新的血管生长素衍生蛋白及其编码序列的制作方法

专利名称：新的血管生长素衍生蛋白及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的血管生长素衍生蛋白，这种新的血管生长素衍生蛋白具有Asp116His突变。本发明还公开了一种新的化学合成的、用细菌偏爱密码子编码的血管生长素衍生蛋白的基因序列和经重组技术产生这种多肽的方法。
1985年，美国学者Fett JW等从体外培养的人结肠腺癌细胞系HT-29中提取获得一种具有很强的促血管生长活性的蛋白质，分子量约14.1kD，命名为血管生长素(angiogenin，简称为“ANG”)。
现已明确，ANG是由123个氨基酸残基组成的单链蛋白分子，具有强烈促血管生长活性，等电点大于9.5，属于核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)超家族。除了促血管生长活性，ANG还具有特异性水解核糖核酸(ribonuclic acid，RNA)等多种生物活性。研究表明，ANG主要的作用是促进机体小血管生长，在已知的促血管生长因子中，ANG的促血管生长活性强于大多数其他因子。在鸡胚绒毛尿囊膜血管生长(CAM)试验中，35 fmol的ANG即可引起典型的轮辐样血管生长图案，而3.5pmol的ANG即可使兔角膜出现新生血管。人们因而推论，阻断或利用其促血管生长作用可能为遏止实体肿瘤的生长或治疗各种缺血性疾病提供新途径。因此，ANG受到众多研究者的广泛关注，与其相关的基础和应用研究大量开展，并已逐步阐明ANG及其衍生物的结构、功能特点、作用机制等基本问题，同时展示了良好的应用前景。
长期以来，ANG受体及其作用机制等一直是制约ANG研究深入的难题，在很大程度上迟滞了其应用研究的进展。近两年来，这些问题已逐步被认识。大量研究证明，肌动蛋白作为ANG受体之一，与ANG能高亲和性地结合，介导着血管生长过程中的许多重要作用。
近来，在人内皮细胞表面又发现了一种分子量170kD的ANG受体。该受体仅在内皮细胞分布稀疏、不连续的情况下表达并与ANG特异性地结合，引发与剂量相关的DNA合成和细胞增殖反应。虽然目前对该受体的研究资料尚少，但其介导的细胞增殖反应已引起许多学者的兴趣，并推测它在ANG的促血管生长过程中起着关键性的作用。ANG与其受体结合后，可通过两种途径进一步作用第二信使介导的信息传导以及受体介导的胞饮内吞和向细胞核的转运。
鉴于血管生长素的上述特点，如果能大量表达血管生长素蛋白，将对有关疾病的诊断和治疗起到积极的推动作用。然而，人体正常组织中血管生长素含量较低，提纯难度极大，成本很高，无法用于规模化生产。而从肿瘤组织中提取则存在较大的风险。因此，国外开展了大量的血管生长素基因工程方面的研究工作。结果表明，大肠杆菌原核表达ANG蛋白含量较高，占总蛋白含量的5-10％；真核表达成本较高，得率极低。且原核表达所得的ANG蛋白与真核表达的蛋白在促进血管生长方面的活性基本一致。
然而，即使是5-10％的表达量，对于规模化工业生产来说仍是不理想的。因此，本领域迫切需要活性更高的血管生长素衍生蛋白。此外，本发明还迫切需要能够高表达地生产血管生长素衍生蛋白的方法。
本发明的目的是提供一种新的血管生长素衍生蛋白，它具有高于天然血管生长素的促血管生长的活性。
本发明的另一目的是提供编码这种血管生长素衍生蛋白的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的血管生长素衍生蛋白，与天然的血管生长素相比，它包含Asp116His突变。较佳地，该蛋白是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码具有SEQID NO2所示氨基酸序列的多肽。较佳地，该多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种血管生长素衍生蛋白的制备方法，该方法包含(a)在适合表达血管生长素衍生蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出血管生长素衍生蛋白。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的权利要求1所述的血管生长素衍生蛋白以及药学上可接受的载体。较佳地，该蛋白是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。


图1是化学合成血管生长素衍生蛋白编码序列并用PCR扩增后的电泳图。泳道A为扩增产物，泳道Marker为分子量标记物。
图2是本发明血管生长素衍生蛋白编码序列的测序结果。
