用于施肥的硝化微生物的制作方法

本发明涉及农业领域，或者特别涉及用于给土壤或用于植物和作物生长的其它基质施肥的组合物。更具体地说，本发明涉及可用于此目的的硝化微生物聚生体。

背景

所有生物体，特别是植物的生长取决于矿物质营养物质的可利用性，没有一种比氮更重要，因为需要大量的氮作为蛋白质、核酸和其他细胞成分(包括酶)的重要组分。氮是叶绿素的重要组成部分，但是它对糖的生长和利用的影响比通过减少叶绿素而对光合作用产生的影响更多。地球大气中有充足的氮供应，其中近79％为氮气。然而，由于其分子几乎是惰性的，N₂无法被大多数生物体利用。为了使氮用于生长，其必须以铵(NH₄)或硝酸根(NO₃)离子的形式“固定”(组合)。岩石的风化释放这些离子的速度非常慢，以至于其对固定氮的可利用性的作用可以忽略不计。因此，在有合适的气候和水资源来维持生命的所有环境中，氮往往是生长和生物量生产的限制因素。由于这个原因，氮通常以肥料的形式供给植物。

氮主要通过根部进入植物。微生物在氮的可利用性的几乎所有方面都具有核心作用，因此其在地球上的生命支持方面具有核心作用。

土壤氮以三种一般形式存在：有机氮化合物，铵(NH₄⁺)离子和硝酸根(NO₃^-)离子。土壤中大部分氮(97-98％)与有机物质结合在一起，不能被植物利用。只有2-3％处于无机形式的硝酸根(NO₃^–)和铵(NH₄⁺)形式，可用于植物。有机物质(在适当的水分、温度和氧气含量下)不断被微生物分解，并作为无机氮释放到土壤中。这个过程被称为矿化。当微生物以无机氮为食时，也会出现相反的过程。这个过程被称为固化(immobilization)。

在矿化过程中，大部分有机物质首先转化为铵(NH₄⁺)。通过硝化微生物将铵(NH₄⁺)转化为硝酸盐(NO₃^–)的过程称为硝化(nitrification)。这个过程非常重要，因为硝酸盐很容易被作物和微生物利用。硝酸盐在土壤中流动性非常高。

氮在土壤中以几种方式流失：植物吸收、微生物、与排水一起排出的硝酸盐、以及通过反硝化损失的硝酸盐。在温暖的时候，反硝化发生在淹水或饱和的土壤中。在贫氧状态下，微生物从硝酸盐(NO₃^–)中获取氧。然后氮以气体的形式逃逸到空气中。反硝化常见于植物呈黄色和矮化的玉米地的湿地中。

施加的氮(例如通过肥料)也可能以几种方式流失：施加到表面的尿素迅速转化成NH₃，并且当存在足够的湿度、温度和脲酶时，以氨气形式逸出到空气中。为了避免上述流失，需立即加入尿素。脲酶抑制剂也可以用来减少流失。

大多数植物以硝酸盐(NO₃^–)形式吸收其大部分氮，并且以较小程度吸收铵(NH₄⁺)形式。一些作物，如大米，利用铵作为氮的主要来源。当植物吸收了铵态氮和硝态氮的组合时，植物生长似乎有所改善。

大多数肥料包含大量的氮。在大多数情况下，这种氮无论是作为一种单独的化合物给予，还是与其他常量营养物如磷和钾关联给予，都以氨的形式或以尿素(CO(NH₂)₂)的形式递送。然而，对于使用这些人造的“化学”或“矿物”肥料，尤其对于从自然界(有机肥料，例如堆肥，粪肥或绿色废物)衍生的有机生长剂市场肥料组合物而言，出现生长抗性。

当作物的氮供应完全来自土壤有机质、覆盖作物、粪肥和堆肥等来源时，彻底了解矿化对于避免可用氮的缺乏或过剩是至关重要的。一年中的矿化并不一致，而作物的氮的需求量应与从矿化释放的营养物相匹配。矿化率取决于环境因素(如温度和土壤湿度)，有机物质的性质(如碳氮比，木质素含量)和这些物质的位置。

若无法使氮矿化与作物吸收同步可导致植物营养缺乏、超出生长季节的过量的土壤氮以及过量的NO₃^–浸出的可能性。有机含氮肥料的例子是堆肥、粪肥和覆盖作物。

堆肥：堆肥：一般来说，堆肥含有较低浓度的氮和磷。它们通常缓慢地分解并且在数月或数年内作为氮的缓释源，因为在堆肥过程中可快速分解的化合物先前已被降解。堆肥可以由农场物料制成，但也可以从市政和商业来源广泛获得。这些堆肥品质不同，往往直接营养价值低，但提供稳定有机物质的有价值来源。商业堆肥的粪肥可以从各种主要有机物质中广泛获得。

粪肥(manure)：由于特定的动物饲养和粪肥管理措施，新鲜粪肥的化学、物理和生物特性差别非常大。粪肥氮以有机和无机的形式存在。由于氨(NH₃)易挥发流失，氮肥在新鲜粪肥中不稳定。在某些情况下，在土壤表面施用新鲜的粪肥或浆料可能导致挥发损失高达总氮的50％。在一些粪肥中，湿有机物和NO₃^-的组合还可促进显著的反硝化损失。粪肥中的有机含氮化合物在被土壤微生物矿化后变得可通过植物吸收而可用，而无机氮部分立即可用。在生长季节确定粪肥和堆肥的正确施用比例以提供适量的大量营养物可能是困难的。可被利用的氮量总是小于粪肥中的总氮量，因为一些流失是随撒播经挥发发生，并且在施用后的生长季节期间只有一部分有机氮可用于植物。剩下的有机氮将在之后数年慢慢矿化。当以满足作物对氮的要求的比例施用粪肥和堆肥时，磷和钾的添加量一般都超过了植物的需求。随着时间的推移，磷浓度可能增加到可能造成环境风险的浓度，因为来自富含磷的土地的径流可刺激地表层水中不需要的生物的生长。过量的土壤钾会导致营养失衡，尤其是牧草。为了避免这些问题，必须监测用以提供主要氮源的富含磷和钾的粪肥的长期使用。粪肥和堆肥难以统一应用于该领域，这是由于其大体积性质和固有的变化性所致。

未处理粪肥的施用可能会引起与食品安全有关的问题，如潜在的病原体，激素和药物。一些有机用途限制了未处理粪肥的使用。

覆盖作物：在经济作物间隔期或在果园和葡萄园之间的行间空地中种植各种各样的植物物种(最常见的是草和豆类)。它们可以帮助减少土壤侵蚀，减少土壤NO₃^-浸出，并在分解后为后续作物贡献有机物质和营养物。豆科覆盖作物还将通过生物固氮提供额外的氮。覆盖作物中所含氮的量取决于植物种类，生长阶段，土壤因子和根瘤菌关联的有效性。豆类覆盖作物的生物量通常约为每公顷(ha)约50至约200kg氮。

在氮变得植物可用之前，覆盖作物需要矿化。氮矿化速率取决于多种因素，包括作物的组成(如碳氮比和木质素含量)和环境(如土壤温度和湿度)。与其他有机氮源一样，将覆盖作物中的氮矿化与经济作物的营养需求相匹配可能是一个挑战。有时需要在覆盖作物之后向作物添加补充氮以防止暂时的氮缺乏。

植物通常优选氨和硝酸盐的混合物作为氮源，主要有两个原因。当产生氨时，根区的pH会增加，这对植物的生长是非常有害的，而通过在根区的硝化作用，pH将保持在约pH6.4的最佳微酸性条件下，这对于吸收矿物质是最佳的。除此之外，健康的植物生长需要大量的阳离子，如钙，镁，钾，硼，镁，锌和铁。当负电荷的硝酸盐分子被用作氮源而不是带正电荷的分子时，这些矿物质的摄取更容易，以保持植物中的适当的电荷平衡(Mulder,E.G.,1956,Mededelingen Directeur van de Tuinbouw 19(8/9):673-690)。由于上述原因，种植者不能也不想使用硝酸铵或硝酸钙/硝酸钾等化学肥料，如果有机种植者想要生产通常表示为有机物的食物，则需要生物硝化作用。尽管硝化活性存在于健康的土壤中，但由于各种原因，例如暴雨，高温，霜冻等恶劣天气条件，以及由于使用农药、除草剂和杀真菌剂，由于大雨、土壤压实、土壤排水性能差等造成的厌氧条件，所述活性可能会损失。

