专利名称：检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种基因芯片和检测方法，特别涉及一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片及其检测方法。
背景技术：
猪呼吸道疾病综合征(PRDC)是一个有多重表现的疾病问题，已成为猪病中最为突出的疾病之一。PRDC是多种病毒和细菌同时或先后感染后产生协同效应和加性效应的结果，往往首先由病毒引起，并通常继发条件性病原菌感染。由于猪呼吸道疾病综合征是一种多因子疾病，不同猪场甚至同一猪场分离的病原都不同，针对这一疾病的诊断，传统的方法有血清学检测、单个病毒的PCR检测方法等，这些技术有的耗时长，有的费用高，且均不能进行多种病原体的同时检测，因此难以达到快速、准确、高通量的目的，导致了其诊断和 防治的难度。1997 年 7 月，Affymetrics , Inc. (Santa Clara, CA)公司的 Thomas, R.等人发明的第6，228，575号美国专利公开了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的核酸分析检测技术建立起来，并随着人类基因组计划的开展而逐步发展。随着基因芯片这一生物技术的发展，利用芯片的高通量、高敏感性、重复性和专一性的特点，可在同一张芯片上同时检测多个病毒基因，使得它与其它诊断技术相比，诊断速度和精确性显著提高。近年来，国内外关于利用基因芯片检测病原微生物的报道已有不少，例如，2001年Li等人在《临床微生物学杂志》中利用芯片技术分析了人流感病毒A和病毒B以及它们的亚型，并认为与基于PCR的诊断方法相比较，基因芯片技术是更有效的诊断方法。2006年Baxi等人在《兽医杂志》中将芯片技术用于口蹄疫的诊断和鉴定，认为该技术是唯一能同时鉴定和诊断多病原的方法。国内的学者们也先后将基因芯片技术成功用于人和动物的各种病毒和细菌方面等的检测，2007年陈红军等人在《畜牧兽医学报》中发表了猪流感病毒分型基因芯片的建立和初步应用的研究，肖国生等人在《中国兽医杂志》中发表了基因芯片用于病原微生物的检测和分型的研究，而杨林等人也分别在《中国兽医杂志》、《中国动物检疫》中公开了猪瘟病毒检测用寡核苷酸芯片探针的筛选以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒基因芯片检测技术的建立与优化的研究。因此，针对PRDC的诊断非常复杂和繁琐这一难题，利用芯片技术进行PRDC的诊断是一种较为有效的方法。目前尚未见有应用基因芯片进行猪呼吸道疾病综合症病毒检测的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片及其检测方法。针对猪呼吸道疾病综合征是一种多因子疾病，传统的方法如血清学检测、单个病毒的PCR检测方法等都很难准确、及时的诊断的缺陷，本发明采用基因芯片技术，建立可同时检测引起猪呼吸道疾病综合征的几种不同病毒感染的基因芯片及其检测方法，提高该病的诊断效率，从而解决其临床上诊断困难的问题。
本发明所采用的技术方案是一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针，上述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列
(1)猪繁殖与呼吸综合征病毒的NPS2基因，圆环病毒II型基因组序列990 1500bp之间的基因，伪狂犬病的gE基因和pK基因，猪流感病毒HlNl的ΗΑ、ΝΑ和M基因，猪流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因中选取的DNA序列；
(2)所述(I)中选取的DNA序列的互补DNA序列；
(3)所述(I)或(2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。所述的从猪繁殖与呼吸综合征病毒的NPS2基因，圆环病毒II型基因组序列990 1500bp之间的基因，伪狂犬病的gE基因和pK基因，猪流感病毒HlNl的ΗΑ、NA和M基因，猪流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因中选取的DNA片段具有SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO: 14所示的DNA序列中的一种或者多种DNA序列。所述的质量控制寡核苷酸探针包含杂交阳性对照探针、杂交阴性对照探针、芯片固定阳性对照探针。所述的杂交阳性对照探针包含Υ5基因，具有SEQ ID NO 15所示的DNA序列。所述的杂交阴性对照探针包含tetK基因，具有SEQ ID NO 16所示的DNA序列。所述的芯片固定阳性对照探针具有SEQ ID NO : 17所示的DNA序列。该基因芯片用于猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒II型、伪狂犬病、猪流感病毒H1N1、猪流感病毒H3N2的至少一种的检测。本发明的另一技术方案是一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤
Cl)根据猪繁殖与呼吸综合征病毒的NPS2基因，圆环病毒II型基因组序列990 1500bp之间的基因，伪狂犬病的gE基因和pK基因，猪流感病毒HlNl的ΗΑ、NA和M基因，猪流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因中选取的DNA序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；
(2)按常规方法制备待测样品的基因组DNA或cDNA，使用步骤(I)中引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化靶序列；
(3)标记步骤(2)中的靶序列；
(4)将标记后的靶序列与权利要求I所述的基因芯片杂交；
(5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。上述步骤(I)所应用的检测引物包括SEQ ID NO 18 - SEQ ID NO :31所示的DNA序列中的至少一对。上述步骤(5)中使用判读软件CapitalBio Pig Virus Detection AnalysisSystem分析鉴定杂交结果。上述判读软件CapitalBio Pig Virus Detection Analysis System 按下列步骤分析鉴定杂交结果
(1)探针描述对探针的名称、符号缩写以及阴阳性阈值进行设置；
(2)设置点阵模式 (3)芯片参数设置；
(4)数据分析算法设置；(5)结果列表格式设置；
(6)样品信息设置；
(7)报表样式设置；
(8)点击按键进行结果分析
上述判读软件 CapitalBio Pig Virus Detection Analysis System 的鉴定判断规则为若检测同一病毒的探针中存在任一为阳性，贝1J说明存在该病毒；若检测同一病毒的探针中存在任一为灰区，则说明疑似该病毒。
本发明的优点在于本发明将基因芯片技术引入猪呼吸道疾病综合症病毒的检测，有 效地运用了基因芯片具有的高通量、高敏感性、重复性和专一性好、可在一次试验中同时平行分析成千上万个基因、可在同一张芯片上同时检测多个病毒基因等优点，使得它与其它诊断技术相比，诊断速度和精确性显著提高。针对猪呼吸道疾病综合征的诊断非常复杂和繁琐这一难题，利用芯片技术进行PRDC的诊断无疑是一种较为有效的方法。建立的这种检测几种猪呼吸道疾病综合征病毒的基因芯片及其检测技术，可在一张芯片上同时检测4份样品、5种病毒，大大提高了诊断效率，可解决用于分子流行病学的调查分析，具有重要学术意义及潜在应用前景。
图I为本发明的基因芯片的一个实施例的外形示意图 图2为本发明一个实施例中最终确定的微阵列芯片上点阵分布图
具体实施例方式 为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作如下详细说明，这些实施例是为了说明而不是以任何形式来限制本发明。实施例一探针的设计和制备
1.寡聚核苷酸探针的序列获得
从Genbank公开数据库下载猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的NPS2基因，圆环病毒II型(PCV-2)基因组序列990 1500bp之间的基因，伪狂犬病(PRV)的gE基因和pK基因，猪流感病毒HlNl的ΗΑ、NA和M基因，猪流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因序列；
2.寡聚核苷酸探针的探针设计
将上述序列引入Primer Premire 5. O软件中，抽取所有病毒的ORF序列,进行全局联配，根据联配图得到某指定病毒的特征区段，在特征区域设计特异性探针，特异性位点尽量在探针中间或略靠近探针3’端，设定参数，Tm值尽量在50°C到70°C之间，弃去含有发卡结构、引物二聚体、错配结构的探针，将设计完后的探针与NCBI的数据库进行比对，进行特异性的检验，弃用特异性有问题的探针，对待选用探针的性能进行评价、分级、并调整合适的Tm值。3.寡聚核苷酸探针的探针设计筛选
通过实施例四提供的方法利用杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针，如下表I所示
表I用于检测猪呼吸道疾病综合症病毒的寡聚核苷酸探针 4.