图3是本发明血管生长素衍生蛋白表达后的SDS-PAGE图片。图中，箭头所指的为表达的血管生长素衍生蛋白。从左至右为泳道1-10分别是42℃诱导培养4、4.5、4.5、5、5、3.5、4、3、8、12小时的蛋白表达情况。
图4是本发明血管生长素衍生蛋白经纯化后的SDS-PAGE图片。图中，箭头所指的为表达的血管生长素衍生蛋白。从左至右为泳道1-10分别是1-3泳道为Q-Sepharose Fast Flow阴离子柱纯化结果；4-6泳道为SP Sepharose Fast Flow阳离子柱纯化结果；7、8泳道为Sephacryl S-100分子筛纯化结果。
图5是本发明血管生长素衍生蛋白的鸡胚绒毛尿囊膜试验照片。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的血管生长素衍生蛋白或多肽”是指血管生长素衍生蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化血管生长素衍生蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。通常，血管生长素衍生蛋白的纯度大于50％，较佳地，大于60％，更佳地大于70％，最佳地大于80％或更高。本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
如本文所用，“Asp116His”或“D116H”指对应于天然血管生长素第116位的Asp被替换为His。
本发明的血管生长素衍生蛋白的特征在于具有Asp116His突变。然而，除了进行上述的氨基酸替换之外，本领域的技术人员知道，还可对其他位置的氨基酸进行修饰，如取代、插入或缺失。对于取代，可用性质相近的氨基酸加以取代。较佳地，这种氨基酸取代是在下表1中同一组别(代表性的取代)中进行，最佳地这种取代是下表1中优选的取代。
表1
对DNA进行遗传修饰的技术总结于诱变一种实用方法(MutagenesisaPractical Approach)，M.J.McPherson，Ed.，(IRL Press，Oxford，UK.(1991)，例如包括定点诱变、盒式诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。该文献在此引用作为参考。
可以通过PCR法等方法，获得天然的和/或重组的ANG核苷酸序列，然后用各种本领域中熟知的诱变方法进行本发明所述的突变。本发明的一种ANG突变体的DNA序列在SEQ ID NO2中列出。但是由于遗传密码的简并性，所以可以制备许多种核苷酸，它们都是能够指导合成本发明的重组ANG。因此，功能上与上述序列等价的DNA序列，或者功能上与指导合成本发明重组ANG蛋白质类似物(按照氨基酸序列产生的)的序列相等价的序列，都被包括在本发明之内。
对于本发明的编码新型重组ANG的核酸，通过限制性酶切，然后与质粒片段连接，可以被克隆入合适的载体如质粒中。对于选用的质粒，没有特别的限制，只要它能在选用的宿主细胞中复制和表达重组的ANG。
当然，该重组蛋白的编码序列也可整合如宿主细胞的基因组中。
含有编码新型重组ANG的核酸的质粒，一般含有合适的启动子、增强子等调控元件，以及合适的选择基因(如抗生素抗性基因，比如氨苄青霉素抗性基因；或营养缺陷型基因)，这些都是本领域中熟知的。可参见Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
携带本发明的重组ANG编码序列的表达载体，可用本领域熟知的方法，如电穿孔、共转染法等，转入合适的宿主细胞。宿主细胞可以是原核生物或真核生物，如大肠杆菌、枯草杆菌、昆虫细胞、CHO细胞等。但是较佳地是大肠杆菌。
在转化之后，用常规方法筛选出转化子。并根据所用的宿主细胞和表达载体，用本领域常规使用的培养基和培养条件来培养转化的细胞，从而表达重组的ANG。
在转化的宿主细胞表达本发明的重组ANG之后，如果重组蛋白被分泌入培养基中，可以直接从培养基中分离纯化出重组蛋白。如果重组蛋白是以包涵体形式被表达，那么可从培养物中，通过裂解细胞、分离、提纯等步骤获得所需的重组蛋白。这些步骤和方法都是本领域中熟知的，可参见例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的血管生长素衍生蛋白多肽(Science，1984；2241431)。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码血管生长素衍生蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，血管生长素衍生蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含血管生长素衍生蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的血管生长素衍生蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗血管梗塞性疾病，促进创面愈合等。经大规模生产的血管生长素衍生物可用于消除褐斑、雀斑及皮肤增白或其他化妆品生产。本发明的拮抗性衍生物或可用于对肿瘤组织的治疗。