目前，施肥在氮可利用性方面仍有待改进，特别是在有机农业领域。

技术实现要素：

发明人通过使用一种富集并包含硝化微生物聚生体的微生物制剂获得了出乎意料的改进结果，所述微生物聚生体包含至少两个不同的种的铵氧化微生物，所述铵氧化微生物选自亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)的细菌，所述亚硝化单胞菌科包括亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)和亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)，和/或选自奇古菌门(Thaumarchaeota)的古细菌，和至少两个不同的种的亚硝酸盐氧化细菌，所述亚硝酸盐氧化细菌选自硝化菌属(Nitrobacter)和硝化螺旋菌属(Nitrospira)。

在优选实施方式中，所述亚硝化单胞菌属、亚硝化螺旋菌属和亚硝化弧菌属的细菌的量为微生物总数的至少0.1％，优选至少0.5％，更优选至少1％，更优选至少8％，更优选至少17％，更优选至少31％，更优选至少36％。在优选实施方式中，所述硝化菌属和硝化螺旋菌属的细菌的量为微生物总数的至少0.1％，优选至少0.4％，更优选至少3％，更优选至少11％，更优选至少16％，更优选至少28％，更优选至少36％。进一步优选的微生物制剂，其中铵氧化古细菌的总数为微生物总数的至少0.05％，优选至少0.5％，更优选至少5.8％，更优选至少6.2％，更优选至少7.5％，更优选至少8.5％。还优选这样的组合物，其中微生物的数量是至少10⁵个微生物/ml，优选至少10⁶个微生物/ml，更优选至少10⁷个微生物/ml，更优选至少10⁸个微生物/ml，更优选至少10⁹个微生物/ml，更优选至少10¹⁰个微生物/ml，更多优选至少10¹¹个微生物/ml。

在另一优选实施方式中，来自亚硝化单胞菌属、亚硝化螺旋菌属和亚硝化弧菌属的细菌包括下述的两种或更多种：亚硝化单胞菌(Nitrosomonas nitrosa)、普通亚硝化单胞菌(Nitrosomonas communis)，欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)，富氮亚硝化单胞菌(Nitrosomonas eutropha)，尿素亚硝化单胞菌(Nitrosomonas ureae)，寡养亚硝化单胞菌(Nitrosomonas oligotropha)，普通亚硝化单胞菌(Nitrosomonas communis)，寻常亚硝化单胞菌(Nitrosomonas vulgaris)、多型亚硝化螺旋菌(Nitrosospira multiformis)和小亚硝化弧菌(Nitrosovibrio tenuis)以及未分类的亚硝化弧菌种(Nitrosovibrio sp.)，而来自硝化菌属和硝化螺旋菌属的细菌包括下述的两种或更多种：海洋硝化螺旋菌(Nitrospira marina)、罕见脱落硝化螺旋菌(Candidatus Nitrospira defluvii)、莫斯科硝化螺旋菌(Nitrospira moscoviensis)、威氏硝化菌(Nitrobacter winogradskyi)、寻常硝化菌(Nitrobacter vulgaris)、奥卡硝化菌(Nitrobacter alkalicus)和汉氏硝化菌(Nitrobacter hamburgensis)以及未分类的硝化菌种(Nitrobacter sp.)。来自奇古菌门(还称为中温泉古菌(Mesophilic Crenarchaeota))的古细菌包括罕见亚硝化杆菌属(Candidatus Nitrosotalea)、亚硝化球菌属(Nitrososphaera)或亚硝化侏儒菌属(Nitrosopumilus)，例如危险罕见亚硝化杆菌(Candidatus Nitrosotalea devanaterra)、海洋亚硝化侏儒菌(Nitrosopumilus maritimus)、维也纳亚硝化球菌(Nitrososphaera viennensis)和加尔加罕见亚硝化球菌(Candidatus Nitrososphaera gargensis)。本发明还包括如前所述的微生物制剂，其能通过发酵方法获得，所述方法包括以下步骤：

a.在水中充气一定量的堆肥；

b.从所述充气的堆肥污泥中提取微生物样品；

c.在充气条件下培养所述微生物数天，并在10～35℃、优选20～30℃加入铵化合物；

d.开始新培养，使用从步骤c)获得的培养物的接种物，并且充气速度保持溶解氧浓度在适当的水平，在10～35℃、优选15～30℃、更优选20～30℃的温度下；

e.在发酵过程中需要时添加营养物和微量元素；

f.在足以达到每毫升>10⁵个硝化微生物的浓度的时间后收获；和任选地

g.通过收获和用水稀释，以<500ppm的降低的氨水平继续加入氨，以将培养物中的硝酸盐和亚硝酸盐浓度保持在低水平，而不抑制氨转化为亚硝酸盐和亚硝酸盐转化为硝酸盐；

在另一优选实施方式中，所述制剂作为液体，冷却液体、冻干粉末、喷雾干燥粉末、流化床干燥粉末或生物膜等而获得。

在优选实施方式中，本发明的微生物制剂还包含含有原生动物的肥料组合物，优选堆肥或堆肥提取物。优选所述肥料组合物包含堆肥，更优选市售的堆肥提取物Fytaforce^TM植物(Fytaforce^TMPlant)或Fytaforce^TM土壤(Fytaforce^TMSoil)。

本发明的另一部分是通过添加本发明所述的微生物制剂来给植物或作物施肥的方法。优选在所述方法中，所述微生物制剂被添加至其上生长所述植物或作物的基质，优选其中所述基质为土壤，腐殖质，泥炭，树皮，珍珠岩，蛭石，浮石，砾石，纤维例如木材、椰子和大麻纤维，稻壳，砖碎片，聚苯乙烯包装花生，水耕培养物，以及它们的混合物，而不管该基质是否用常规和/或有机肥料正常地或额外地施肥，并且无论该植物作物是在室内种植还是室外，并且无论施用根据本发明的微生物制剂的生长季节的时间。

本发明的部分包括用于制备具有改善的施肥能力的基质的方法，其包括将本发明的微生物制剂添加到所述基质，而无论该基质是否正常或者额外地用常规和/或有机肥料施肥。

本发明的另一部分是用于制备根据本发明的微生物制剂的方法，包括以下步骤：

a.在水中充气一定量的堆肥；

b.从所述充气的堆肥污泥中提取微生物样品；

c.在充气条件下培养所述微生物数天，并在10～35℃，优选15～30℃，更优选20～30℃加入铵化合物；

d.开始新培养，使用从步骤c)获得的培养物的接种物，并且充气速度保持溶解氧浓度在适当的水平，在10～40℃、优选15～30℃、更优选20～30℃的温度下；

e.在发酵过程中需要时添加营养物和微量元素；

f.在足以达到每毫升>10⁵个硝化微生物的浓度的时间后收获；

g.通过收获和用水稀释，以<500ppm的降低的氨水平继续加入氨，以将培养物中的硝酸盐和亚硝酸盐浓度保持在低水平，而不抑制氨转化为亚硝酸盐和亚硝酸盐转化为硝酸盐；

h.任选添加含有原生动物的肥料组合物，优选堆肥或堆肥提取物；和

i.任选地在进一步使用或加工之前冷却培养物；和

j.任选干燥。

优选的方法通过其中pH在pH 4.0和pH 8之间变化的方法形成，所述变化优选以摆动(oscillation)方式存在。或者，本发明优选这样一种方法，其中在步骤c)和/或步骤d)中开始两个或更多个平行培养，其保持在不同pH，优选其中至少一个培养保持在酸性pH，并且其中至少一个培养保持在碱性pH，并且其中在步骤h)之前，将来自这些培养的收获物合并在该微生物制剂中。

本发明的另一部分是根据本发明的微生物制剂作为肥料的用途。此外，根据本发明的微生物制剂可以作为生物膜用在有机和化学肥料组合物和植物种子上，以及作为种子包衣的组分。而且，根据本发明的生物制剂可以用于在种植之前浸泡植物的根。

附图说明

图1、通过硝化生物促进剂(NF)组合物增强商业有机肥和化肥(包括羽毛/毛发粉，尿素和硫酸铵)的硝化作用。

图2、通过硝化生物肥料(NF)和NF浓缩物，增强有机肥料(DCM ECO Mix4)的硝化作用。

图3、通过NF、冷冻干燥的NF和流化床干燥的NF增强有机肥料(DCM ECO Mix 4)的硝化作用。

图4、显示从硝化生物肥料样品获取的每个OTU和紧密相关的描述物种的代表性序列的最大似然树。

图5、在根据实施例1和2制备的硝化生物肥料(NF)中氨氧化细菌(亚硝化单胞菌属、亚硝化螺旋菌属、亚硝化弧菌属和未分类的亚硝化单胞菌科)和亚硝酸盐氧化细菌(硝化菌属和硝化螺旋菌属)的相对丰度。