权利要求
1.一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针，其特征在于上述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列 猪繁殖与呼吸综合征病毒的NPS2基因，圆环病毒II型基因组序列990 1500bp之间的基因，伪狂犬病的gE基因和pK基因，猪流感病毒HlNl的ΗΑ、NA和M基因，猪流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因中选取的DNA序列 所述(I)中选取的DNA序列的互补DNA序列； 所述(I)或(2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。
2.根据权利要求I所述的一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片，其特征在于所述的从猪繁殖与呼吸综合征病毒的NPS2基因，圆环病毒II型基因组序列990 1500bp之间的基因，伪狂犬病的gE基因和pK基因，猪流感病毒HlNl的ΗΑ、ΝΑ和M基因，猪流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、ΝΑ基因中选取的DNA片段具有SEQ ID NO I - SEQ ID NO: 14所示的DNA序··列中的一种或者多种DNA序列。
3.根据权利要求I所述的一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片，其特征在于所述的质量控制寡核苷酸探针包含杂交阳性对照探针、杂交阴性对照探针、芯片固定阳性对照探针。
4.根据权利要求3所述的一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片，其特征在于所述的杂交阳性对照探针包含Υ5基因，具有SEQ ID NO 15所示的DNA序列。
5.根据权利要求3所述的一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片，其特征在于所述的杂交阴性对照探针包含tetK基因，具有SEQ ID NO 16所示的DNA序列。
6.根据权利要求3所述的一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片，其特征在于所述的芯片固定阳性对照探针具有SEQ ID NO : 17所示的DNA序列。
7.—种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤 Cl)根据猪繁殖与呼吸综合征病毒的NPS2基因，圆环病毒II型基因组序列990 1500bp之间的基因，伪狂犬病的gE基因和pK基因，猪流感病毒HlNl的ΗΑ、NA和M基因，猪流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因中选取的DNA序列设计并制备出用于PCR扩增的引物； 按常规方法制备待测样品的基因组DNA或cDNA，使用步骤(I)中引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化靶序列； 标记步骤(2)中的靶序列； 将标记后的靶序列与权利要求I所述的基因芯片杂交； 用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。
8.根据权利要求8所述的一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片的使用方法，其特征在于所应用的检测引物包括SEQ ID NO 18 - SEQ ID NO :31所示的DNA序列中的至少一对。
9.根据权利要求8所述的一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片的使用方法，其特征在于上述步骤(5)中使用判读软件CapitalBio Pig Virus Detection AnalysisSystem分析鉴定杂交结果。
10.根据权利要求10所述的一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片的使用方法，其特征是使用上述判读软件CapitalBio Pig Virus Detection Analysis System按下列步骤分析鉴定杂交结果 探针描述对探针的名称、符号缩写以及阴阳性阈值进行设置； 设置点阵模式图； 芯片参数设置； 数据分析算法设置； 结果列表格式设置； 样品信息设置； 报表样式设置； 点击按键进行结果分析。
全文摘要
本发明涉及一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片及其检测方法。其中基因芯片包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针，该寡聚核苷酸探针包括从猪繁殖与呼吸综合征病毒的NPS2基因，圆环病毒II型基因组序列990～1500bp之间的基因，伪狂犬病的gE基因和pK基因，猪流感病毒H1N1的HA、NA和M基因，猪流感病毒H3N2的HA、NA基因中选取的DNA序列。利用设计的引物将待检测样品基因组DNA扩增并标记后,用上述基因芯片进行杂交,根据杂交信号可检测出猪呼吸道疾病综合症病毒。本发明建立的基因芯片及其检测技术，可在一张芯片上同时检测4份样品、5种病毒，大大提高了诊断效率。
文档编号C40B40/06GK102888467SQ20121033812
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月20日 优先权日2012年10月20日
发明者杨小燕, 黄翠琴, 戴爱玲, 黄其春, 尹会方 申请人:龙岩学院