本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的本发明的血管生长素衍生蛋白或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。血管生长素衍生蛋白以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的血管生长素衍生蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。通常，血管生长素衍生蛋白的用量为1微克-5毫克/千克体重/天，较佳地，为5微克-2.5毫克/千克体重/天，更佳地为10微克-1毫克/千克体重/天。
在本发明的一个实例中，为了提高血管生长素衍生蛋白在细菌中的表达量，编码血管生长素衍生蛋白的多核苷酸是用化学合成的方法获取的，采用的是细菌偏爱的密码子。它包含的多核苷酸序列全长为378个碱基(SEQ ID NO1)，其开放读框编码了包括Met在内的124个氨基酸(SEQ ID NO2)。其氨基酸序列与已发表的人血管生长素蛋白相比，除第116位氨基酸由Asp替换为His外，其余完全一致。经促鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生长最低有效剂量实验证明，其促血管生长作用较血管生长素本身提高了30倍。
此外，通过对复性方法的改进，采用先纯化，后复性的方法，不但数十倍地提高了蛋白的复性回收率，而且，所得蛋白的活性较原来的单纯复性法比活高。这对大规模生产降低生产成本是十分有益的。
此外，通过对复性方法的改进，采用透析与稀释相结合及复性前蛋白溶液中加入高浓度甘油的复性方法，不但数十倍地提高了蛋白的复性回收率，而且，蛋白活性得到较好的保护，达到国外同类研究先进水平。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1寡聚核苷酸片段的化学合成全长378bp的血管生长素衍生物基因分成如下20个28-46mers的寡聚核苷酸片段，见附件，采用固相亚磷酸胺法在ABI381A型DNA合成仪上分别合成。
F15′-GGGGTACCGTTAACTAAGGAAATACGAATTCATGCAGGACAACTCT-3′F25′-CCCCATGGCAATTGATTCCTTTATGCTTAAGTAC-3′F35′-CGTTACACCCACTTCCTGACCCAGCACTACGACGCTAAACCGCA-3′F45′-GTCCTGTTGAGAGCAATGTGGGTGAAGGACTGGGTCGTGATGCT-3′F55′-GGGTCGTGACGACCGTTACTGCGAATCTATCATGCGTCGTCGT-3′
F65′-GCGATTTGGCGTCCCA GCACTGCTGGCAATGACGCTTAGATAG-3′F75′-GGTCTGACCTCTCCTTGCAAAGACATCAACACCTTCATCCA-3′F85′-TACGCAGCAGCACCAGACTGGAGAGGAACGTTTCTGTAGTTG-3′F95′-CGGCAACAAACGTTCTATCAAAGCTATCTGCGAGAACAAGAAC-3′F105′-TGGAAGTAGGTGCCGTTGTTTGCAAGA TAGTTTCGATAGACGC-3′F115′-GGTAACCCGCACCGTGAAAACCTGCGTATCTCTAAATCTTCTTT-3′F125′-TCTTGTTCTTGCCATTGGGCGTGGCACTTTTGGACGCATAGAGAT-3′F135′-CCAGGTTACCACCTGCAAACTGCACGGTGGTTCTCCGTGGCCGCC-3′F145′-TTAGAAGAAAGGTCCAATGGTGGACGTTTGACGAGCCACCAAGAGGCACCGGCGG-3′F155′-GTGCCAGTACCGTGCTACCGCTGGTTTCCGTAACGTTGTTGTT-3′F165′-C ACGGTCATGGCACGATGGCGACCAAAGGCATTGCAACAACAA-3′F175′-GCTTGCGAAAACGGTCTGCCGGTTCACCTGGACCAGTCTATCTTC-3′F185′-CGAACGCTTTTGCCAGACGGCCAAGTGGACCTGGTCAGATAGAA-3′F195′-CGTCGTCCGTGATAAGTTAACGGATCCAG-3′F205′-GGCAGCAGGCACTATTCAATTGCCTAGGTC-3′然后，将挂有合成好DNA的片段的固相载体倒入一小瓶中，加入浓氨水至2/3体积，密封后于55℃氨解过夜以去除保护基团。