图6、在三种类型基质上、使用四种类型有机肥料、施用硝化生物肥料(NF)后15种作物的产量。产量计算为未接受NF的对照的百分比。误差线指出标准误差。

图7、三种类型的有机肥料在早春耕地条件下添加硝化生物肥料(NF)后的五种作物的产量。产量计算为对照(未用NF处理)的百分比。灰色柱，奥斯霍特(Oirschot)沙质土壤；白色柱，索恩(Thorn)沙质土壤。误差线指出标准误差。

图8、施用硝化生物肥料(NF)后，以对照的百分比表示的草生物量。产量计算为对照(未用NF处理)干重的百分比。误差线指出标准误差。

图9、在含有化肥的沙质土壤中添加硝化生物肥(NF)后的七种作物的产量。产量计算为未接受NF的对照的百分比。误差线指出标准误差。

图10、添加硝化生物肥(NF)和堆肥茶(Fytaforce，FF)后的产量。产量计算为未接受生物肥料的对照的百分比。误差线指出标准误差。

图11、添加硝化生物肥料(NF)，固氮的贝氏固氮菌(Beijerinckia)(N-固定)后的莴苣产量。堆肥茶(Fytaforce，FF)及其组合。产量计算为未接受生物肥料的对照的百分比。误差线指出标准误差。

图12、添加硝化生物肥(NF)和堆肥茶(Fytaforce，FF)和三种有机肥料后的莴苣的时间产量。误差线指出标准误差。

具体实施方式

本文将硝化微生物定义为能够单独或共同地将氨或铵离子转化成硝酸盐或硝酸根离子的那些微生物。硝化微生物为人所知已久，原则上可以分为两类：能够将氨转化为亚硝酸盐(NO₂^-)的微生物和能够将亚硝酸盐转化为硝酸盐的微生物。第一组的例子是铵氧化细菌如亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)，亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)和亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)以及来自奇古菌门(Thaumarchaeota)的古细菌，其包括如硝化球菌属(Nitrososphaera)、亚硝化杆菌属(Nitrostalea)和亚硝化侏儒菌属(Nitrosopumilus)；第二组的例子是硝化细菌属(Nitrobacter)和硝化螺旋菌属(Nitrospira)。硝化螺旋菌属的一些种类也能够将铵转化成硝酸盐。

施肥在本文中定义为使植物生长的土壤或其他物料肥沃的过程，其将通过提供更多营养物质并因此提供植物干重的增加中的任一者或两者或通过加速生长过程来增强植物的生长。

由于土壤中或商业肥料中的大部分氮以氨的形式存在，并且植物通常优选氨和硝酸盐的混合物作为氮源，存在于生长植物的基质中的氨转化成硝酸盐是有利的。然而，迄今为止提供微生物或微生物组合物以提供这种转化的实践措施在商业上尚未见吸引力。可能起作用的因素是硝化微生物需要充气，硝化微生物常常被生长基质或肥料中存在的其它微生物所埋没，硝酸盐很快从植物生长基质中泄漏，或者生长基质中存在的氨太少。失败的另一个主要原因可能是在许多情况下使用纯的细菌培养物或仅有少数物种的组合物。通过了解许多细菌种类具有高于pH 7的最佳pH范围，而在许多情况下植物正在生长的土壤或基质处于酸性范围，这一点尤为重要。为了普遍适用，在微生物制剂中具有多种不同的微生物属和种类，特别是包含古细菌，是更有利的。属的多样性不仅是有益的，因为它们提供了可用于硝化的多种不同的微生物，而且它确保即使在对于一些硝化微生物不是最佳的条件下，其他的硝化微生物属或种可以承担铵氧化和亚硝酸盐氧化功能。这种微生物属和种类的多样性可以通过为这些特定的硝化微生物富集天然存在的硝化微生物来源而获得。

作为这种天然来源的例子，可以从土壤中富集硝化微生物，但是优选从(有机)肥料如堆肥中富集硝化微生物。如下所述，富集操作需要几天时间，分批发酵4-40天后可以最好地获得微生物制剂。在这个时刻收获确保有足够的硝化微生物种类。当然，这将取决于最终制剂中是何种微生物，更具体地是何种硝化微生物，的物料的性质和来源。然而，认为即使在来源材料中的细菌和/或古细菌的数量相对较低的情况下，沿着如下所述的生产线进行的任何发酵过程都将产生足够量的硝化微生物。如果起始物料中硝化古细菌和/或细菌的数量特别低，则可通过添加在先批次的富集的硝化微生物来促进培养。也可以使用海水、来自沙滩或污水排出物的污泥，因为它们的硝化细菌含量相对较高。

富含硝化微生物的典型微生物制剂可以通过向水中添加硝化微生物的相对丰富的来源(例如堆肥)并保持温度在8～35℃之间，优选在22～30℃之间来获得。在这个来源中，硝化古细菌的数量可能是最小的，在微生物总数的0.2％的范围内。在这些古细菌中，属于奇古菌门的古细菌只构成一部分。溶液的pH优选不应保持在恒定值，而是可以在pH4.0-8.0的范围内变化。氧和氨以适当的量加入，优选铵浓度保持在相对较低以使亚硝酸盐浓度最小化，使得形成的所有亚硝酸盐可以被亚硝酸盐氧化细菌转化，并且无(毒性)亚硝酸盐积累。为了从原始材料中除去诸如纤维、石头和植物材料的非细菌污染物，可使培养物通过<2mm，优选小于250μm，更优选小于75μm的筛网。可以施加多于一个的过滤步骤，首先从粗过滤开始，然后再进行其他更精细的过滤。此外，发酵罐的内容物可以通过孔径为0.5或0.2μm的微过滤来浓缩。在这样的培养物中，可以容易地达到10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹每毫升的微生物浓度。

发酵培养物优选通过絮凝、离心或微过滤浓缩到至少10⁷个微生物/ml的密度，优选至少10⁸个，优选至少10⁹个，更优选至少10¹⁰个并且可能达到至少10¹¹个微生物/ml。这样的浓度可以通过加工发酵培养物来实现，也可以通过透析发酵培养物以除去有毒的硝酸盐和有毒的亚硝酸盐(以及来自可能造成细菌转化的终产物抑制的产生的硝酸盐)。

收获的培养物可以直接施用，但优选经干燥，例如通过冷冻干燥，喷雾干燥或流化床干燥。

因此本发明涉及包含铵氧化菌的微生物制剂，至少包含亚硝化单胞菌科的细菌，所述亚硝化单胞菌科包括亚硝化单胞菌属、亚硝化螺旋菌属和亚硝化弧菌属，和/或奇古菌门的古细菌，在所述细菌和古细菌中存在至少两个不同的种，和至少选自硝化杆菌属和硝化螺旋菌属的细菌，其中存在至少两个不同的种。这种细菌制剂可以从如上所述的发酵方法中收获，并且通常含有至少10⁵个细菌/ml，优选至少10⁶个细菌/ml，更优选至少10⁷个细菌/ml，更优选至少10⁸个细菌ml，更优选至少10⁹个细菌/ml，更优选至少10¹⁰个细菌/ml，更优选至少10¹¹个细菌/ml。

在微生物总数中，细菌属亚硝化单胞菌属、亚硝化螺旋菌属和亚硝化弧菌属至少占0.1％，优选至少0.5％，更优选至少1％，更优选至少8％，更优选至少17％，更优选至少31％，更优选至少36％。此外，代替铵氧化细菌或除铵氧化细菌之外，培养物还可含有铵氧化古细菌，优选来自奇古菌门。铵氧化古细菌的总数优选大于微生物总数的0.05％，更优选大于0.5％，更优选大于5.8％，更优选大于6.2％，更优选大于7.5％，和更优选大于8.5％。

