结构、多孔体、传感器、制造结构的方法以及样品的检测方法

专利名称：结构、多孔体、传感器、制造结构的方法以及样品的检测方法
技术领域：
本发明涉及具有多个中孔(mes叩ore)的新结构，多孔材料，传 感器，制造该结构的方法和检测样品的方法。
背景技术：
作为多孔材料，沸石和硅胶向来是已知的。由铝硅酸盐构成的沸 石实践上已经用作吸附剂和离子交换材料，此外还用作催化剂。沸石 是结晶的，具有均一的孔径，并具有优异的性能；然而，其孔径为约 1 nm那么小或更小，因此沸石不能用作大于该孔径的有机化合物的吸 附剂等。硅胶的孔径比沸石的大；然而，其孔径分布广泛范围大，这 带来控制硅胶结构的问题。
由于这样的背景，已开发出称之为中孔材料的材料，其中规律地 排列有大于沸石的孔并且孔径均 一 的孔。中孔材料通过利用表面活性 剂进行生产，并且已报导了由氧化物例如Si02、 Ti02和Zr02形成的 中孔材料。
作为中孔材料的外观形状，报导了以下形状如图15中所示的 没有分枝部分并且是颗粒的外观形状(J. Am. Chem. Soc.， 126， 2004, 7440-7441 (非专利文件l)),以及如图16中所示具有分枝结构(以下 称作"树枝状")的外观形状(Chem. Commu., 1998, 2461-2462 (非专 利文件2))。
以下，当指称中孔材料时，中孔材料(例如图15中所示的颗粒 状中孔材料和图16中所示的树枝状中孔材料)的全部固体部分，将 被特别称为该中孔材料的"骨架"。中孔材料的孔形状已知是贯通该骨 架的管状或者是限制于该骨架内的球状。
如上所述，已经开展对中孔材料的积极研究，但是作为中孔材料 的主要结构，仅仅已知非专利文件1和2中描述的那些。因此，强烈 需求要用于功能装置如生物传感器的具有新结构的中孔材料。发明内容本发明人锐意研究结构控制，目的是获得具有中孔的结构，结果 通过发现可以被制造的新结构而完成本发明。中孔的意思是孔径为2nm或更高并且50nm或更^l氐的孔，如 IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)所定义的。 根据IUPAC,孔径小于2 nm的孔被定义为微孔，孔径大于50 nm的 孔一皮定义为大孔。本发明的一个目的在于提供一种具有中孔的新结构。本发明的另一目的在于提供一种多孔材料、利用该新结构的传感 器和检测样品的方法。根据本发明的一个方面，提供一种具有多个中 孔的结构，包括树枝状骨架，其具有在与骨架的纵向相交的方向上贯穿骨架的中孔。中孔优选与骨架的纵向垂直。树枝状骨架优选通过骨架的分枝部分相互连接形成大孔，或者 在彼此相邻的骨架之间优选形成大孔尺寸化的空间。 优选地，中孔以六角形对称排列。优选地，中孔的孔径分布为，其中80%或更多的中孔落入宽度为 10 nm并包4舌最大11的范围内。生物材料优选被支撑在中孔中。根据本发明的另一方面，提供形成多个颗粒的多孔材料，其包含 由上述结构组成的颗粒。根据本发明的再一方面，提供用于检测样品的传感器，该传感器 由上述多孔材料和电极组成，并且基于样品和支撑在中孔中的生物材 料之间的反应来检测电输出信号。
根据本发明的又一方面，提供一种检测样品的方法，包括以下步
骤
制备传感器，其中生物材料被支撑在上述结构的中孔中；
将含有样品的流体加到该传感器上；和
基于生物材料和样品之间的反应来检观'J输出信号。 根据本发明，可以提供能够用作新功能材料的结构。例如，可以
提供适于柱等的多孔材料。而且，当作为传感器使用时，可以提供灵
敏度高于传统传感器的传感器。


图1A、 IB和1C是本发明结构的示意图2A和2B是用扫描电子显微镜观测的本发明结构的照片；
图3是说明大孔形状的示意图4A和4B是说明中孔构造的示意图5A和5B是说明其中本发明结构被制成用于支撑生物材料的 情况的示意图6是显示实施例1中所制得的中孔硅石(silica)的X射线衍
射结果的曲线图7是用扫描电子显微镜观测的本发明结构的照片；
图8是用扫描电子显微镜观测的本发明结构的中孔的照片；、
图9是表示当过氧化物酶被固定于实施例1中所制得的多孔材料
的中孔中并且在曱苯中进行酶反应时，转化率和经过时间之间关系的
曲线图10是表示当过氧化物酶被固定于实施例1中所制得的多孔材 料的中孔中并且在7 0 。C下进行热处理时，酶的相对活性与热处理时间 之间关系的曲线图11是表示当过氧化物酶被固定于实施例1中所制得的多孔材 料的中孔中并且在预定温度下进行30分钟热处理时，相对活性的温 度依赖性的曲线5
图12是说明其中本发明结构用作生物传感元件的情况的示意图； 图13是说明其中本发明结构可以用作生物传感元件的反应机理 的图解；图14是说明其中本发明结构用作生物传感元件的情况的示意图； 图15是表示一种传统中孔材料实例的照片；和 图16是表示另一种传统中孔材料实例的照片。
具体实施方式
本发明的具有中孔的结构是树枝状的。树枝状是这样的概念，其 不仅包括其中骨架结构只是具有分枝结构的形状，即分枝状，还包括 其中骨架呈连续分枝的形状。作为一个实施方案，本发明还包括形成 三维网络结构的树枝状骨架，如图2A的SEM显微照片和图2B的 SEM显微照片(以比图2A更高的放大率拍摄)、以及图1A的示意 图中所示。以下将参考图1A、 1B、 1C、 2A和2B来描述采用三维网 络结构的实施方案。 (骨架结构)在树枝状骨架12(其多个部分彼此相邻而形成三维网络结构)中 的空间11优选为大孔，即，确保孔在某一方向上的投影面积等于或 大于直径为50mm或更大的圆的面积的空间；换句话-说，空间11的 尺寸优选大于50 nm，更优选为100nm或更大并且700 nm或更小。 具体而言，如图3所示，其中分枝的骨架经过连接形成大孔，在这种 情况下，骨架中的空间优选是这样的，使得大孔的孔径为50nm或更 大，更4尤选为100 nm或更大并且700 nm或更小。图1B是表示骨架12 —部分的放大图，图1C是表示骨架12的 表面14和沿上述方向16的截面17的放大图。如图1B和1C中所示， 中孔13在与纵向15相交的方向16上贯穿骨架12。