专利名称：一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片、制备方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传检测领域，具体涉及一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片、制备方法及其试剂盒。
背景技术：
肛肠疾病是指与肛门直肠有关的一系列疾病，常见的有痔疮、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、结直肠癌、肛乳头瘤、直肠息肉、乳糜腹泻等，是一种临床常见病、多发病。可发生任何年龄，其中20 49岁患病率最高。中国肛肠协会资料表明，中国肛肠疾病发病率占总人口的59. 9%，全国约7. 7亿人，且呈逐年上升趋势。传统的治疗方法以手术和药物为主，而 且往往达不到理想效果，严重影响患者的身心和健康。肛肠疾病是多基因位点与环境共同作用的结果，目前已有相关研究报道确定了一些基因的单核苷酸多态性(SNPs)与肛肠疾病相关。单核苷酸多态性是由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换以及单个碱基的缺失和插入。其中最少的一种等位基因在群体中的频率不小于1%。作为第三代遗传标记的SNP在人类基因组中约每1000个碱基就出现一个，并具有如下特点(I)数量多，分布广泛；(2)遗传稳定；(3)易于基因分型；(4)适于快速、高通量检出。SNP自身的特性决定了它比其他两类遗传标记更适合于对复杂性状的遗传解析以及基于群体基因识别等方面的研究，促使人们不断地寻找新的SNP标记和革新SNP检测技术。目前已有多种方法可用于SNP检测，传统的SNP检测方法有DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、单链构象多态性(single strand conformational polymorphism, SSCP)、变性高效液相色谱(denaturinghigh performance liquid chromatography,DHPLC)等。这些技术虽在某种程度上能完成对SNP的检测，但距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。DNA芯片技术是近年来新开发的一种基因检测工具。其原理是将大量的寡核苷酸探针有规律地排列在一张玻片上，这些探针可以与信号显示物质标记的样品DNA的扩增序列的互补序列进行相结合，通过对信号物质进行检测，对杂交结果进行计算机软件处理分析，从而获得杂交信号的强度及其分布模式图。基于寡核苷酸芯片的方法为分析SNP提供了一种高通量的技术，为SNP或基因突变提供了一个高通量的检测平台，可用来平行分析已知基因在不同疾病样本中的突变或SNP位点，以获得疾病易感基因的遗传学改变，并作为线索加强临床上早预防、早发现、早诊断和早治疗，具有重要的社会和经济效益。经检索，利用肛肠疾病相关基因多态性检测的基因芯片至今还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于肛肠疾病具体包括结直肠癌、先天性巨结肠症、克罗恩氏病、乳糖不耐受症、溃疡性结肠炎、酒精脸红反应、家族性结肠腺瘤性息肉病、乳糜腹泻和囊性纤维化九种肛肠疾病患病风险评估的基因芯片、制备方法及其试剂盒。—种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片，其特征在于包括固相载体、固定在固相载体上的用于检测肛肠疾病易感基因多态性位点的特异性寡核苷酸探针，所述检测肛肠疾病易感基因多态性位点如下结直肠癌基因多态性位点(SNP)4 个rs4939827、rs6983267、rs3802842、rs961253先天性巨结肠症基因多态性位点(SNP) 5个rsl37852525、rsl04894388、rsl801710、rsl93196427、rsl93123285克罗恩氏病基因多态性位点(SNP)11 个rs2066844、rsl0761659、rs2066845、rs2066847、rsll209026、rs2241880、rs7714584、rs3197999、rslll90140、rsl7234657、 rsl893217乳糖不耐受症基因多态性位点(SNP) 3个rs 193268403、rs 193267205、rsl93116455溃疡性结肠炎基因多态性位点(SNP)4个rs2395185、rs9858542、rsl0883365、rsll209026、酒精脸红反应基因多态性位点(SNP) 3个rs 193229433、rs 193200096、rsl93056481家族性结肠腺瘤性息肉病基因多态性位点(SNP)2f:rsl21912665、rsll3993961乳糜腹泻基因多态性位点(SNP)3个rs2187668、rs6822844、rs6441961囊性纤维化基因多态性位点(SNP)4个rsl93230349、rsl93273640、rsl93221728、rsl93219992 ；针对肛肠疾病易感基因多态性位点，设计了一组寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 1-78所示,具体列表如下表I用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的寡核苷酸探针序列位点名称探针序列(5，— 3’ )rs4939827 Iff-AAAAGAGGAAACAGGACCCCAGAG