此外，所述硝化菌属和硝化螺旋菌属的细菌的量为微生物总数的至少0.1％，优选至少0.4％，更优选至少3％，更优选至少11％，更优选至少16％，更优选至少28％，更优选至少36％。尽管可以使用硝化细菌的所有属的许多种，但是优选来自亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)和亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)的细菌包含下述的两个种或更多种、优选三个种或更多种、优选四个种或更多种、更优选下述所有的种：亚硝化单胞菌(Nitrosomonas nitrosa)、普通亚硝化单胞菌(Nitrosomonas communis)，欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)，富氮亚硝化单胞菌(Nitrosomonas eutropha)，尿素亚硝化单胞菌(Nitrosomonas ureae)，寡养亚硝化单胞菌(Nitrosomonas oligotropha)，普通亚硝化单胞菌(Nitrosomonas communis)，寻常亚硝化单胞菌(Nitrosomonas vulgaris)、多型亚硝化螺旋菌(Nitrosospira multiformis)和小亚硝化弧菌(Nitrosovibrio tenuis)以及未分类的亚硝化弧菌种(Nitrosovibrio sp.)。类似地，优选古细菌群包含选自奇古菌门(Thaumarchaeota)(还称为中温泉古菌)的一个或多个种、优选两个或更多个种的生物体。该群的成员包括罕见亚硝化球菌属(Candidatus Nitrososphaera)、罕见亚硝化杆菌属(Candidatus Nitrosotalea)或罕见亚硝化侏儒菌属(Candidatus Nitrosopumilus)。这些生物体也在亚硝化杆菌属(Nitrosotalea)、亚硝化球菌属(Nitrososphaera)或亚硝化侏儒菌属(Nitrosopumilum)的属名之下。优选的种是危险亚硝化杆菌(Nitrosotalea devanaterra)、海洋亚硝化侏儒菌(Nitrosopumilum maritimus)、维也纳亚硝化球菌(Nitrososphaera viennensis)和加尔加亚硝化球菌(Nitrososphaera gargensis)。

类似地，优选来自硝化菌属和硝化螺旋菌属的细菌包含下述的两个种或更多种、优选三个种或更多种、优选四个种或更多种、更优选下述所有种：海洋硝化螺旋菌(Nitrospira marina)、罕见脱落硝化螺旋菌(Candidatus Nitrospira defluvii)、莫斯科硝化螺旋菌(Nitrospira moscoviensis)、威氏硝化菌(Nitrobacter winogradskyi)、寻常硝化菌(Nitrobacter vulgaris)、奥卡硝化菌(Nitrobacter alkalicus)和汉氏硝化菌(Nitrobacter hamburgensis)以及未分类的硝化菌种(Nitrobacter sp.)。从本发明的实验部分可以看出，微生物制剂含有大量的微生物，其中只有一部分由硝化微生物形成。此外，许多硝化微生物是这样的物种，该物种通过报道的实验中使用的试验在种水平上不易被识别。尽管如此，似乎还有更多的细菌和古细菌物种已在上文提到但没有在实验中得到具体识别。然而，这些被归类为属于硝化细菌或古细菌属，因此应该被认为具有铵和/或亚硝酸盐氧化活性。

微生物制剂可以直接用作土壤或其他生长基质或肥料组合物的添加剂。它可以与有机和化学/无机肥料二者结合使用。为此目的，微生物制剂优选配制成液体、冻干粉末、喷雾干燥粉末或流化床干燥粉末。优选地，本发明的微生物制剂以这样的方式配制，使得它可以容易地喷洒覆盖在其应该施用的区域上。为了能够喷洒制剂，制剂中颗粒的粒度不能超过250μm，并且优选具有小于150μm，优选小于75μm，更优选小于50μm，更优选小于30μm的尺寸。

为了喷洒，微生物制剂优选配制成液体或悬浮液。微生物溶解或悬浮于其中的水性溶剂可以是水或可以是直接来自发酵的培养液。或者，为了储存或运输，收获的培养物悬浮液可以在有氧条件下冷却，优选在低于10℃，更优选低于4℃，最优选低于2℃的温度下冷却。

发酵产物也可以干燥储存。通常的防腐剂方法可用于此，例如冻干或喷雾干燥。储存的微生物培养物的重建可以通过将储存的粉末溶解在水性溶液中来实现。

优选地，在生产根据本发明的微生物制剂的方法中，采取以下步骤：

a.在水中充气一定量的堆肥；

b.从所述充气的堆肥污泥中提取微生物样品；

c.充气培养所述微生物数天，并在温度10～35℃下加入铵化合物；

d.开始新培养，使用从步骤c)获得的培养物的接种物或从步骤c)和f)或c)和g)获得的培养物的组合获得的接种物，并且充气速度保持溶解氧浓度在适当的水平，在10～40℃、更优选20～30℃的温度下；

e.在发酵过程中需要时添加营养物和微量元素；

f.在足以达到每毫升>10⁵个硝化微生物的浓度的时间后收获；

g.通过收获和用水稀释，以<500ppm的降低的氨水平继续加入氨，以将培养物中的硝酸盐和亚硝酸盐浓度保持在低水平，而不抑制氨转化为亚硝酸盐和亚硝酸盐转化为硝酸盐；

h.任选添加含有原生动物的肥料组合物，优选堆肥或堆肥提取物。

在上述方法中，在一个或多个培养步骤中，对设定的pH值没有要求。已经发现，在本发明的微生物制剂中需要存在的许多微生物具有相互排斥的pH偏好。亚硝化单胞菌属细菌的pH偏好范围在pH 7-7.5，而大部分古细菌的pH偏好在酸性范围(pH4-7)。因此，如果培养基保持在碱性pH下，将有利于亚硝化单胞菌的生长，但是会对古细菌的生长产生不利影响。相反，在更酸性的pH下培养会刺激古细菌的生长，但会妨碍亚硝化单胞菌的生长。因此，理想的是，培养物的pH值应该是摆动的，这也可以通过分批加入含氨或铵的化合物来完成。

或者，通过在不同的pH下进行多种培养方法，并通过将这些培养物的收获物混合入最终制剂，可以获得最终微生物制剂中的足够的生物多样性。理想地，至少保持两种培养物，一种在酸性pH下，另一种在碱性pH下。

在该方法中，堆肥优选为来自有机废物的堆肥，例如绿色废物、花园废物、厨余垃圾、粪肥等。已经发现，在下面描述的实验中使用的堆肥在培养开始时具有低数量的硝化微生物。亚硝化单胞菌目(Nitrosomonadae)的数量可能低至0.6％，而没有发现亚硝化单胞菌属的细菌。硝化细菌属的数量可能低至0.1％，古细菌总数为0.2％，而没有可追踪数量的奇古菌门成员。

细菌的提取可以通过如上所述的初始过滤步骤进行。

可以添加的铵化合物可以是氨，例如来自粪肥的有机NH₃或者牲畜棚的气体废物，还可以是含铵的化合物如氯化铵、尿素、硫酸铵、碳酸铵和磷酸铵以及由在细菌和真菌上喂养的线虫和/或原生动物产生的氨。铵化合物也可以用来调节培养物的pH值。在步骤c)中实现硝化微生物的第一次富集。这仅在接下来的步骤中得到增强，其中来自培养物的接种物被用来启动新的培养。充气量在10％以上，优选在20％以上，但应注意不要使培养物完全充气。优选80％的充气上限，更优选50％的充气上限。在该培养物中，再次加入如上所列的氨和/或铵化合物，但是以比例受限的量加入，优选小于500ppm，更优选小于400ppm，更优选小于300ppm，最优选小于250ppm，但浓度可能低至小于50ppm。同样这里可以分批加入铵化合物以在培养期间获得摆动的pH值。应该在这些条件下维持发酵培养物足够的时间以达到每毫升至少10⁶个细胞的微生物细胞计数，其中至少10％是硝化微生物。通过进行如上所述的培养，可以在至少10天、或至少12天、或至少15天后容易地达到这样的条件。当然，为了防止当培养维持时间较长时的耗尽，需要定期或连续添加营养物质和微量元素，其中营养物质可能含有碳源、铵化合物和磷和硫的一些来源。

应该注意的是，培养物保持足够的多样性，从某种意义上说，具有可用的大量的细菌和古细菌物种，特别是硝化微生物。如上所述，改变培养条件是适当的，从而防止产生特别适用于一种细菌或古细菌种类的环境，而不是在稳定条件下延长培养超过100或优选不超过75天，更优选不超过60天，更优选不超过50天，这是因为在培养过程中，机会性(opportunistic)物种会过度生长而盖过低竞争性细菌，从而降低了培养物的生物多样性。如上所述，这种生物多样性是当前微生物制剂的主要优点之一。