中孔13在表面 14上具有其开口。构成中孔之间的部分的骨架本身形成"壁"，将中孔 彼此分开。本发明的结构宏观上可以呈颗粒状或薄膜状，但是优选使用如图2A中所示的颗粒状。(中孔的形状、孔径、构造和长度)如果中孔的截面形状是圆，则中孔的孔径是直径，如果中孔的截 面形状是诸如椭圆的变形圆，则孔径是最长轴的长度。对具有中孔的 粉末状结构进行氮气吸附测量，从该测量结果，根据 Berret-Joyner-Halenda (BJH)方法得到孔径分布。优选用于本发明的结构的孔径分布表现出单一最大值，并且在相 关的孔径分布中60%或更多的中孔落入宽度为10 nm并包括该最大 值的范围内。根据随后要描述的实施例，例如，80%或更多的细孔的 孔径落入最大值士5 nm的范围内，即，在宽度为10nm并包括最大值 的范围内。更优选地，90%或更多的细孔落入宽度为10nm的范围内。用于本发明的中孔的孔径为2 nm或更大并且50 nm或更小，更 优选为10nm或更大并且30nm或更小。耳又决于本发明的结构的应用 类型，例如，当本发明结构用于生物传感器时，孔径优选为10nm或 更大，使得诸如抗体的生物材料可以被引入到中孔中，从生物材料结 构的稳定性角度来看，优选为30nm或更小。中孔形状可以是这样，使得其孔径单一性地增加，或者从其一个 开口向另一个开口不连续地变化。中孔周期性的信息可以从X-射线衍射(XRD)测量获得。在与截面 正交的方向看到的中孔的构造不限于如图4A中所示的矩阵构型，或 者如图4B中所示的六角形对称构型，还可以是其它规则或不规则的 构型。根据本发明实施方案的结构在XRD测量中在角区域有至少一 个衍射峰，相当于lnm或更大的结构周期性；这意味着中孔是规则排 列的。中孔之间的相互间距是1 nm-4 nm的量级。更优选多个相邻的 中孔具有相同的延伸方向；然而，这些中孔的方向可以在沿中孔方向 的某处分枝为多个方向。中孔的长度优选为50 nm或更大并且500 nm或更小。从利用中 孔作为生物传感器等的反应区域的角度来看，中孔长度更优选为50 nm或更大并且300 nm或更小。中孔l3沿着骨架12的纵向15均匀排列，如图IB中所示。中孔 13优选尽可能垂直于骨架12的纵向15进行排列。在可用电子显微镜 观测的面积上，例如500 nm x 500 nm的面积上，优选90%或更多的中孔沿着该垂直的方向排列。 (组成材料)作为组成骨架12的材料，即，中孔的孔壁，氧化物例如硅氧化 物、钛氧化物或锡氧化物是优选的。这样的材料可以是由诸如硅石的 无机材料和诸如苯或乙蹄的有机材料组成的混合材料。由硅烷偶联剂等制成的涂层可以形成于中孔的孔内壁上，或者 酶、抗体、DNA等可以被引入到其中要被支撑的中孔中。例如，孑L 表面(孔内壁)可以用硅烷偶联剂或者用含有能形成氧化物的金属的 金属盐的水溶液进行改性。(制造结构的方法)根据本发明一个实施方案，为了制造具有中孔的结构，在水解催 化剂存在下，将含有用于形成该结构的骨架的材料、表面活性剂和取 向控制剂的反应溶液加热到120°C，使得在水热合成条件下形成含有 表面活性剂的结构，然后将表面活性剂从所述结构中除去。以下将具 体说明。首先，向所制备的反应溶液中加入水解催化剂，在大致室温下搅 拌，然后，在几小时到几天的时间内，使原料进行缩聚反应。然后，收集溶液中所制得的沉淀物，洗涤，然后干燥。然后，将 表面活性剂从所述沉淀物中除去。以此方式获得具有中孔的结构，所 述中孔沿着与骨架的纵向相交的方向贯穿骨架。为骨架原料的材料包括卣素化合物、硫族化合物或金属醇盐。当 中孔的孔壁用硅氧化物形成时，优选使用是作为金属醇盐的四乙氧基 硅烷和四曱氧基硅烷。作为表面活性剂，优选使用非离子表面活性剂，例如含有聚环氧 乙烷作为亲水基团的嵌段共聚物。
取向控制剂可以是能调节表面活性剂的方向以使其与树枝状骨架的纵向相交的有机物质；这样的有机物质的实例可以包括正癸烷 (C1()H22)。在本发明中使用的取向控制剂的详细机理处于研究中；当 表面活性剂的取向沿着与骨架的纵向相交的方向时，将产生在熵方面 稳定的状态。可以想象，通过将反应时间设置为几小时到几天，以及 将该反应时间的温度设置为120°C,硅氧化物在其形成颗粒之前进行 叠层，或者经历反应的硅氧化物颗粒相互键合，从而形成树枝状生长。 12(TC的温度是用于加热所述溶液的炉的环境大气温度；该溶液被置 于压力容器中，并且该溶液的温度基本与环境大气温度相同。由此获得的树枝状结构可以用离心分离机进行收集，因为其在溶 液中沉淀。所收集的沉淀通过空气干燥等进行干燥。多孔材料可以通过从所收集的沉淀中除去形成胶束的表面活性方法是能够除去表面活性剂而不破坏细孔结构的方法即可。这样的方使用超临界态流体从孔中挤压出表面活性剂的方法，以及通过使用臭 氧氧化以除去表面活性剂的方法。更优选通过在含氧气氛中煅烧该结 构而除去表面活性剂的方法；在该方法中，该结构在空气中在550°C煅烧温度和时间则根据用于形成细孔壁或骨架的材料以及所用表面 活性剂而适当地进行选择。通过向基于上述方法获得的结构额外应用以下步骤，可以生产生 物材料载体。具体而言，所述步骤是指其中具有中孔的结构被浸泡于含有生物 材料的溶液中、并且该生物材料通过搅拌被吸附于多孔材料的孔中的 方法。为了便于将所述生物材料引入到中孔中，官能团(例如氨基或 羧基)可以引入到中孔的细孔表面(孔壁表面)上；通过这种方式， 生物材料易于被引入到中孔中，确信因为位于孔壁表面的官能团和生 物材料发生电相互作用。
