ul 10%十二烷肌氨酸钠，混勻，在55°C温育1 2小时，期间不断的颠倒混勻，4°C 6000rpm, IOmin,取上清。3)加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻混勻，-20°C保持至少30min，4°C 12000rpm, 15分钟，弃上清。4)加入600ul带有RNase的水液，加入30ulSDS，12ul蛋白酶K，轻轻彻底混勻， 37°C温育60分钟。5)加IOOul 5M NaCl混勻，再加入84ulCTAB/NaCl溶液混勻，65°C温育10分钟。6)加入等体积苯酚氯仿异戊醇05 24 1)混勻，4°C 12000rpm，10分钟，
重复直至无中间白色层。7)上层水相加入等体积氯仿异戊醇04 1)，混勻，4°C 12000rpm，10分钟。8)上清液加入2/3体积异丙醇，混勻，_20°C保持至少30分钟，4°C 12000rpm, 10分
钟，弃上清液。9)加入Iml 70%乙醇12000rpm离心1分钟。洗涤两次。加入30ul TE混勻溶解， 分别得到草莓枝状果植原体基因组DNA和泡桐丛枝植原体基因组DNA。2、样品标记与杂交标记体系为20 μ L，即在每个0. 2mL的反应管中加入2μ L上述1得到的基因组 DNA、上游引物0. 2 μ L (终浓度为0. 2mmol/L)、下游引物0. 2 μ L (终浓度为0. 2mmol/L，5’端 TAMARA 标记)、dNTP Mix (10mmol/L) 1· 6 μ L、LA-Taq 酶 0· 5 μ L、10 X Buffer (Mg2+) 2 μ L 及 DEPC-H20 13.5 μ L0上下游引物由分别用于扩增包括16S rDNA、16S-23S rDNA spacer、imp及tuf探针序列的引物对组成，上述用于扩增16S rDNA的引物对由序列表中的序列6和序列表中的序列7组成；上述用于扩增16S-23S rDNA spacer的引物对由序列表中的序列8和序列表中的序列9组成；上述用于扩增imp的引物对由序列表中的序列10和序列表中的序列11组成；
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上述用于扩增tuf的引物对由序列表中的序列12和序列表中的序列13组成。PCR 反应程序-MV 5min ；94°C 30sec，60°C 30sec，72°C Imin 30sec, 35cycles ； 72°C IOmin。杂交杂交液包括2. 4μ L 3XSSC.0. 32 μ L 0. 2% SDS、4 μ L25% 甲酰胺、0. 32 μ L 外标、1. 6 μ L5XDenhard，s及标记样品7. 36 μ L ；95°C变性3min,冰浴5min,瞬时离心；将杂交液加到由实施例1得到的16SrI组植原体筛查芯片上，盖薄片盖好，42°C水浴杂交过夜 (12h)。分别得到杂交后的芯片(草莓枝状果植原体)和杂交后的芯片(泡桐丛枝植原体)。3、洗涤、扫描清洗体系及程序如下
洗液I洗液II
洗液组分(最终浓度)2xSSC, 0.2%SDS 0.2xSSC
清洗温度42。C42 V
清洗时间4min4min先将洗液I、II放在微波炉中预热到42V，转移到清洗盒中。杂交结束后，将杂交后的芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面向上，放在水平摇床上缓慢清洗。芯片清洗后，放在50ml锥形离心管中，2000rpm离心lmin，除去芯片表面的液体，分别得到待检测芯片(草莓枝状果植原体)、待检测芯片(泡桐丛枝植原体)。将上述待检测芯片(草莓枝状果植原体)、待检测芯片(泡桐丛枝植原体)置于扫描仪中进行扫描分析；PMT设为900，获得各点荧光强度、背景强度等数据。使用博奥生物开发的LuxScan 3. 0从扫描的芯片中提取数据，探针的信号值为探针前景值的中位值减去背景值的中位值。信噪比为图像对应点内所有信号值中位值与背景值中位值的比值。若至少一条所述探针的信号绝对值均大于5000且信噪比均大于3. 0，判为阳性 (为16SrI组植原体感染)；探针的信号绝对值均小于5000且信噪比均小于2. 0，判为阴性 (不为16SrI组植原体感染)；如果信号模糊且信噪比介于2. 0和3. 0之间，判为可疑，实验
需重复验证。图2、图3的探针排列与图1相同，阳性探针均为1、57、58、73、76。草莓枝状果植原体的结果如图2所示，探针1、57、58、73、76所在位置的信号绝对值均为7000 ；且信噪比均为4，说明本发明可以检测16SrI组植原体的草莓枝状果植原体；泡桐丛枝植原体的结果如图3所示，探针1、57、58、73、76所在位置的信号绝对值均为7500 ；且信噪比均为4. 5，说明本发明可以检测16SrI组植原体的泡桐丛枝植原体；上述芯片的固定阳性质控、杂交阳性质控及杂交阴性质控表现良好，标准样品杂交信号强而无背景噪音，说明设计的探针及建立的芯片筛查程序具有良好的工作效果。二、筛查16SrI组植原体芯片与PCR检测灵敏度比较准确称取0. Ig泡桐丛枝植原体侵染的泡桐叶片，提取基因组DNA，分别用于16SrI
组植原体筛查芯片检测和PCR检测，两者所用的DNA均进行5°、5人5_2、5_3和5_4倍梯度稀释。芯片检测的方法同上述的一，芯片检测实验结果如图4所示，图4的探针排列与图1相同，其中A :5_2稀释；B 5_3稀释；C :5_4稀释；可以看出，16SrI组植原体筛查芯片可检测到待检对象的最高稀释倍数为54。PCR检测的引物为上游引物5，-CCTGTTAACTGGCTTTCTCCTA-3，；下游引物5，-GGAGGTTTTTGGCATTATCG-3，。PCR检测的结果如图5所示，1 :5°稀释；2斤1稀释；3 :5_2稀释；4 :5_3稀释；5 5-4稀释；M =Marker DL2000，可以看出，均得到34Ibp的产物(Genbank号NC 005303的第 688569-688909位核苷酸)，待检对象的最高稀释倍数为53。因此，16SrI组植原体筛查芯片检测灵敏度比PCR方法高5倍。
权利要求