尽管本发明的微生物制剂可以原样使用，从而例如增加已经提供有机肥或化肥的植物生长基质中的硝酸盐可利用性，但仍优选与肥料一起施用和/或另外施用。这样的肥料可以是化学肥料，但是优选它是与有机农业相容的肥料，例如本说明书的背景部分中提到的肥料：粪肥，覆盖作物和堆肥。或者，可以使用富含氮源的有机肥料，例如毛发废料、羽毛废料、骨粉、(鸡)粪肥和苜蓿颗粒(Lucerne pellet)。此外，如实验部分所示，甚至可以向植物添加多于一种的肥料。

为了将微生物制剂施用于植物，在一个实施方式中，将微生物制剂加入到植物基质中。在这方面，植物基质可以是适于培养植物的任何基质，如土壤(沙基，淤泥基，泥炭基和粘土基土壤)，腐殖质，泥炭，树皮，珍珠岩，蛭石，浮石，砾石，纤维如木材，椰子和大麻纤维，稻壳，砖碎片，聚苯乙烯包装花生，水耕培养物，以及它们的混合物等。这些基质中的大部分，如在实验部分中使用的那些，都是可商购的。细菌制剂可以加入到基质中，或者可以将其喷洒在植物上，例如，在叶子，茎或者根上。对基质的添加是优选的。

在本发明的一个实施方式中，细菌制剂与肥料，优选含有原生动物的肥料混合。如本文所用，原生动物被定义为包含鞭毛虫、阿米巴虫和/或纤毛虫的单细胞生物体。包含原生动物的肥料包括堆肥，包括蠕虫的脱落物(casting)。可添加微生物制剂的优选肥料组合物是来源于堆肥(来自有机废物)的堆肥提取物，优选每毫升具有多于10⁴个原生动物，更优选多于10⁵个原生动物。这种堆肥提取物是Fytaforce^TM植物或Fytaforce^TM土壤(获自荷兰比兹莫特的Soiltech公司)。向硝化微生物组合物中加入包含原生动物的组合物是有利的，因为原生动物通过真菌和细菌使有机氮矿化而生成氨，其中原生动物通过在细菌和真菌上喂养而使这些微生物矿化(Clarholm等，1985,Soil Biol.Biochem.17:181-187；Bonkowski,M.等,2004,New Phytol.162:617-631；Robinson等,1989,Plant and Soil 117:185-193；Kuikman等,1991,Soil Biol.Biochem.23:193-200,Ronn等,2001,Pedobiologia 45:481-495)。以细菌和真菌为食的原生动物(以及线虫)会分泌氨、胺和氨基酸，因为它们比富含蛋白质的细菌具有更高的C/N比。

由于这个过程，植物可利用的硝酸盐的量将比基于原始可得的铵化合物的转化的更高。

这种微生物制剂和肥料的混合物的施用与未混合的制剂一样进行；优选添加到植物的基质中。基质的添加可以是用混合的或未混合的微生物制剂覆盖基质，或者混合的或未混合的微生物制剂可以或多或少地与基质彻底混合，例如通过用本发明的微生物制剂犁或耙该基质。

如实验部分所证明的，与对照植物相比，本发明的微生物制剂的应用可能对植物的大小有影响，其中植物大小以鲜重或干重表示。然而，本发明的微生物制剂的应用也可以引起植物生长速度的增加。因此，如实验部分所示，使用施肥方案不仅可以增加作物的收获量，而且还可以增加培养作物的周转时间，从而可以在相同的时间周期内获得更多的作物循环。

单独使用本发明的微生物制剂或与肥料组合使用可以增加田地或观赏作物的产量，和/或可以减少作物的栽培时间。在这两种情况下，作物的种植者都有经济收益。该制剂对于提高属于茄科、菊科、豆科、禾本科、十字花科、伞形科、苋科和葫芦科的植物的产量特别有利。优选用所述微生物制剂处理的植物是甜菜，西红柿，马铃薯，莴苣，菊花，向日葵，豆类，豌豆，羽扇豆，胡萝卜，小麦，大米，黑麦，玉米，洋甘蓝，大白菜，花椰菜，油菜籽，芥花油菜，根芹菜，菠菜，甜菜，小胡瓜，黄瓜和草。

该制剂可以在温室条件下、在可耕地条件下、甚至在水耕或其他(无土壤)栽培系统中使用。

它可以用于所有季节和各种温度和气候条件。从实验数据可以推断出它在早春、低温条件下非常有用。

它可以有利地在传统农业条件下使用，但它也符合有机耕作条件，并且如实施例中所示，其与有机肥料结合得到极好的结果。

除了如上所述的根据本发明的微生物制剂的应用之外，微生物制剂还可以覆盖有机肥料的生物膜的形式应用。这可以看作是微生物制剂和肥料的“混合”的特殊形式，但它形成了本发明的具体实施方式，因为它使混合物具有更多优点。通过使硝化微生物介于有机肥料和其将要添加入的基质之间，微生物将能够消耗存在于基质中的(可能有毒的)铵源，并且还从如上所述通过肥料生产铵中获益。

其中可以应用根据本发明的微生物制剂的另一个有利的实施方式是在种植之前使用该制剂浸渍种植材料如马铃薯块茎或植物根部。浸根是一种在园艺上经常使用的技术，并且通过使用微生物制剂浸渍植物根系统将提供一系列微生物，其可立即递送必需的氮源用于营养供给。对于这种应用，甚至可以使用更低浓度的微生物制剂(例如通过用水稀释制剂而获得)。

此外，其可以通过与土壤混合、在种子颗粒中和通过喷洒在土壤和/或植物上来使用。关于伴随种子的施用，本发明的微生物制剂可以用作种子上的生物膜，或者可以与通常用于种子包衣的其它包衣材料一起使用，例如，用于形成种子颗粒的包衣。

进一步发现，本发明的微生物制剂可以有利地与固氮微生物的应用相组合。固氮微生物，如细菌或古细菌，是能够将大气氮转化为无机化合物(最常见的是氨)并由此将其转化为可被植物利用的形式的微生物。认识到两种固氮细菌：自由存活(非共生)细菌，包括蓝藻(或蓝绿藻)鱼腥藻和发菜以及例如固氮菌属(Azotobacter)，贝氏固氮菌属(Beijerinckia)和梭菌属(Clostridium)；和共生(共栖)细菌，例如与豆科植物(例如，豌豆科的各成员)相关的根瘤菌属(Rhizobium)，弗兰克氏菌属(Frankia)和某些固氮螺旋菌种(Azospirillum)，其与谷类草相关联。

显而易见的是，固氮(由固氮微生物提供)和氨向硝酸盐的转化(由本发明的微生物制剂提供，其中存在铵氧化和亚硝酸盐氧化微生物)的组合能够向植物提供硝酸盐。而且，如实验部分所示，进一步添加堆肥进一步增加了有益效果。

本发明的另一个实施方式是应用微生物制剂来增加植物中氮的量和/或浓度。当植物被用作绿肥(green manure)时，这是特别有用的。如实验部分所示，从牧场获得的生物量可能增加植物的氮含量。通常，绿肥(原则上)只能用于已知通过与固氮细菌的相互作用来固氮的植物，例如豆类植物(与根瘤菌相互作用)。由于本发明，通常不知道用作绿肥(或仅当与已知的绿肥植物混合时)的植物也能用于此目的。

待施用于植物的微生物制剂的剂量将取决于植物的基质、堆肥或其它肥料是否已经添加至微生物制剂，以及气候环境，尤其是湿度。通常可以说，应用超过0.02％的硝化微生物的微生物制剂(每盆总容积的计算百分比为2.51)已经提供了植物生长上的增强。有效剂量还可以表示为硝化微生物培养的结果，其中培养物提供约10⁸CFU/ml的微生物细胞计数，其中至少10％，优选10至50％的微生物是硝化微生物。应该指出，微生物制剂中的古细菌数量可能相对较低，但仍然有效。古细菌的有效的氨氧化特性(参见例如Martens-Habbema,W.等,2009,Nature,461:976-981)允许在低效价时就已经有效，特别是当与本发明微生物制剂中的硝化细菌一起作用时。从实验部分可以看出，通过在1立方米基质上施用0.5 1微生物制剂(与等量的包含原生动物的肥料混合)已经显示出硝化作用。增加剂量可能会增加刺激作用，但是应该注意的是，当硝化微生物的量增加时，也应该提供作为这些微生物的氮源的铵的增加。这可以通过将硝化微生物样品与包含原生动物的肥料如堆肥混合来完成。从下面的实验可以看出，本发明的微生物制剂与包括原生动物的肥料(如堆肥或堆肥提取物)的组合增加了对植物生长(速度)的作用。当基质相对较差时，可以最好地观察到这种效果：如果基质已经包含堆肥，则向硝化微生物组合物中添加堆肥提取物似乎仅在高剂量下是有益的。