例如，存在其中细孔表面用硅烷偶联剂进行改性的方法，和其中 细孔表面用含有能形成氧化物的金属的金属盐的水溶液进行改性的方法。所述硅烷偶联剂一般是用化学式R-Si-X3表示的化合物，并且在其分子中具有两个或多个不同的官能团。x表示能与由无机材料制成的多孔材料的表面进行反应的位点。例如，在Journal of Sol-Gel Science, 1989， 662中，描述了其中中孔材料是硅氧化物的情况；位 于细孔表面的硅烷醇基的氬原子被有机硅基团所取代，形成Si-O-Si-R 键，从而在细孔表面上形成有机物质R的层；X的实例包括氯基、烷 氧基、乙酰氧基、异丙氧基和氨基。当然，可以使用其中X是双官能 团或单官能团的硅烷偶联剂，以及其中X是三官能团的硅烷偶联剂， 只要所述硅烷偶联剂能与细孔表面进行反应形成R的层即可。R表示 有机基团，例如氨基、碳基或马来酰亚胺基。当细孔表面用含有能形成氧化物的元素的金属盐的水溶液进行 改性时，钛、铝、锆、锡等可以被用作能形成相关氧化物层的元素。 例如，通过用硝酸氧锆的水溶液处理中孔硅石，可以在表面上形成锆 氧化物层。图5A和5B是说明在中孔中支撑生物材料的结构的示意图。图5A和5B表示一种状态，其中生物材料23被要支撑的中孔的 孔壁22所环绕。数字标记12表示图1A、 1B和1C中所示的骨架。 当这样的生物材料载体用作生物传感器时，应用这样的现象，其中生 物材料23与对该生物材料23具有特异性亲和力的材料24彼此反应， 如图5B的放大图中所示。本发明人已研究适合用作酶反应和抗原-抗体反应的反应区的 结构，并已发现本发明的结构适合用作这样的反应区。用于本发明的生物材料是抗体、抗体片段、DNA、蛋白质、酶等。所述DNA片段还可以是从动物、植物和微生物中提耳又出来并剪切为 期望形状的那些片段，或者是由遗传工程制得或化学合成出来的那些。
材料24的实例可以包括抗原、抗体片段、DNA、蛋白质和酶。 例如，当生物材料23是抗体时，与所述生物材料具有特异性亲和力 的材料24是抗原。尽管没有表示出来，但优选设置一个锚定物(anchor),以将中孔 的孔壁22的内表面与生物材料23相连接。该锚定物具有抑制生物材料大的结构改变并由此稳定地维持该 生物材料的结构的作用。构成锚定物的成分优选是与组成具有中孔的 结构的材料相同的组成材料。作为用于键合所述生物材料的位点，所 述锚定物优选具有羟基、酰胺基、氨基、吡啶基、脲基、尿烷基、碳 基、酚基等。而且，所述锚定物还可以是具有官能团例如偶氮基、羟 基、马来酰亚胺基、硅烷衍生物或氨基亚烷基的化合物。每个中孔可以容纳一种或多种生物材料。因此，要求每个中孔具 有适于固定所述生物材料的尺寸。时，则所述生物材料的表面靠近中孔的孔壁，从而使得生物材料由于 中孔孔壁的范德华力而被吸附于中孔中。从而生物材料的构造进 一 步所述活性单元可以通过非共价键，例如静电结合、氢键和离子键以及 范德华力而保持在中孔中。(使用本发明结构的功能装置) 以下将描述使用本发明结构的功能装置。如上所述，在中孔中支撑生物材料的结构可以用于作为功能装置 的生物传感器中。换句话说，将详细描述根据本发明 一 个实施方案的检测样品的方法。首先，制备传感器，其中生物材料支撑于上述结构的中孔中，并 且所述传感器装备有含有样品的流体(液体或气体)。然后，含有样 品的流体在经过树枝状结构的空间和大孔时渗入中孔中，并与支撑于 中孔中的生物材料进行反应。具有树枝状骨架的结构的空间和大孔分
别具有大的对流体而言的传导性，从而使得流体均勻地到达具有树枝 状骨架的整个结构，而且，还到达与所述空间和大孔连通的中孔。当 中孔的纵向和骨架的纵向相互平行时，中孔在骨架侧壁上开口的发生 概率非常低，从而使得样品渗入到中孔中的概率变得非常低。在本发 明中，中孔的纵向和骨架的纵向互相交叉，因此，基于在该结构的大 量中孔中发生的生物材料和样品之间的反应，；险测到输出信号，从而 提高灵敏度。详细而言，样品的检测原理利用在抗原和抗体之间的抗原-抗体反应、特异性键合反应(例如在单一的DNA和另 一单一的DNA之间 的键合反应)、或者其它反应。无论如何，通过利用物理量例如电流、 电压、光通量、质量和热量的变化来检测目标材料。检测装置的实例 可以包括酶电极、过氧化氢电极、ISFET (离子敏场效应晶体管)、光 学纤维、热敏电阻、石英振荡器和表面等离振子共振器。本发明结构可以用作吸附剂或分离剂的柱，用作除生物传感器以 外的功能装置。在这种情况下，制备由本发明实施方式的上述结构制 成的大量颗粒，并且所述颗粒可以被压制，从而生产多孔材料。述变化可以作为电输出信号加以检观'J 。以下，将结合实施例详细描述本发明。实施例(实施例1 )在本实施例中，将描述其中中孔的孔壁材料是硅石的结构。 首先，2.40 g非离子表面活性剂，即，三嵌段共聚物 (EO20PO70EO20; HO(CH2CH2O)20(CH2CH(CH3)O)70(CH2CH2O)20H)溶 于76.5ml纯水中。此外，向所获得的水溶液中加入7.5ml36重量。/c 浓盐酸，并在室温下搅拌30分钟。然后，向水溶液中加入13.9 g正 癸烷，作为取向控制剂，并在室温下搅拌2小时。此外，向该混合溶液中加入0.027 gNEUF作为水解催化剂和5.10g四乙氧基硅烷(TEOS)以制备前体溶液。使该前体溶液的最终组成(摩 尔比)满足以下比例TEOS : HC1 : EO20PO70EO20 : NH4F :正癸烷= 25 :卯0.4 : 0.7 : 100。该前体溶液在40。C下搅拌20小时，然后在120。C下反应48小时。 由此获得的白色沉淀用纯水充分洗涤，并在真空下干燥。由此获得的粉末样品在550。C下在空气中煅烧，从而表面活性剂 被分解，并从细孔的内部除去，形成中空的细孔。通过红外吸收光i普 测量方法检查有机物质例如表面活性剂的除去情况。通过X射线衍射方法评价由此合成的中孔硅石粉末，结果如图6 中所示，鉴定到一个归属为晶面间距为11.7nm的六角形结构的(IOO) 面的衍射峰，以及归属为(110)、 (200)和(210)面的衍射峰。这些结果 表明，中孔硅石的细孔结构具有高规则性设置的六角形排列。在77K下进行氮吸附-解吸等温测量，结果，吸附等温线的形状 被鉴定为按照IUPAC分类的IV型。基于B.E.T.方法得到的比表面积 和细孔体积分别为700 m々g和1.88ml/g。根据吸附等温线的结果，基 于BJH方法得到细孔尺寸。因而在本实施例中合成的中孔硅石的细孔 尺寸分布表现为狭窄的分布，在14.3 nm处有一个单峰。获得的结构 的孔尺寸分布为，使得90%或更多的中孔落入包括最大值的10 nm的 范围内。接下来，用扫描电子显微镜(SEM)进行观察，发现形成具有大量 分枝的棒状结构(具有树枝状骨架的结构)，如图2A和2B中所示。在分枝的棒状结构中的空间(在骨架中的空间)中，发现形成300 到500 nm的大孔或大孔尺寸化的空间。用更高的放大倍数进行SEM观察，如图7中所示，发现直径为 14 nm的管状中孔沿着与树枝状结构的纵向交叉的方向取向。在图7 中，数字标记11表示由树枝状骨架形成的大孔的孔尺寸。如图8中 所示，在该结构的截面中形成细孔结构，其中均一的管状中孔为蜂巢 (即，六角形对称)堆积。值得注意的是，在观察过程中该中孔结构不 被电子束所破坏。