1M-CCAAAAGAGGAAATAGGACCCCAGrs6983267 2W-AGCAGATGAAAGGCACTGAGAAAA2M-AGCAGATGAAAGTCACTGAGAAAArs3802842 3W-AAAATCTATCCCAGAAATTCA3M-AGACCCATAGAAAATCTCTCCCArs9612534W-ACATCAAGTAAATTCAGA4M-ACATCAAGTACATTCAGArs137852525 5W-GTTCAGTACCGCATGCAGTG5M-GTTCAGTACCGCGTGCAGTGrs104894388 6W-TTCATACAGAAAGCCTCCGTG6M-TTCATACAGAAAGGCTCCGTGrsl801710 7W-AGACCTTATGGCCCAAGAGTT
权利要求
1.一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片，其特征在于包括固相载体、固定在固相载体上的用于检测肛肠疾病易感基因多态性位点的特异性寡核苷酸探针，所述检测肛肠疾病易感基因多态性位点如下 结直肠癌基因多态性位点(SNP) 4 个rs4939827、rs6983267、rs3802842、rs961253先天性巨结肠症基因多态性位点(SNP) 5个rsl37852525、rsl04894388、rsl801710、rsl93196427、rsl93123285 克罗恩氏病基因多态性位点(SNP) 11个rs2066844、rsl0761659、rs2066845、rs2066847、rsll209026、rs2241880、rs7714584、rs3197999、rslll90140、rsl7234657、rsl893217 乳糖不耐受症基因多态性位点(SNP) 3个rsl93268403、rsl93267205、rsl93116455溃疡性结肠炎基因多态性位点(SNP) 4个rs2395185、rs9858542、rs 10883365、rsll209026、 酒精脸红反应基因多态性位点(SNP) 3个rsl93229433、rsl93200096、rsl93056481家族性结肠腺瘤性息肉病基因多态性位点(SNP) 2个rsl21912665、rsl 13993961乳糜腹泻基因多态性位点(SNP)3个rs2187668、rs6822844、rs6441961囊性纤维化基因多态性位点(SNP)4 个:rsl93230349、rsl93273640、rsl93221728、rsl93219992 ； 所述寡核苷酸探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 1-78所示，具体列表如下 表I用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的寡核苷酸探针序列 位点名称探针序列(5，— 3’ ) rs4939827 Iff-AAAAGAGGAAACAGGACCCCAGAG 1M-CCAAAAGAGGAAATAGGACCCCAG rs6983267 2W-AGCAGATGAAAGGCACTGAGAAAA 2M-AGCAGATGAAAGTCACTGAGAAAA rs3802842 3W-AAAATCTATCCCAGAAATTCA 3M-AGACCCATAGAAAATCTCTCCCA rs9612534W-ACATCAAGTAAATTCAGA 4M-ACATCAAGTACATTCAGArs137852525 5W-GTTCAGTACCGCATGCAGTG5M-GTTCAGTACCGCGTGCAGTGrs104894388 6W-TTCATACAGAAAGCCTCCGTG6M-TTCATACAGAAAGGCTCCGTGr s1801710 7W-AGACCTTATGGCCCAAGAGTT7M-CCAAGGGTTCCAACGCCAGrs193196427 8W-TTCTCATAGCCTACGGACTCGAAC8M-ATAGCCTATGGACTCGAACCGGrsl93123285 9W-ACCCTGTCTCGTGGACCGC 9M-CCCTGTCTCGTGGACTGCCCGGrs2066844 IOff-CCGGAGCAGGGCCTTCTCAGAT
2.根据权利要I所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片，其特征在于所述固相载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，所述的固相载体经不同的化学修饰使其表面带有可以固定核酸分子的活性基团。
3.根据权利要I所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片，其特征在于所述用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片包括阳性对照探针和阴性对照探针，所述的阳性对照探针序列如SEQ ID No. 79所示,所述的阴性对照探针序列如SEQ ID No. 74所示。
4.一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的制作方法，其特征在于它包括以下步骤 (1)将固相载体预处理，待用； (2)根据表I所设计的探针序列，如SEQID No. 1_78所示，人工合成每条寡核苷酸芯片探针； (3)将上述各寡核苷酸芯片探针溶解在点样液中，点样固化即得。