进一步提出的是，能够容易地确定由培养物获得的微生物的构成(并且尤其是铵氧化古细菌和铵氧化细菌的量)的技术人员也可以很容易地确定微生物制剂的何种浓度(任选添加到另外的施肥组合物中)可以产生期望的效果。此外，施用微生物制剂的剂量和条件可以源自下面的实施例。技术人员将会知道或可以容易地找出，对于具体的作物和生长条件而言，本发明的微生物制剂的最佳剂量。

对于有机培养活动，微生物制剂的总体卫生和质量是重要的。所获得的产品应具有可接受水平的霉菌毒素、重金属和人类病原体。因此，在ISO22000条件下生产根据本发明的微生物制剂是有利的，因此这些产品可以使用而没有突发疾病的风险，例如EHEC或O157:7大肠杆菌(E.coli)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌(Salmonella)等。技术人员将知道应采取哪些措施来符合ISO22000标准。

在下面的实验描述中举例说明了本发明。这些仅仅是示例，并不以任何方式限制上述发明。

实施例

实施例1 硝化细菌的富集培养和硝化能力的测定

20kg的堆肥(Van Iersel公司，比兹莫特)在环境温度下在60L水中充气30分钟。所述充气的堆肥污泥中的微生物样品通过250目筛进行筛分提取，所述微生物在充气下培养数天，同时控制温度在20和30℃之间，pH值在6和7.5之间。磷酸氢二铵以1.6g/L的浓度加入。然后开始新的培养，通过将100升水与从该培养物获得的50升堆肥提取物充气混合，同时控制温度在20和30℃之间，pH值在6和7.5之间来进行。在发酵过程中需要的时候添加营养物和微量元素。

当培养物的密度达到每毫升约1至5×10⁸个微生物时，可以收获。通过以<500ppm的低水平氨馈入氨来继续培养。不时地收获培养物并用水稀释以使培养物中的硝酸盐和亚硝酸盐浓度保持在低水平，以防止氨向亚硝酸盐和亚硝酸盐向硝酸盐的转化受到抑制。以这种方式培养更多天后，以约1至5×10⁸/ml的细胞计数获得如图7所示的组合物。

通过上述培养方法获得的硝化微生物样品与市售堆肥提取物组合物Fytaforce^TM植物(荷兰比兹莫特的Soiltech公司)以1:1混合，并应用于硝化试验。Fytaforce^TM植物或Fytaforce^TM土壤含有每毫升至少4×10⁷个真菌和5×10⁵个原生动物。

在10L规模的基质混合物上进行硝化试验，所述混合物包含70％的白泥炭，30％的黑泥炭以及6kg的白垩和0.1kg PG Micromix(荷兰弗拉尔丁恩的Yara Benelux公司)。向该混合物中进一步加入10克硫酸铵和各种剂量的微生物制剂。在22℃孵育4周后测量硝酸盐和pH。

从表1可以看出，微生物制剂(与Fytaforce Plant^TM的混合物)在泥炭混合物中的活性要高得多。

表1.各种测试混合物在泥炭基质上孵育4周后的硝酸盐形成和pH的结果。

实施例2：使用微过滤浓缩硝化生物肥料组合物

为了提高硝化生物肥料组合物(NF)的细胞数量并减小体积，通过微过滤来生产浓缩物。评估浓缩物的细胞浓度和硝化活性。

通过在环境温度下在补充有浓度为1.6g/L的磷酸氢二铵的60升水中将20kg堆肥(比兹莫特的Van Iersel公司)充气60分钟来生产NF。充气的堆肥提取物通过250μm筛进行筛分，并且在20～30℃的温度和5.8～7.5的pH下充气培养数天。开始新的孵育，使用50升这种孵育物与50升水和50升先前批次的硝化生物肥料组合物混合。这种孵育在24～30℃的温度下持续充气，pH值控制在5.8-7.5之间。在发酵过程中持续添加营养物质，铵的来源和微量元素。大约2周后，通过微过滤浓缩硝化组合物。

使用0.2μm中空纤维错流过滤器(WaterSep Investigator 12)通过微过滤浓缩滤过物。通过在错流膜组件上再循环，将约15升预筛分的NF浓缩至0.7升的体积。得到约20倍的浓缩系数。

使用靶向铵单加氧酶基因(AMO)的qPCR评估氨氧化细菌和古细菌的细胞数目。用于细菌AMO的引物对是amoA-1F(5’-GGG GHT TYT ACT GGT GGT-3’)和amoA-2R(5’-CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC-3’)，和用于古细菌AMO的Arch-amoA-for(CTG AYT GGG CYT GGA CAT C)和Arch-amoA-rev(5’-TTC TTC TTT GTT GCC CAG TA-3’)。用qPCR引物338f(5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)和518r(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)测定总细菌细胞数。

使用氧消耗测定评估硝化活性。将50mL的NF样品加入温控混合容器中。使用安装有数据记录仪的氧气电极监测氧气浓度。将容器充气以获得>7mg/L的氧气浓度。随后停止充气并测量耗氧量以评估内源性耗氧率。类似地，通过向样品中添加铵并跟踪氧气消耗来评估铵氧化速率。对内源呼吸校正铵氧化率并表示为硝酸盐产量。

表2提供了结果的概述。观察到对应于浓缩系数的细胞数量增加和硝化活动增加。总之：结果表明，可以使用微过滤有效地浓缩NF溶液，增加细胞数量和硝化率。

表2.浓缩和非浓缩NF的细胞计数和硝化活性。

实施例3：使用浓缩、未浓缩和干燥的生物肥料组合物增强土壤中有机肥和化肥的硝化作用。

硝化生物肥料组合物(NF)对改善有机肥和化肥的硝化作用的效果使用没有作物的基于土壤的试验来测试。此外，测试NF浓缩物和干燥的NF组合物。

根据实施例2生产NF，并在以下商业肥料上进行测试：DCM ECO混合物4(DCM Nederland有限责任公司，荷兰)，Monterra Nitrogen 13羽毛/毛发粉(荷兰Vlamings公司)，硫酸铵和尿素。另外，生产NF浓缩物(100x)和冻干和流化床干燥的NF组合物。通过过滤浓缩NF样品，然后干燥。为了冷冻干燥，浓缩物与含有脱脂乳、蔗糖和甘油的冷冻保护剂混合物混合，随后在-60℃的温度下真空干燥。对于流化床干燥，制备了两种分开的干燥组合物。对于两种组合物，都生产NF浓缩物。将一种浓缩物真空过滤并挤出至1mm粒度。另一种浓缩物与蛭石混合。随后将这些组合物在30℃的流化床干燥器中分开干燥。

土壤基硝化试验采用标准盆栽土与单肥料混合进行；硫酸铵(3.85g/kg)，尿素(1.73g/kg)，DCM ECO混合物4(11.6g/kg)和羽毛/毛发粉(6.27g/kg)。NF浓缩物和未浓缩的NF以总盆体积的1％施用。水用作对照。当需要保持潮湿的条件时，向盆浇水。样品在不同的时间间隔重复三次。重复样品用于冷冻干燥的NF样品，单个样品用于流化床干燥样品。通过用两体积的脱矿质水摇动30分钟制备土壤提取物，并用离子选择性电极(Orion Versa Star，Thermo Scientific公司)测定硝酸盐浓度。

图1，图2和图3提供了结果的概述。5至7天后在用未浓缩的NF修正的样品中观察到硝化作用。对照样品在长达15天的时间内没有显示任何显著的硝化作用。约15天后，浓缩的NF显示立现的硝化平台期。与对照相比，冷冻干燥的和流化床干燥的NF均显示增强的硝化作用