如上所述，能够合成具有孔尺寸彼此不同的两类细孔(即，在树 枝状骨架的部分之间形成的大孔和在骨架中形成的中孔)的结构(以下称为分级(hierarchical)结构，视具体情况而定)。 (实施例2)辣根过氧化物酶(以下缩写为HRP;平均直径=4.8 nm,等电点 (IEP) = 7.2), —种氧化还原酶，被固定在实施例1中制得的结构(中 孔A圭石)的中孔中。然后测量对有机溶剂的耐受性和耐热性。此外还 研究了溶液扩散性。(1) 酶在中孔中的固定通过使用5 mM磷酸盐緩沖溶液(pH = 7.4)制备5 mg/ml HRP溶 液，并将10 mg合成的中孔硅石加入到1 ml酶溶液中。所混合的溶 液在4。C和20小时条件下用振动器搅拌，从而使HRP吸附在中孔硅 石的细孑L中。反应完成后，使反应溶液在4。C下以20000 g离心分离IO分钟， 并用纯水洗涤HRP-中孔硅石沉淀物三次。对原始的酶溶液和所获得 的上清液进行紫外-可见光吸光度测量。通过利用HRP在403 nm处的 吸收最大值，由在吸附前和吸附后之间的浓度变化得到吸附到中孔硅 石上的HRP的量。固定有酶的中孔硅石在洗涤后进行真空冻干10小 时，得到粉末样品。相对于1 g中孔硅石而言，HRP的吸附量高至 252 mg/g。通过改变磷酸盐緩冲溶液的pH, HRP的吸附量发生改变。 根据这些结果，确信HRP和中孔硅石的细孔彼此静电相互作用，从 而固定HRP。通过以下事实确认HRP引入到细孔中，在HRP吸附后对中孔硅 石进行的氮吸附测量中，吸附到细孔中的氮减少。(2) 对有机溶剂的耐受性为了评价固定在中孔硅石中的HRP在有机溶剂中的酶活性，使 用1, 2-二氨基苯在甲苯中的氧化反应，其中使用叔丁基过氧化氢作 为氧化剂。通过混合8 ml 50 mM 1，2-二氨基苯的无水甲苯溶液与2 ml 1.1 M 叔丁基过氧化氪的正癸烷溶液来制备混合的溶液。向1 ml该混合溶 液中加入10 mg固定有HRP的中孔硅石，在37。C下开始反应；测量 由1，2-二氨基苯的氧化而产生的1,2-二硝基苯的470-nm吸光度，以 观察时间变化。从而HRP在作为溶剂的曱苯中的酶活性得以确定。作为对比测试，制备0.5 mg HRP本身，进行上述氧化反应，用 与上述相同的方式测量470-nm吸光度的增加。所得结果表示在图9 中。单独用HRP (游离的HRP),在甲苯中没有发生氧化反应(曲线 90),但是用固定于中孔硅石中的HRP,显示出很高的活性(曲线91 )。 这确信是因为在HRP加入甲苯中后HRP立即变性，并发现，HRP固 定在中孔硅石中获得高稳定性。(3)而于热性固定有HRP的中孔石圭石(曲线IOI)和通常的非固定的HRP (曲线 IOO)在磷酸盐緩冲溶液中在70。C下热处理0到2小时，之后测量其剩 余的酶活性；所得结果表示在图10中。通过测量苯酚的氧化分解率 来测定固定在中孔硅石中的HRP的热稳定性。为了定量测定苯酚， 使用4-氨基安替比林比色法。向lOmg通过上述HRP吸附制备的固定有HRP的中孔硅石中加 入400(il50mM乙酸钠緩冲溶液(pH二4.0),以制备溶液；由此制备的 四份相同的溶液在70。C下分别加热30、 60、 90或120分钟。对每份 溶液都进行离心分离，并用纯水洗涤该固定有HRP的硅石两次；然 后将400 ]il 50 mM Tris-HCl (羟曱基氨基曱烷盐酸盐)緩冲溶液(pH = 7,5)、 8 (il 5000 ppm的苯酚水溶液和2 jil 30%过氧化氬溶液加入该固 定有HRP的硅石中，使由此获得的反应混合物在37 °C下反应30分钟； 离心分离后，加入150[il上清液，并加入150 pl 1%六氰铁酸盐和300 pl 1% 4-氨基安替比林，两者都用1 M的甘氨酸水溶液(pH = 9.6)制备， 并搅拌该混合物；之后快速测量在约500 nm的吸光度。在70。C下热处理30分钟使未固定的HRP的酶活性降低一半，在 2小时后，只有初始酶活性的大约10%。相反，证实固定有HRP的中 孔石圭石对热具有高稳定效果；在70。C下热处理2小时后还存在卯％
或更高的酶活性。图11表示基于苯酚氧化反应的HRP的温度依赖性测量的结果。 HRP(曲线110)和固定的HRP(曲线111)分别在25。C到100。C下预先处 理了 30分钟，之后测量酶活性。通常的HRP在70。C和30分钟条件 下的剩余活性为0%,但固定在分级中孔硅石中的HPR在相同的条件 下表现出50%或更高的活性，并且即使在100。C下处理后也保持约 40%的酶活性，而没有下降到0%。(4)溶液扩散性接下来，研究在骨架邻近部分之间的大孔或大孔尺寸化的空间的 存在如何改变该吸附的材料的内扩散。具体而言，根据本发明制备分 级多孔材料，并且合成没有大孔的单分散的中孔材料，将这些材料压 制成圓片状的丸粒(pellet)，并研究这些材料每种的HRP吸附行为。煅烧粉末和没有大孔的单分散的中孔硅石(非专利文件1的颗粒)的煅 烧粉末。通过压片机将每种所称量的材料压制成直径为15 mm和厚度 为1 mm的圓片状的丸粒。通过使用5 mM磷酸盐緩冲溶液(pH = 7.4)制备5 mg/ml的HRP 溶液，并将每种丸状的中孔硅石置于5 ml的HRP溶液中。每种混合 的溶液用振动器在4。C下緩慢振动48小时，HRP因而吸附在每个中 孔石圭石中，根据HRP溶液在403 nm的吸收强度变化来测量在每种 HRP溶液中的吸附量的时间变化情况。在从吸附开始起约1小时的流 逝时间时，分级中孔硅石表现相对吸附量为80%或更多。该吸附量与 压制前煅烧粉末的吸附量大致相同。然而，既没有树枝状骨架也没有大孔的中孔材料在压制成丸粒后 吸附率明显降低。本发明人解释为，这些结果是由于以下事实造成的， 本发明的分级中孔材料即使在压制的丸粒中也保持着大孔，从而保持 着高的内扩散速率。另一方面，在没有树枝状骨架的中孔材料中，压 制使得材料本身的密度太高，结果吸附率确实降低。对比实施例1 (酶固定在中孔中)