次日，启封小瓶赶去氨气后，将溶液真空干燥。重溶于饱和尿素后，上12％聚丙烯酰胺变性制备凝胶电泳，经600V恒压，6-8小时电泳后，取下凝胶，以荧光板为衬托，在长波紫外光下切下迁移最慢的含DNA片段的凝胶条带，切碎后加4-5ml0.5mol/L NaCl，37℃温育过夜。
次日，再将此DNA溶液过C-18反相柱以进一步纯化DNA。方法是先分别用100％和60％甲醇清洗C-18柱，再用纯水将柱洗净，然后将DNA溶液过柱，此时DNA被挂在C-18柱上，用纯水反复冲洗柱以洗出杂质，最后用2ml60％甲醇洗下DNA，紫外检测并定量后，分装并真空干燥，-20℃保存备用。所有DNA片段制备好以后，进行片段的纯度检测。
实施例2基因的拼接和PCR扩增除F1、F20两个片段外，全部片段各取0.2OD，混合后在含10mM ATP，20uKinase的激酶反应体系中37℃反应90min进行5′-端磷酰化。100℃1min灭活Kinase后，加入两个5′-端片段，并加NaCl至终浓度为0.1M，然后将溶液在95℃放置3min以使DNA变性，缓慢退火至25℃后，再置65℃ 3min，第二次缓慢退火至20℃，以使DNA正确复性。然后，用乙醇沉淀DNA，真空干燥后重溶DNA于30微升连接酶反应体系，加入80u连接酶，于16℃连接过夜。连接效果用5％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
虽然，在连接后获得了所需的编码序列，但是由于该方法所得的完整基因量较少，故以上述连接液为模板，根据全长基因的上、下游序列设计并合成如下相应引物Pp15′-ACGAATTCATGCAGGACAACTCTCGTTACACC-3′；Pm15′-CTGGATCCGTTAACTTATCACGGACGACGGAAGATAG-3′；用PCR方法，扩增全长基因。PCR反应条件是，94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环。
PCR反应产物的电泳图见图1。
然后将分离的PCR扩增片段经EcoRI、BamHI酶切后插入质粒载体pUC118并感染细菌，获取D116H-ANG-pUC118重组质粒，筛选单克隆菌株后测序鉴定(图2)，结果表明血管生长素衍生蛋白的编码序列是正确的(SEQ ID NO1)。
实施例3重组血管生长素衍生物的体外表达，分离和纯化分别在血管生长素衍生物基因的起始密码子处及终止密码子处设计了一对引物，其5′端带有KpnI酶切位点，3′端带有BamHI酶切位点，同时为提高表达效率，在ATG上游设计一段SD序列。
Pp25′-GGTACGTTAACTAAGGAAATACGAA TTCATGCAGGACAAC-3′；Pm25′-CTGGATCCGTTAACTTATCACGGACGACGGAAGATAG-3′；以D116H-ANG-pUC118为模板进行PCR扩增获得D116H-ANG基因编码区。将扩增片段经过酶切插入表达载体pBV220(购自Pharmacia Biotech)，并转化E.coliJM103，在含氨苄青霉素和X-gal及IPTG的LB平板上，筛选白色的重组转化子进行DNA序列分析，结果与D116H-ANG-pUC118中的基因编码区序列完全相同。所得重组克隆能表达D116H-ANG蛋白。
将上述构建成功的pBV220/ANG-D116H/JM103工程菌单菌落取至含氨苄青霉素100mg/ml的3ml LB培养液中，30℃恒温摇床振荡培养过夜，转速为250rpm。次日，接此过夜菌0.5ml于50ml新鲜LB+Amp培养液中，30℃培养至菌液浓度达OD590值约为0.8时，迅速将摇床升温至42℃继续培养，每半小时采样1ml菌液，诱导5小时后收菌。将所收集的菌液以5000rpm离心，菌液沉淀后加入60微升水重悬菌体，加入60微升2×SDS蛋白上样缓冲液，煮沸15分钟后作短暂离心。然后，取上清上样于15％SDS-PAGE，30mA恒流电泳4小时后，常温下考马斯亮兰G-250染色3小时，再用凝胶脱色液脱色3小时后，即可观察蛋白条带。SDS-PAGE电泳显示在约14.4kDa处有血管生长素衍生物蛋白产物，约在第5小时蛋白表达量最高(泳道3)，表达蛋白约占细菌总蛋白的30％。(见图3)。