5.根据权利要求4所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的制作方法，其特征在于所述每条寡核苷酸芯片探针在合成时5’端经氨基基团修饰。
6.根据权利要求4所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的制作方法，其特征在于所述固相载体为载玻片，所述的预处理为将载玻片用铬酸洗液洗涤，浸泡过夜，水洗，20wt% 25 1:%氨水浸泡中过夜，水洗，然后浸入氨丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH值至4. O 6. 0，乙醇超声清洗，烘干4 5小时，戊二醛醛基化处理。
7.根据权利要求4所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的制作方法，其特征在于所述点样时每点点样体积为O. 4 O. 6nL，点心间距为500 600 μ m,点直径为200 300 μ m,每条探针重复点样2 3次；所述的固化处理为室温放置24 26小时固化。
8.一种用于肛肠疾病患病风险评估的试剂盒，其特征在于它包括上述权利要求1-3中任一项所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片。
9.根据权利要求8所述的用于肛肠疾病患病风险评估的试剂盒，其特征在于它还包括用于检测肛肠疾病各易感基因多态性位点扩增对应所需的引物，其序列如SEQ IDNo. 80-156所示，和阳性对照扩增对应所需的引物，其序列如SEQ ID No. 157-158所示，见表2。
表2 PCR扩增对于所需的弓I物序列 位点名称引物序列 rs4939827(l)f 5/ -ATATCAACAAGCCCTCTTCA-3' r 5/ -GGAGATGCTGCAAAGCATGA-3'rs6983267(2)f 5/ -CAGCTGCATCGCTCCATAGA-3' r 5/ -ATTGCAGAGTTGCACAGTTA-3'rs3802842 (3)f 5/ -GCCTTCCTCTGCTGTTCCTA-3' r 5/ -ACTGCTTAAGGTGTTGATAC-3'rs961253(4)f 5/ -TCACCCATAATGCTGCTTAG-3' r 5/ -GACAGTTTAGCTCAATATGG-3'rsl37852525(5) f 5/ -ATGGTCATCACGTGGAAGGT-3'r 5/ -GTGGAAGCAGGCGAGCTCAA-3'rsl04894388(6) f 5/ -CACTTTCCTGTCCCATACAT-3'r 5/ -GAAGCAACAGCTCGATATCT-3'rsl801710(7)f 5/ -TTCCTTCCTCTGCTTGTCTC-3' r 5/ -TTCGCATGCACTTGTTCTTG-3'rsl93196427(8) f 5/ -CTCGTCTTAACTGGATAAGG-3'r 5/ -GAGAGTATCTCAGCGTCTGT-3'rsl93123285(9) f 5/ -TGCTGTGCAGGCTCAGGTCT-3'r 5/ -CTCCGTCCAGGTGTGCATGT-3'rs2066844(10) f 5/ -GCCGCACAACCTTCAGATCACAG-3'r 5/ -ATGTCAACTTGAGGTGCCCAACA-3'rs2066845(11) f 5/ -AGTCTGTAATGTAAAGCCACT-3'r 5/ -AAAACTGCAGGATAGACTCTGA-3'rsl0761659(12) f 5/ -AACAAAGGAATCACTAGCAGA-3'r 5/ -GCTAAAGTTTCAGAATGCACA-3'rs2066847(13) f 5/ -ACGGTTACATTTCACTGATGGT-3'r 5/ -CCATTCCTCTCTCCCGTCAC-3'rsll209026(14) f 5/ -TTTATTGGGAATGATCGTCT-3'r 5/ -GTCACCTGTAAAATAGGCCAG-3'rs2241880(15) f 5/ -GAATCTAGAAGGACAGGCTA-3'
10.根据权利要求8所述的用于肛肠疾病患病风险评估的试剂盒，其特征在于它还包括PCR扩增所用的PCR缓冲液，MgCl2, dNTPmix, Taq酶。
全文摘要
本发明涉及一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片、制备方法及其试剂盒。他包括固相载体、固定在固相载体上的用于检测肛肠疾病易感基因多态性位点的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针的核苷酸序列如SEQIDNo.1-78所示。本发明还公开了该基因芯片的制作方法，以及包括该基因方法的试剂盒。其灵敏度高，特异性和可靠性高，可科学预测九种肛肠系统疾病的患病风险，为肛肠疾病的诊断治疗提供分析信息。根据检测分析得到的各肛肠系统疾病的患病风险可有针对性的调整生活饮食习惯，采取相应的其他措施从而预防疾病的发生，或者做到疾病早发现早治疗，提高国民素质，有效预防肛肠疾病的发生。
文档编号C40B50/06GK102876791SQ20121035644
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者徐谋胜, 李兵, 王珊, 袁雅燕, 王宁 申请人:湖北维达健基因技术有限公司