作为对比实施例，合成SBA-15,其中与棒状颗粒的长轴方向平 行形成管状细孔，并测量HRP吸附和在有机溶剂中的稳定效果。 SBA-15的合成方法描述在Science, No. 279,第548页中。通过X射线衍射法评价所合成的SBA-15,结果鉴定到归属为晶 面间距9.8 nm的六角形结构的(100)面的衍射峰。根据氮吸附等温测 量，发现所合成的SBA-15的比表面积为800 m"g并且细孔尺寸为7.4 nm。对所合成的SBA-15进行与实施例1中相同的HRP吸附实验。发 现HRP的吸附量为25mg/g,表现出非常小的吸附量，是本发明人合 成的分级中孔硅石中吸附量的1/10或更少。根据HRP吸附后对样品 的氮吸附等温分碎斤，发现SBA-15的细孔体积从HRP吸附之前到之后 没有降低，并发现HRP几乎没有吸附在SBA-15的细孔中。接下来测量HRP在各中孔硅石中的时间依赖性的吸附量，结果 发现，在本发明具有大孔的分级中孔硅石中达到饱和吸附量的时间非 常短。对比实施例2 (对有才几溶剂的耐受性)也使用SBA-15,通过上述方法测量HRP的有机溶剂稳定性，与 本发明的分级中孔硅石比较。由于HRP被固定到SBA-15中，仅观察 到轻微的酶活性。然而，用固定到SBA-15中的HRP，在开始反应后 逐渐鉴定出反应产物，1, 2-二硝基苯。相反，在分级中孔硅石中， 从开始反应后立即鉴定出1, 2-二硝基苯的量为在SBA-15中发现的 量的IO倍或更多倍。就此而"i仑，在SBA-15中，与纟奉状颗粒的长轴方向平行地形成管 状细孔；因此管状细孔的长宽比较大，从而使得HRP或底物从外部 扩散到细孔的内部和从细孔的内部扩散到外部较差；并且表面上的细 孔开口数较少。从而使得HRP或底物的引入较慢。这些结果表明， 本发明人合成的分级中孔硅石在蛋白质或底物的内扩散方面是优异 的，并且作为生物材料等的载体是优异的，因为该分级中孔硅石具有 大孔等。 (实施例3)本实施例是这种情况，其中，用锆的氧化物改性实施例1中制得 的分级中孔硅石的表面，固定一种氧化还原酶——葡萄糖氧化酶(缩写为GOD,直径=8.0nm, IEP = 4.6),并测量对热的稳定性。向90ml纯水中加入10g硝酸氧锆二水合物，并在室温下溶解， 以制备10重量％的硝酸氧锆的水溶液。向该溶液中加入在实施例1 中合成的分级中孔硅石，并浸泡20小时。之后，通过离心分离，从 该混合物中除去上清液，用水洗涤该混合物并在室温下干燥。通过X射线衍射方法评价用锆改性的分级中孔硅石，结果发现表 现出与改性以前几乎相同的衍射图案，证明没有破坏中孔的周期性结 构。通过X射线光电子光镨法(XPS)测量硅石表面的化学键合状态， 结果鉴定出归属为Zr-0的峰，证明在硅石表面上形成了锆氧化物层。随后将GOD固定在已用锆改性的分级中孔硅石的细孔中，并基 于苯酚的氧化分解反应测量稳定效果。使用5 mM磷酸盐緩冲溶液(pH = 5.0)制备5 mg/ml的GOD溶液， 并向1 ml的该GOD溶液中加入10mg用锆改性的分级中孔硅石。所 混合的溶液在4。C和20小时条件下用振动器搅拌，以将GOD固定在 中孔珪石的细孔中。吸附后，在4。C下以20000 g对反应溶液进行离 心分离10分钟，产生固定有GOD的硅石。从GOD固定之前和之后 在上清溶液中的280-nm吸收最大值得到吸附于中孔硅石中的GOD 量。GOD的吸附量为120mg/g或更多。用氮吸附测量设备，根据细 孔中吸附量的降低来确定引入到细孔中的酶分子的存在。GOD几乎 不吸附到没有用锆改性的中孔硅石中。向各10 mg通过上述GOD吸附制备的固定有GOD的中孔硅石 和固定有GOD的SBA-15中加入400 50 mM乙酸钠緩冲溶液(pH-4.0),以制备溶液；由此制备的每种上述固定有GOD的物质的四份相 同的溶液在70。C下分别被加热30、 60、 90或120分钟。加热后，对 每份溶液都进行离心分离，并用纯水洗涤该固定有GOD的硅石两次； 然后将400 (il 50 mM Tris-HCl緩冲溶液(pH = 7.5)、 100 jil 10% (3-D-
葡萄糖的水溶液、8 ]il 5000 ppm的苯酚水溶液和100 |il 100 p/ml HRP 溶液加入该固定有GOD的硅石中，使由此获得的反应混合物在37°C 下反应30分钟；离心分离后，以与实施例2中相同的方式测量在约 500 nm的p及光度。相反，证实固定在中孔硅石中的GOD对热具有高稳定效果；在70°C 下热处理120分钟后还存在70%或更高的酶活性。通过使用没有进行热处理的固定有GOD的分级中孔硅石来测 量苯酚在37。C下分解的时间变化。向10 mg通过上述GOD吸附制备的固定有GOD的中孔石圭石中 加入400 pi 50 mM Tris-HCl緩冲溶液(pH = 7.5)和100 pi (3-D-葡萄糖 的水溶液，并且还加入8 pi 5000 ppm苯酚的水溶液和100 pi 100 }i/ml HRP溶液。使由此制备的溶液在37。C下反应预定的时间。离心分离 后，以与实施例2中相同的方式测量在约500 nm的吸光度。从由此 获得的结果，得到30分钟后对苯酚分解浓度的相对活性。对于5分 钟的反应，固定在分级中孔硅石中的GOD表现出100%的相对活性。这些结果表明，具有大孔的分级中孔硅石由于其大孔而具有高的 内扩散，同时，固定在中孔中的酶获得高的稳定效果。以与实施例1中相同的方式，通过使用丸状的分级中孔硅石和丸 状的单分散的中孔硅石(没有大孔)进行GOD吸附实验。根据上述 方法将这些丸粒分别浸泡在硝酸氧锆的水溶液中，以进行锆处理，然 后测量GOD的时间依赖性的吸附行为。