表达产物依次经Q-Sepharose Fast Flow阴离子层析交换柱、SP Sepharose FastFlow阳离子层析交换柱及Sephacryl S-100分子筛层析柱纯化。洗脱液经SDS-PAGE电泳显示，绝大多数杂蛋白得到了有效的清除(见图4)。
实施例4蛋白复性采用透析与稀释结合的方法去除尿素，恢复ANG蛋白天然构象。具体方法为将纯化后的D116H-ANG蛋白浓度调整到不高于10mg/ml，加入等体积的无菌甘油，轻柔地使二者1∶1混合均匀，移入截留分子量6000-8000的透析袋中，在4℃冰箱中，对100倍体积的蛋白复性透析液缓慢透析24小时，透析体系开口于空气中。次日，在4℃下对10-15倍体积的蛋白复性稀释液缓慢透析24小时，透析体系开口于空气中。透析完毕，以Amicon-Stir Cell超滤器将其浓缩至需要的体积。
蛋白复性透析液以50mmol/LTris-HCl(pH8.5)，100mmol/L NaCl溶液和无菌甘油作1∶3混溶。
蛋白复性稀释液50mmol/LTris-HCl(pH8.5)，100mmol/L NaCl上述方法简便易行，与以往国外报道的单纯的透析法或稀释法相比，有效地减少了复性过程中絮状沉淀物的产生，数十倍地提高了蛋白的复性回收得率。本发明方法的复性回收率为75～85％。
此外，由于采取将复性前的蛋白溶液与甘油以1∶1比例混合，再对高浓度甘油进行透析，蛋白沉淀几乎观察不到。甘油是保存蛋白质常用的保护剂，有利于维护蛋白分子的疏水性，具有保护蛋白质活性的能力。同时，高浓度甘油溶液能显著减慢蛋白分子的运动速度，有利于分子内二硫键的形成。因此，在提高得率的同时，减少了在此过程中蛋白活性的丧失，进一步有效地提高了蛋白的比活。正如下面的鸡胚绒毛尿囊膜试验所示中，ANG最低阳性有效量为1ng/枚，D116H-ANG最低阳性有效量为0.03ng/枚。较国外同类研究相比处于明显的领先地位。
实施例5D116H-ANG与ANG促血管生长活性比较目前，国外检测ANG促血管生长活性所采用的方法是鸡胚绒毛尿囊膜试验。即将含有不同浓度ANG的甲基纤维素膜置于鸡胚的绒毛尿囊膜，以观察血管生长情况的改变。
如上所述，本发明人采用透析与稀释相结合的方法进行蛋白复性。该方法在提高蛋白复性回收率的同时，蛋白活性也有所提高，所得天然ANG比活与国外报道一致，最低阳性有效量为1.0ng/枚。条件更温和，有利于对蛋白活性的保护，所得ANG促血管生长活性较高，鸡胚绒毛尿囊膜试验最低阳性有效量为1.0ng/枚，达到国外同类研究先进水平。
而用相同的复性方法所得到的本发明的D116H-ANG，其最低阳性有效量达到0.03ng/枚(见图5)。蛋白定量均采用质谱仪检测。这表明，经基因改造表达所得的血管生长素衍生物D116H-ANG在促进血管生长方面的活性较ANG本身有很大的提高，两者的活性比约为30。
实施例6兔子急性心梗模型试验以5/0涤纶线在左心耳下缘水平缝扎冠状动脉左前降支(LAD)2道，观察左室心肌颜色及运动的变化，描记心电图。当左室心肌呈充血暗红色，前壁运动减弱，心电图出现ST段明显弓背抬高或压低，即认为模型建立成功。沿左室心肌变色区边缘部、冠状动脉左前降支与左室支供血区交界处，纵行取上、中、下3点心肌内注射溶于PBS缓冲液的D116H-ANG溶液50μl/点，含D116H-ANG 5μg。8天后取心脏行病理检测，高倍镜下见心肌细胞无明显颗粒样变性，小血管呈簇状，心肌纤维间偶见内皮细胞条索样走行，毛细血管计数较对照组明显增多。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(ii)发明名称新的血管生长素衍生蛋白及其编码序列(iii)序列数目2(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度378bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11 ATG CAG GAC AAC TCT CGT TAC ACC CAC TTC CTG ACC CAG CAC TAC GAC GCT AAA CCG CAG61 GGT CGT GAC GAC CGT TAC TGC GAA TCT ATC ATG CGT CGT CGT GGT CTG ACC TCT CCT TGC121 AAA GAC ATC AAC ACC TTC ATC CAC GGC AAC AAA CGT TCT ATC AAA GCT ATC TGC GAG AAC181 AAG AAC GGT AAC CCG CAC CGT GAA AAC CTG CGT ATC TCT AAA TCT TCT TTC CAG GTT ACC241 