1.一种筛查16SrI组植原体的探针，由5条探针组成，所述5条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-5。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。
3.—种筛查16SrI组植原体的基因芯片，为将权利要求1或2所述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。
4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述片基为醛基化玻璃片基；所述 16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。
5.一种筛查16SrI组植原体的试剂盒，包括权利要求3或4所述的基因芯片。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括如下引物组 所述引物组由如下引物对A-引物对D的4对引物对组成；所述引物对A由引物1和引物2组成；所述引物对B由引物3和引物4组成；所述引物对C由引物5和引物6组成；所述引物对D由引物7和引物8组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列7 ；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列8 ；所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列9 ；所述引物5的核苷酸序列为序列表中的序列10 ；所述引物6的核苷酸序列为序列表中的序列11 ；所述引物7的核苷酸序列为序列表中的序列12 ；所述引物8的核苷酸序列为序列表中的序列13 ；所述试剂盒由权利要求3或4所述的基因芯片和所述引物组组成；所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。
7.一种用于筛查16SrI组植原体的引物组，由如下引物对A-引物对D的4对引物对组成；所述引物对A由引物1和引物2组成； 所述引物对B由引物3和引物4组成； 所述引物对C由引物5和引物6组成； 所述引物对D由引物7和引物8组成； 所述引物1的核苷酸序列为序列表中的序列6 ； 所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列7 ； 所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列8 ； 所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列9 ； 所述引物5的核苷酸序列为序列表中的序列10 ； 所述引物6的核苷酸序列为序列表中的序列11 ； 所述引物7的核苷酸序列为序列表中的序列12 ； 所述引物8的核苷酸序列为序列表中的序列13 ；所述16SrI组植原体具体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。
8.权利要求1或2所述探针、权利要求3或4所述的基因芯片、权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7所述的引物组在鉴定或辅助鉴定16SrI组植原中的应用；或权利要求1或2所述探针、权利要求3或4所述的基因芯片、权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7所述的引物组在制备鉴定或辅助鉴定16SrI组植原产品中的应用； 所述16SrI组植原体具体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。
9.一种筛查或辅助筛查待测样品感染16SrI组植原体的方法，包括如下步骤1)将待测样品的基因组DNA进行标记，得到标记后产物；2)将步骤1)得到的标记后产物与权利要求3或4所述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；2)将步骤1)得到的杂交后芯片扫描，若所述基因芯片上至少一条所述探针的信号绝对值大于5000且信噪比大于3. 0，则待测样品感染或候选感染16SrI组植原体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述标记为以待测样品的基因组DNA为模板，以权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7所述的引物组中的引物组进行PCR扩增，得到标记后产物； 步骤幻中，所述杂交的温度为42°C，所述杂交的时间为12h; 在所述步骤幻后和步骤幻前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤； 所述16SrI组植原体具体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。
全文摘要
本发明公开了一种筛查16SrI组植原体的芯片及其应用。本发明的的筛查16SrI组植原体的探针，由5条探针组成，所述5条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-5。还提供了筛查16SrI组植原体的基因芯片，为将上述的探针固定在芯片表面得到的基因芯片。本发明的实验证明，本发明采用生物信息学方法对16SrI组植原体的16S rDNA、16S-23S rDNA spacer、imp、tuf核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准植原体样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查16SrI组植原体的芯片可用于16SrI组植原体的检疫鉴定。
文档编号C40B40/06GK102492773SQ20111040276
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者张永江, 朱水芳, 牟海清, 赵文军 申请人:中国检验检疫科学研究院