以与实施例1中的相同方式， 根据本发明的丸状分级中孔硅石与压制前的粉末相比，没有表现出吸 附行为的变化。然而，GOD几乎没有吸附到没有大孔的单分散的中 孔珪石的丸粒上。这确信是因为在该丸状的单分散的中孔硅石中，其 颗粒被致密压紧，从而使内扩散减慢，导致GOD在中孔中不充分地 扩散。(实施例4)本实施例是这种情况，其中，用硅烷偶联剂改性实施例1中合成 的分级中孔硅石的表面，并且将(X-淀粉酶通过共价键固定在硅石表面 上。向50 ml 10% (v/v) 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的曱苯溶液中加入 l.Og在实施例1中合成的分级中孔硅石，由此获得的溶液在氮气氛中 在12(TC下搅拌48小时。反应后，过滤出沉淀物，用曱苯、曱醇和二 氯甲烷洗涤，并在室温下干燥。接下来，将1.0 g这样干燥的样品溶于25 ml 2.5%使用磷酸盐緩 冲溶液(pH:6.6)制备的戊二醛溶液中，并在室温下搅拌1小时。所获 得的沉淀用纯水洗涤四次或更多次，之后在室温下千燥。通过X射线衍射方法评价用戊二醛改性的分级中孔硅石，结果发 现表现出与修饰以前几乎相同的衍射图案，证明没有破坏中孔结构。 通过FT-IR鉴定引入硅石表面上的官能团，结果鉴定出归属为 R-CH=N、 CK)和-CHO的峰，证明Si(CH2)3N=CH(CH2)3CHO共价键 合到硅石表面上。随后，将a-淀粉酶固定在已经被改性的分级中孔硅石的细孔中， 基于淀粉到麦芽糖的水解反应来测定稳定效果。通过使用50 mM磷酸盐緩冲溶液(pH = 6.0)来制备1 mg/ml的a-淀粉酶溶液，并在1 ml该溶液中加入0.2 g根据上述方法合成并改性 的分级中孔^5圭石，以与实施例1中相同的方式压制成丸粒。所混合的 溶液在4。C和20小时条件下用振动器进行浸泡，以将a-淀粉酶吸附 在中孔石圭石的细孔中。反应完成后，过滤出丸粒，并用纯水洗涤三次。 对原始的酶溶液和上清液进行紫外-可见光吸光度测量。通过使用a-淀粉酶的280 nm吸收最大值，根据从吸附之前到之后的浓度改变， 得到吸附到中孔硅石中的量。所吸附的a-淀粉酶的量高至140mg/g。 在相同条件下a-淀粉酶吸附到没有进行表面改性的粉末状分级中孔附行为。因而确信认为，由于归因于大孔的高的内扩散，a-淀粉酶通 过改性硅石表面的-CHO和a-淀粉酶的-NH2之间的键合而被固定在硅 石表面上。
随后，固定有淀粉酶的丸状中孔硅石和非固定的淀粉酶在25。C到7 0 °C下在乙酸钠緩沖溶液中进行热处理，然后进行酶活性测定。向10 mg上述固定有淀粉酶的中孔硅石中加入400 pi 50 mM乙酸 钠緩冲溶液(pH = 5.0)，以制备溶液；由此制得的溶液在25。C到70°C 下分别热处理30分钟。加热后，对各溶液进行离心分离，并用纯水 洗涤固定有淀粉酶的硅石两次。使用相同的50 mM乙酸钠緩冲溶液， 制备0.125%可溶性淀粉溶液，并将300 pl淀粉溶液加入洗涤后的固 定有淀4分酶的硅石中，并使该混合物在40。C下反应15分钟。反应结 束后，通过离心分离获得上清液，将1 ml 0.5 N乙酸和3 ml碘-钾溶 液(0.015%碘-0.15%碘化钾溶液)力。入该上清液中，并充分搅拌该上清 液，然后测量700-nm吸光度最大值。通常的a-淀粉酶在6(TC和30 分钟的条件下表现出20%的相对活性，但固定在分级中孔硅石中的a-淀粉酶在相同的条件下表现出90%或更大的相对活性，从而证实稳定 效果。(实施例5)本实施例是这样的情况，其中，单链DNA ^皮引入在实施例1中 制得的分级中孔硅石的中孔表面上。本实施例是利用杂交反应光学探 测单链DNA之间的特异性反应的生物传感元件的实例，图12是说明 生物传感元件的构造的实例的示意图。杂交是指形成核酸杂合体或核酸分子杂交，是用于研究核酸的一 级结构同源性，即碱基序列同源性的方法，或者检测具有同源碱基序 列的核酸的方法。杂交利用以下特性，两个单链的核酸在互补的碱基 对(A-T, G-C)之间相互形成氢键，从而形成双螺旋的双链核酸。在实施例1中合成的分级中孔硅石和在对比实施例1中4吏用的 SBA-15在3-氨基丙基三乙氧基石圭烷在95%乙醇水溶液的10%溶液中 浸泡l小时，然后用离心分离器除去未反应的溶液。用乙醇洗涤后， 在氮气氛中在120。C下进行反应1小时，从而将氨基引入到中孔硅石 的孔表面上。此外，将已引入氨基的分级中孔硅石浸泡在1 mMGMBS的二甲
亚砜溶液中达2小时，然后用二甲亚砜洗涤，从而将马来酰亚胺基团引入到中孔硅石的孔表面上。这些官能团的引入通过FT-IR进行鉴定。其中引入了硫醇基团的DNA探针通过使用DNA自动合成仪来合 成，然后通过高效液相色"i普法来纯化该DNA探针。DNA探针HS-(CH2)6-0-P02-0-5'-SEQ ID NO : 1國3'然后，将10 (il 2 pM所合成和纯化的DNA纟罙针的溶液、40 pi HEPES緩冲溶液(N-2-羟基乙基哌。秦-N'-2-乙烷磺酸；10 mM，pH = 6.5) 和50 pl添加剂(乙二醇)混合在一起，以制备反应溶液。向该混合的溶 液中加入已引入马来酰亚胺基团的分级中孔硅石，由此获得的混合物 在室温下静置2小时，单链DNA因而固定到中孔硅石的表面上。将固定有DNA探针的中孔硅石装入图12所示的芯片基板上的槽 中，其它通道如图12所示进行布置，从而制成生物传感元件。在该 图中，数字标记101表示基板，102表示根据本实施例制备的固定有 DNA探针的分级中孔硅石。数字标记103和104分别表示溶液引入 管，105表示已经引入的溶液的溶液排^:管。通过使用自动DNA合成仪合成具有与该DNA探针互补的碱基序 列的DNA目标，并且其5'末端用得克萨斯红进行荧光标记。然后将 80 pl 0.1 |LiM DNA目标的溶液、17 ^ 20 x SSC (0.3 M柠檬酸钠，3.0 M 氯化钠)和3 pl 10%十二烷基硫酸钠的水溶液混合在一起。通过混合而 制得的该杂交溶液沿箭头123所示的方向通过图12所示的溶液引入 管103引入。