总之：这些结果表明，NF，NF浓缩物和冻干的NF提高了有机肥和化肥的铵转化为硝酸盐的转化率。

实施例4：硝化生物肥料溶液的微生物群落组成

对不同批次硝化生物肥料(NF)中的微生物群落组成进行了一年以上的跟踪研究。

根据实施例1制备了两个样品，取自2014年12月24日和2015年1月5日(E1-组)。在2015年4月13日、2015年6月15日、2016年11月4日、2016年2月9日和2016年2月23日采集了根据实施例2制备的另外五个样品(E2-组)，其中样品NF 13/04/15是用于将终产品NF转移到下一个起始培养物的第一个样品。根据制造商的说明使用土壤试剂盒(Macherey-Nagel公司，德国迪伦)从1ml NF中提取DNA。通过Illumina MiSeq扩增子测序16S rRNA V3-V4区域鉴定微生物群落(荷兰莱登的BaseClear公司(El-组)；德国柏林的LGC基因组公司(E2-组))。以97％序列同一性截止值将序列聚类成的操作分类单元(OTU)，其通常被认为是区分不同微生物物种的截止值。使用Greengenes数据库将E1组样品分类到种或更高的水平。用SILVA数据库将E2组样品分类到属或更高的水平。属于亚硝化球菌属(Nitrososphaera)，亚硝化单胞菌科(亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)、亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio))，硝化菌属(Nitrobacter)和硝化螺旋菌属(Nitrospira)的OTU的代表性序列通过对EzTaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行比对来进一步鉴定。OTU水平数据仅在E2组样品中可得。将OTU序列和密切相关的描述物种进行比对，并用MEGA6(www.megasoftware.net)创建最大似然树。

NF似乎含有多种微生物。通常存在的组是氨和亚硝酸盐氧化细菌(参见下文)，奇古菌门(6％；例如亚硝化球菌属(Nitrososphaera))、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)(6％；例如噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、PHOS-HE51)、黄杆菌目(Flavobacteriales)(2％；例如蟑螂杆状体科(Cryomorphaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae))、芽孢杆菌纲(Bacilli)(4％；例如芽孢杆菌属(Bacillus),嗜高温杆菌(Geobacillus),类芽孢杆菌属(Paenibacillus),鲁梅利杆菌属(Rummeliibacillus)),叶瘤杆菌科(Phyllobacteriaceae)(3％；例如硝酸盐还原菌(Nitratireductor))和黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)(2％；例如溶杆菌属(Lysobacter))。

所有的氨氧化细菌都属于亚硝化单胞菌科，这些是亚硝化单胞菌(Nitrosomonas nitrosa)、尿素亚硝化单胞菌(Nitrosomonas ureae)、欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)、寡养亚硝化单胞菌(Nitrosomonas oligotropha)、普通亚硝化单胞菌(Nitrosomonas communis)、寻常亚硝化单胞菌(Nitrosomonas vulgaris)、未分类的亚硝化单胞菌种(Nitrosomonas sp.)、多型亚硝化螺旋菌(Nitrosospira multiformis)、未分类的亚硝化螺旋菌种(Nitrosospira sp.)、小亚硝化弧菌(Nitrosovibrio tenuis)以及未分类的亚硝化弧菌种(Nitrosovibrio sp.)和未分类的亚硝化单胞菌科。针对亚硝化单胞菌科鉴定了二十六个OTU。对氨氧化古细菌属亚硝化球菌属(Nitrososphaera)发现了两个OTU，分别属于维也纳亚硝化球菌(Nitrososphaera viennensis)或加尔加亚硝化球菌(Nitrososphaera gargensis)。亚硝酸盐氧化细菌属于威氏硝化菌(Nitrobacter winogradskyi)、奥卡硝化菌(Nitrobacter alkalicus)和汉氏硝化菌(Nitrobacter hamburgensis)以及未分类的硝化菌种(Nitrobacter sp.)、海洋硝化螺旋菌(Nitrospira marina)、罕见脱落硝化螺旋菌(Candidatus Nitrospira defluvi)、莫斯科硝化螺旋菌(Nitrospira moscoviensis)和未分类的硝化螺旋菌种，并且由7个OUT代表。图4给出了代表性OTU序列的最大似然树及其与所描述的物种相比的位置。

图5显示了氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌的相对丰度。样品NF 13/04/15是用于将终产品NF转移到根据实施例2所述方法的下一个起始培养物的第一个样品。下列批次显示氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌的数量增加，导致目前产品中每个组的稳定值约为30％。对于氨氧化剂，每个样品的OTU数量在10-14之间变化，对于亚硝酸盐氧化剂，OTU数量在3-4之间变化(表2)。OTU的数量(用97％序列同一性截断产生)是种的数量的良好指标。然而，有些种从来没有被描述过，而其他则不能根据16S rRNA序列进行区分。因此，种名称只能分配到有限数量的OTU。每种样品可以鉴定5至9个硝化菌种(表3)。

总之，NF含有各种各样的微生物物种，在根据实施例2制备的NF中具有大约60％的氨氧化和亚硝酸盐氧化细菌。氨氧化细菌由亚硝化单胞菌科(亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)、亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio))代表，亚硝酸盐氧化细菌由硝化菌属(Nitrobacter)和硝化螺旋菌属(Nitrospira)代表。还检测到亚硝化球菌属(Nitrososphaera)的氨氧化古细菌。

表3：不同NF批次中的氨氧化细菌(AOB)和亚硝酸盐氧化细菌(NOB)的OTU数目和鉴定的种。

实施例5：通过在用有机肥料修正的一系列基质中的硝化生物肥料溶液来提高多种作物的产量

硝化生物肥料溶液(NF)的普遍适用性进行了评估，使用代表植物科茄科，菊科，豆科，禾本科，十字花科，伞形科，苋科和葫芦科的多种作物。

选择的示例性作物物种是甜椒(Capsicum annuum)，番茄(Solanum lycopersicum)，莴苣(Lactuca Sativa)，菊花，向日葵(Helianthus annuus)，法国豆(Phaseolus vulgaris)，羽扇豆(Lupinus luteus)，小麦(Triticum aestivum)、皱叶甘蓝(Brassica oleracea)，大白菜(Brassica pekinensis)，花椰菜(Brassica olearacea变体botrytis)，芹菜(Apium graveolens变体rapaceum)，菠菜(Spinacia olearacea)，小胡瓜(Cucurbita pepo)和黄瓜(Cucumis sativus)。

豆类，小麦，菠菜和花椰菜是从种子生长的，其他的作物是作为幼苗获得的。将植物转移到具有标准盆栽土壤、富含沙质土壤或椰子纤维的盆中。将基质与四种有机肥料、DCM ECO混合物3或4(4.2或3.0g/L)、鸡粪肥(Fertisol鸡粪肥颗粒，5.3g/L)、首蓿(EKO首蓿颗粒，7.1g/L)或羽毛/毛发粉(Monterra Nitrogen 13；1.6g/L)预混合。

如实施例2中所述制备NF，并将其以总盆体积的百分比应用于土壤或直接施用于种子。对照处理接受等量的水。植物在荷兰的温室中生长，并在需要时浇水以保持适度的潮湿条件。收获时，测定地上鲜重，并计算与对照相比的相对产量。

在下述作物中观察到由NF引起的产量增加：甜椒，番茄(茄科)，莴苣，菊花，向日葵(菊科)，法国豆，羽扇豆(豆科)，小麦(禾本科)，皱叶甘蓝，大白菜，花椰菜(十字花科)，芹菜(伞形科)，菠菜(苋科)，小胡瓜和黄瓜(葫芦科)(图6)。在盆栽土壤，椰子纤维和沙质土壤中发现了积极的效果，其未修正或用四种有机肥料之一、DCM ECO混合物、鸡粪肥、苜蓿或羽毛/毛发粉进行修正。产量取决于具体的作物-土壤-肥料组合。对于大多数作物来说，含有DCM ECO混合物的盆栽土壤中1％的NF对于甜椒(263％)，番茄(217％)，莴苣(198％)，豆类(218％)，芹菜(240％)和菠菜(211％)非常有效，产量翻倍或更多。

总之，NF可以增加多种植物科和作物的产量。在三种基质和作为土壤或种子处理施用的四种有机肥料上使用十五种不同的作物证明了这一点。可以获得超过两倍半的产量。

实施例6：在早春可耕作农业中，硝化生物肥料溶液对作物产量的积极作用

在低温下的沙质土壤中测试了硝化生物肥料溶液(NF)对作物产量的影响，以评估对早春可耕作农业的效果。

作物品种是莴苣(Lactuca Sativa)，菠菜(Spinacia olearaced)，花椰菜(Brassica olearacea变体botrytis)，甜菜根(Beta vulgaris亚种vulgaris变体ruba)和马铃薯(Solanum tuberosum)。从两处田地获得沙质土壤，一个pH-H₂O 6.4、17ppm硝酸盐和4.9ppm铵(奥斯霍特，荷兰)，另一个pH-H₂O 6.6、25ppm硝酸盐和5.2ppm铵(索恩，荷兰)。