ACC TGC AAA CTG CAC GGT GGT TCT CCG TGG CCG CCG TGC CAG TAC CGT GCT ACC GCT GGT301 TTC CGT AAC GTT GTT GTT GCT TGC GAA AAC GGT CTG CCG GTT CAC CTG GAC CAG TCT ATC361 TTC CGT CGT CCG TGA TAA(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度124个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO21 Met Gln Asp Asn Ser Arg Tyr Thr His Phe Leu Thr Gln His Tyr16 Asp Ala Lys Pro Gln Gly Arg Asp Asp Arg Tyr Cys Glu Ser Ile31 Met Arg Arg Arg Gly Leu Thr Ser Pro Cys Lys Asp Ile Asn Thr46 Phe Ile His Gly Asn Lys Arg Ser Ile Lys Ala Ile Cys Glu Asn61 Lys Asn Gly Asn Pro His Arg Glu Asn Leu Arg Ile Ser Lys Ser76 Ser Phe Gln Val Thr Thr Cys Lys Leu His Gly Gly Ser Pro Trp91 Pro Pro Cys Gln Tyr Arg Ala Thr Ala Gly Phe Arg Asn Val Val106 Val Ala Cys Glu Asn Gly Leu Pro Val His Leu His Gln Ser Ile121 Phe Arg Arg Pro
权利要求
1.一种分离的血管生长素衍生蛋白，其特征在于，它包含Asp116His突变。
2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，该蛋白是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的序列。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞(a)用权利要求5所述的载体转化或转导的宿主细胞；(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
7.一种血管生长素衍生蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达血管生长素衍生蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出血管生长素衍生蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该方法还包括如下复性步骤将分离的血管生长素衍生蛋白浓度调整到不高于10mg/ml，加入等体积的无菌甘油，混合均匀，移入截留分子量6000-8000的透析袋中，在4℃对100倍体积的蛋白复性透析液缓慢透析24小时，再在4℃下对10-15倍体积的蛋白复性稀释液缓慢透析24小时，然后浓缩，其中蛋白复性透析液是50mmol/LTris-HCl，pH8.5，100mmol/LNaCl溶液和无菌甘油的1∶3混合液，而蛋白复性稀释液含50mmol/LTris-HCl，pH8.5，100mmol/L NaCl。
9.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的血管生长素衍生蛋白以及药学上可接受的载体。
10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，该蛋白是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
全文摘要
本发明公开了一种新的血管生长素衍生蛋白,这种新的血管生长素衍生蛋白具有Asp116His突变,经实验证明其促血管生长作用提供了约30倍。本发明还公开了编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生这种多肽的方法。用于采用细菌偏好的密码子,所以使蛋白的表达量大幅提高。
文档编号C07H21/00GK1277208SQ00115679
公开日2000年12月20日 申请日期2000年5月15日 优先权日2000年5月15日
发明者毛裕民, 谢毅, 黄盛东 申请人:上海博容基因开发有限公司