在稳定状态停留预定的时间后，该溶液沿箭头125所示 的方向从溶液排放管105排放出去。在杂交反应进行预定的时间后，将一百倍稀释的20 x SSC溶液 作为洗涤溶液从洗涤溶液引入管104沿箭头124所示的方向注入，并 进行洗潦。然后，通过使用用于微阵列的扫描器，测量固定有DNA 探针的部分的荧光强度(杂交信号)和其中没有固定DNA探针的样品 的荧光强度(背景信号)。固定有DNA探针的SBA-15的杂交信号小，不能获得高的荧光 强度比(杂交信号/背景信号)；测量由于杂交反应引起的荧光强度随时22 间的变化情况，还发现达到饱和强度的时间较长。相反，固定有DNA探针的分级中孔硅石在非常短的时间内完成杂交反应，并获得优异的荧光强度比。这些结果确信地作如下理解DNA探针在分级中孔硅 石的中孔中的高吸附量增加了荧光信号，由于大孔引起的优异的内扩 散导致杂交反应在短时间内完成。在本实施例中，由上述结果证明，通过使用其中已固定有上述生 物材料的分级中孔石圭石，可以制成能够在短时间内完成高灵敏:探测的 生物传感元件。(实施例6)在本实施例中，在实施例1中合成的分级中孑L硅石的细孔中固定 小鼠单克隆抗体(抗原是人血清白蛋白)，通过利用抗原和抗体之间的 特异性结合反应，对目标材料进行检测和测定。分别向10mg在实施例1中合成的分级中孔-圭石和10mg在对比 实施例1中使用的SBA-15中加入10 ml 1 mg/ml用纯水制得的小鼠 Fab型单克隆抗体的水溶液。由此制得的溶液分別在4。C下搅拌6小 时，从而将抗体固定在中孔珪石的中孔中，然后用纯水洗涤三次。向 该固定有抗体的中孔硅石中加入辣根过氧化物酶标记的人血清白蛋 白(縮写为HRP-HSA)溶液的溶液，并使该混合物在室温下反应预定的 时间(l到4小时)。为了除去非特异性吸附的HRP-HSA,用纯水洗涤 固定有抗原-抗体的中孔硅石几次，然后真空冻千，使千燥的样品在 37。C下"f争置任选的一l殳时间。然后向该样品中加入400 pl 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5)、 8 (il 5000 ppm苯酚的水溶液和2 pl 30%过氧化氢 溶液，并使该混合物在37。C下反应30分钟。在离心分离后，以与实 施例2中相同的方式测量在约500 nm的吸光度，乂人而测定用特异性 键合到固定的抗体上的HSA标记的HRP的酶活性。另外，以与上述相同的方式，将不是HRP-HSA抗体的非特异性小鼠免疫球蛋白抗体(小鼠Ig)固定到分级中孔硅石上。然后，按照上 述过程，测量其中使用与HSA特异性键合的抗体的情形和其中使用 非特异性抗体的情形之间的吸光度差异。结果发现，非特异性小鼠Ig
的HRP活性明显小于根据本实施例的固定有小鼠Fab型单克隆抗体的中孔石圭石。由这些结果证明，抗体被固定在中孔珪石中，并且即橫_ 在抗体固定在中孔珪石后，在细孔中仍发生抗原-抗体反应。向上述固定有抗体的中孔珪石中加入HRP-HSA溶液，并使该混 合物在室温下反应预定的时间(l到4小时)，乂人而测定抗原-抗体反应 的时间变化情况。结果，如实施例2、 3和4中所证明的那样，只有 在使用分级中孔硅石的情况下才鉴定出高的抗原-抗体反应速率。这 确信是因为，外在的环境作用使没有固定在细孔中的HRP-HSA(例 如通过非特异性吸附而吸附到细孔外面的HRP-HSA)变性，因而 HRP-HSA没有一皮稳定化。以上获得的固定有抗体的中孔硅石和非固定的小鼠单克隆抗体 粉末分别以干燥状态在37。C下存放3周，并分别检测由于抗原-抗体 反应引起的HRP活性随时间的变化情况以上硅石和粉末以千燥状 态在37。C下开始存放之前之际各自的结合活性被定义为100。非固定 的小鼠单克隆抗体的相对活性在一周后成为零，即完全失活。另一方 面，固定在分级中孔硅石中的小鼠单克隆抗体的抗原-抗体反应即使 在三周后也表现出90%或更高的相对活性。(实施例7)本实施例是这样的情况，其中，在电极上合成与实施例1中所合 成的相同的分级中孔硅石，进一 步将葡萄糖氧化酶(GOD)和介质固定 在中孔中，并测定葡萄糖浓度。使用碳电极和铂电极作为电极。在76.5 ml纯水中溶解2.40 g三嵌段共聚物(￡020卩07(^020; HO(CH2CH20)2o(CH2CH(CH3)0)7o(CH2CH20)2oH)。进而，向所获得的 水溶液中加入7.5 ml 36重量％的浓盐酸，并在室温下搅拌30分钟。 然后，向水溶液中加入13.9g正癸烷，并在室温下搅拌2小时。进而， 向该混合溶液中加入0.027 g NH4F作为水解催化剂和5.10 g四乙氧基 硅烷(TEOS)以制备前体溶液。使该前体溶液的最终组成(摩尔比)满足 以下比例TEOS : HC1 : EO20PO70EO20 : NH4F :正癸烷=25 : 90 : 0.4 : 0.7 : 100。
该前体溶液在40。C下搅拌20小时，然后在120。C下反应48小时。 由此获得的白色沉淀用纯水充分洗涤。向该白色沉淀中适当加入乙 醇，并在3000 rpm到6000 rpm下进行离心分离，以产生糊状分级中 孔硅石。将所获得的样品涂敷到碳电极上，在室温下干燥，在空气中 在500。C下煅烧以分解并从细孔内部除去表面活性剂，从而在碳电极 上合成分级中孔硅石。以与实施例1中相同的方式，通过X射线书f射方法评价从电极上 取样的中孔硅石粉末，结果鉴定出归属为六角形结构的(100)面的衍射 峰，以及归属为(IIO)、 (200)和(210)面的衍射峰。通过使用5 mM乙酸钠緩冲溶液(pH = 7.4)制备5 mg/ml GOD溶 液，并将合成的中孔硅石碳电极浸泡在10ml该酶溶液中。该溶液在 4。C和20小时条件下用振动器緩慢搅拌，从而使GOD吸附在电极上 中孔硅石的细孔中。用纯水洗涤电极上的GOD-中孔硅石三次，产生 固定有GOD的电极。从GOD固定之前和之后上清液的280 nm吸收 最大值，通过减去仅吸附到作为背景的碳电极上的量，得到吸附到中 孔珪石上的GOD的量。GOD的吸附量为230 mg/g或更多。