将马铃薯块茎，菠菜种子和幼年莴苣，花椰菜和甜菜根植物种植在具有两种不同沙质土壤的盆中，所述土壤与三种有机肥料、DCM ECO混合物4(3.0g/L)，鸡粪肥(Fertisol鸡粪肥颗粒，5.3g/L)或苜蓿(EKO苜蓿颗粒，7.1g/L)混合。如实施例2中所述制备NF并以0.1％、1％和2％的总盆体积施用，每次处理设8-12个重复。水用作对照。植物在荷兰的一个未升温的温室中在低温条件下生长，以模拟早春的室外温度。平均温度为9至10℃，最低温度在4℃左右，最高温度在14℃左右。植物在需要时浇水，以保持适度的潮湿环境。收获时，测定地上鲜重，并计算与对照相比的相对产量。

在含三种有机肥料的两种类型的沙质土壤上的所有五种作物在NF的影响下都表现出增加的产量(图7)。在这些条件下获得的产量比对照高多至90％。结合DCM Eco混合物，即使0.1％的NF剂量也可以获得更高的产量。

总之，NF可以在早春可耕作条件下增加产量。

实施例7：硝化生物肥料溶液对草地的积极作用

测试了硝化生物肥料溶液(NF)对草地(牧草)发育的影响。

从荷兰的草地取直径12.5厘米的土柱。如实施例2中所述制备NF，并以每公顷100升施用，重复8次。水用作对照。将柱用NF处理并放在荷兰的未升温的温室中，并在从2016年3月10日到4月15日期间放置在室外。在收获时，将地上生物量干燥并称重，测量干物质中氮的量和浓度。NF施用后的草的生物量更高。在每公顷100升NF的情况下，生物量增加了27％(图8)，其包含36％更多的氮，并且干物质中显示7％更高的氮浓度。

综上所述，NF可以改善草地的生长，增加草地干物质的氮含量。

实施例8：常规农业中硝化生物肥料溶液对作物产量的积极作用

在常规耕作条件下，在沙质土壤中测试硝化生物肥料溶液(NF)对作物产量的作用，并用化肥修正。

作物品种是番茄(Solanum lycopersicum)，莴苣(Lactuca Sativa)，法国豆(Phaseolus vulgaris)，花椰菜(Brassica olearacea变体botrytis)，芹菜(Apium graveolens变体rapaceum)，胡萝卜(Daucus carota亚种sativus)和甜菜(Beta vulgaris亚种vulgaris变体altissim)。将豆，胡萝卜和甜菜种子以及幼年番茄，莴苣，花椰菜和芹菜种植在沙质土壤盆中，所述沙质土壤与三种类型的肥料、NPK(Triferto NPK 12-10-18)，硝酸钙铵(CAN-27)或尿素-46混合，其量相当于推荐的氮剂量的一半。

如实施例2所述制备NF。以每株植物的下列量施用NF：4、10和20ml(番茄，8个重复)，1、3和10ml(莴苣，10个重复)，0.03和3.3ml(豆，50个重复)，0.25和10ml(花椰菜，10个重复)，0.2、2和10ml(芹菜，10个重复)，0.12ml(胡萝卜，50个重复)和1.25和3.75ml(甜菜，50个重复)。或者，用100、300和1000升/公顷(莴苣，10个重复)，30和100升/公顷(豆，50个重复)，30和400升/公顷(花椰菜，10个重复)，300升/公顷(胡萝卜，50个重复)，10升/公顷(芹菜，10个重复)和100升/公顷(甜菜，50个重复)喷洒作物。植物在荷兰的温室中生长，并在需要时浇水以保持适度的潮湿条件。收获时，测定地上鲜重或干重，并计算与对照相比的相对产量。

与化肥结合的NF施用导致番茄，莴苣，豆，菜花，胡萝卜，芹菜和甜菜的产量显著提高。产量增加最高达33％(图9)。在土壤中、种子上或喷洒在土壤表面上观察到积极效果。

总之，在常规农业条件下，NF可以增加产量。NF可以作为土壤或种子处理使用，也可以在种植后喷洒。

实施例9：硝化生物肥料与堆肥茶的组合对作物产量的作用

测定了堆肥茶和硝化生物肥料溶液(NF)的互补效应。

如实施例5所述制备与有机肥料混合的盆栽土壤的盆，并种植甜椒，皱叶甘蓝，法国豆，小麦，花椰菜，菊花或莴苣。如实施例2中所述制备NF，Fytaforce堆肥茶(FF)获自Soiltech公司(Fytaforce^TM植物；比兹莫特，荷兰)。以总盆体积的百分比施用NF，具有或不具有0.2％FF。植物在荷兰的温室中生长，并在需要时浇水以保持适度的潮湿条件。收获时，测定地上重量，并计算与对照相比的相对产量。

用NF处理导致产量增加。NF和FF的组合施用进一步提高了所有作物的产量(图10)。另外，对于莴苣来说，组合施用的产量也高于单独的FF。

总之，NF和堆肥茶的组合施用导致比单独的NF或堆肥茶更高的产量。

实施例10：硝化生物肥料，固氮生物肥料和堆肥茶对莴笋产量的作用

测定了三种生物肥料、硝化生物肥料溶液(NF)、固氮菌(N-固定)和堆肥茶(Fytaforce，FF)对莴苣产量的互补效应。

将幼年莴苣植物(Salanova Cook)种植在2升盆中，其含有与鸟粪混合的标准盆栽土壤(150g磷酸盐/kg)和碳酸钾(566g钾/kg)。如实施例2中所述制备NF，Fytaforce堆肥茶(FF)获自Soiltech公司(Fytaforce^TM植物；比兹莫特，荷兰)。氮固定剂拜叶林克氏固氮菌(Beijerinckia derxii)DSMZ2328以每毫升10⁹个细菌的密度作为N-固定生物肥料使用。在种植后1.5和2.5周，将三种生物肥料单独和以所有可能的组合施用于土壤，每种处理重复6次。NF和FF的剂量为总盆体积的0.2％，N-固定为0.08％。2015年5月20日至6月25日，植物在荷兰的未升温的温室种植。植物在需要时浇水，以保持适度的潮湿条件。收获时，测定地上鲜重，并计算与对照相比的相对产量。

NF施用导致莴苣产量增加17％，而单独的N-固定剂导致生物质减少。NF与N-固定剂组合的产量比单独的N-固定剂高46％，比对照高29％。NF，N-固定剂和堆肥茶的组合获得更高的产量。与对照相比，这种三重应用导致产量增加45％(图11)。

总之，三种生物肥料NF，N-固定剂和堆肥茶的组合施用比单独或双重组合的生物肥料的产量高。

实施例11：硝化生物肥料溶液对莴苣发育时间的作用

莴苣在具有三种有机肥料的标准盆栽土壤中培养。加入两种生物肥料溶液、硝化生物肥料溶液(NF)和堆肥茶叶(Fytaforce，FF)后，随时间跟踪莴苣植物生长。

将幼年莴苣植物(Salanova Cook)种植在含有标准盆栽土壤的2升盆中，所述土壤与DCM ECO混合物1(4克/盆)，苜蓿(EKO苜蓿颗粒，12克/盆)或鸡粪肥(Fertisol鸡粪肥颗粒，9克/盆)混合。如实施例2中所述制备NF，Fytaforce堆肥茶(FF)获自Soiltech公司(Fytaforce^TM植物；比兹莫特，荷兰)。在种植时和两周后，以总盆体积的百分比按照下述组合施加生物肥料：(1)采用水的对照，(2)0.5％NF，(3)1％NF，(4)2％NF和(5)1％NF+0.2％FF，每个处理重复6次。植物在荷兰的温室中从2015年5月至6月生长6周。植物在需要时浇水，以保持适度的潮湿条件。在21、27、33和45天后收获，将地上作物烘干并称重。

对于DCM ECO混合物和鸡粪肥，1％NF+0.2％FF的处理产生最高的产量(图12)。在不到3/4的栽培时间内可以达到相似的产量。三周后，用DCM ECO混合物和1％NF+0.2％FF的莴苣达到的产量是未接受生物肥料的植物的产量的两倍。与没有生物肥料的对照相比，使用苜蓿肥料的莴苣产量比使用2％NF的高约1.5倍(图12)。

综上所述，NF和堆肥茶的组合施用可使栽培时间缩短25％以上。