在干燥 该样品后，为了将介质支撑在中孔中，使该样品在稳定状态下在室温 下在100 ml 100 mM用50 ml MOPS緩冲溶液制备的铁氰酸钾溶液中 停留12小时。浸泡后，进行离心分离并用纯水洗涤，在室温下干燥， 得到用于检测葡萄糖的GOD电极。通过利用图13所示的反应机理，测定葡萄糖的浓度。利用该机 理，可以测定血液等中的血糖水平。具体而言，当血液中的葡萄糖到 达传感器时，葡萄糖和GOD相互反应，并且在反应时间内，葡萄糖 释放电子，转变成葡糖酸。从葡萄糖释放的电子被氰化铁离子 ([Fe(III)(CN)6]3-)所捕获。捕获电子的氰化铁离子([Fe(III)(CN)6]3—)转变 成氰化亚铁离子([Fe(II)(CN)6广)。工作电极131检测该反应发生与否。 事先将电压施加到该工作电极上，对电极132不接受氰化亚铁离子 ([Fe(IIXCN)6f)的电子，但氬离子(H+)接受对电极上的电子，与氧(02) 配合产生水(H20)。通过测量此时的电流值，得到葡萄糖的量，并可 以确定血4I水平。如下测定葡萄糖浓度。在如图14所示的恒温电池中放有50 mM MOPS緩沖溶液，并保持在预定温度。所合成的固定有GOD的碳电 极用作工作电极131,具有固定有酶的颗粒130,铂电极用作对电极 132。将预定的电压施加到碳电极上，在电流变得稳定后，加入含有 葡萄糖的样品，测量电流值的增加，获得高电流。额外地，使用标准 葡萄糖溶液样品来测量电流值，结果发现电流值随着葡萄糖浓度增加 而线性增加。因此可以得到能够测定葡萄糖浓度并测定血糖水平的生 物传感器。(实施例8)本实施例是这样的情况，其中，在电极上合成与实施例1中所合 成的相同的分级中孔硅石，进一步在其中固定葡萄糖氧化酶(GOD)和 介质，并测定葡萄糖浓度。分级中孔硅石与上述工作实施例中的相同。用二茂《失羧酸作为介 质。二茂铁羧酸以共价键固定到中孔的表面，从而将GOD支撑到中 孔上。二茂铁羧酸的固定包括以下步骤。将涂敷有中孔硅石的电极(其 中已经通过煅烧形成中孔)用硅烷偶联剂进行硅烷化(sililated)。在 Teflon (商品名)容器中制备20 mM (3-碘丙基)三甲氧基硅烷(IPTMS) 的二氯曱烷溶液。将电极浸入该溶液中，然后在氮气氛下在室温下搅 拌4小时。用二氯曱烷和乙醇洗涤所得到的电极，并在80。C下干燥。然后将这样碘-丙基石圭烷化的电极浸入0.13 mM二茂铁羧酸水溶 液和0.17 mM N， N'-二环己基碳二亚胺水溶液的混合溶液中，并在 Ar气氛下缓慢搅拌，从而将二茂铁羧酸固定到硅石表面上。通过FT-IR 分别确认IPTMS向硅石表面上的引入和二茂铁羧酸通过酯键的固定。 通过这些步骤，完成了通过共价键将二茂铁羧酸固定到硅石表面上。将pH 7.4的PBS放入恒温电池中。将以上制备的固定有GOD的 碳电极浸入其中，然后用氮鼓泡搅拌5分钟，其中使用Ag-AgCl电极 作为参比电极并且使用铂线作为对电极。在电极上扫过100 mV到600 mV的电压。氧化电流变得稳定，然后减低电压，从而获得CV曲线。 扫描速率设定为1 mV/s。每次提高葡萄糖的浓度，都测量电流，从而 确定饱和电流值。所得的氧化-还原电势的峰值为220 mV。从而确认， 使用二茂铁羧酸的介质可以用于生物传感器中。同时，在允许二茂铁 羧酸漂浮的状态下的氧化-还原电势大于220 mV。当血液中的物质被电极氧化/还原时，对于抗坏血酸而言，氧化-还原电势例如为500-600 mV;对于血红蛋白而言，为300-400 mV。 因此，为了正确测量电流的峰值，使用不与这些氧化-还原电势峰重 叠、而是在较低电势下有峰的介质是重要的。也就是说，利用共价键将介质固定在中孔上好于使其漂浮，因为 所述峰会移向较低电势。该移动的原因似乎是，所述介质在负电场支 配下的中孔硅石中易于氧化，并且介质固定在表面上导致电子跳跃， 这可以有效地使电子转移到电极上。该原因也适于其它酶。如上所述，根据本发明，可以获得一种具有中孔的新结构。另外， 本发明的中孔材料在内扩散方面是优异的，可以应用于固定生物材料 的试剂，用于增加柱材料的精度，等等。本发明的具有中孔的结构例 如可以应用于生物传感器等。序列表自由文本 <210> 1<223〉 探针的碱基序列部分本申请要求2005年6月7日提交的日本专利申请号2005-166754 的优先权，通过引用将其内容并入本文。
权利要求
1.一种具有多个中孔的结构，包括树枝状骨架，其具有在与骨架的纵向相交的方向上贯穿骨架的中孔。
2. 根据权利要求l的结构，其中所述中孔与骨架的纵向垂直。
3. 根据权利要求1的结构，其中，所述树枝状骨架通过骨架的 分^^支部分相互连接形成大孔，或者在彼此相邻的骨架之间形成大孔尺寸化的空间。
4，根据权利要求l的结构，其中，所述中孔为六角形对称排列。
5. 根据权利要求1的结构，其中，所述中孔的孔径分布为，其 中80%或更多的中孔落入宽度为lOmn并包括最大值的范围内。
6. 根据权利要求l的结构，其中，生物材料被支撑在中孔中。
7. —种由多个颗粒形成的多孔材料，包含由根据权利要求1的 结构组成的颗粒。
8. —种用于检测样品的传感器，该传感器由根据权利要求7的 多孔材料和电极组成，并且基于样品和支撑在中孔中的生物材料之间 的反应来检测电输出信号。
9. 一种检测样品的方法，包括以下步骤制备传感器，其中生物材料被支撑在根据权利要求1的结构的中 孔中；将含有样品的流体加到该传感器上；和基于生物材料和样品之间的反应来检测输出信号。
10. —种酶电极，含有支撑酶的多孔材料和用于将从该酶转移来 的电子转移到该电极上的电子转移物质，其中，所述电子转移物质被固定在所述多孔材料上。
全文摘要
本发明提供一种具有中孔的新结构。本发明提供的结构具有多个中孔，其中，所述结构具有树枝状骨架和在与骨架的纵向相交的方向上贯穿骨架的中孔。本发明还提供多孔材料、传感器以及利用该新结构检测样品的方法。
文档编号C01B33/193GK101166693SQ20068001393
公开日2008年4月23日 申请日期2006年6月1日 优先权日2005年6月7日
发明者村田雄辅 申请人:佳能株式会社