专利名称：光活(一)黄皮酰胺制备方法
技术领域：
本发明涉及一种光活黄皮酰胺制备方法以及光活黄皮酰胺用于治疗老年痴呆的潜在性药物用途。
目前我国人口的平均寿命已超过70岁，比解放时的人均寿命增加了一倍。国外一项科学研究预测到2025年时，15岁以下儿童的比例将占总人口的18.6％，而65岁及65岁以上的老年人将超过童数，达到18.8％，这个数字表明，再过20余年，每5个人中就有1个老年人。早老性痴呆症(Alzheimer’s Disease)多发生在50余岁。因脑血管病变引发的多发性栓塞性痴呆或老年性痴呆多发生在60岁以后。可见，由于人口的老龄化，早老性痴呆症和老年性痴呆症的发病率也必将增加。老年人及其特有的神经退化性疾病——各种痴呆症要经历两种死亡，首先是精神上的死亡，后是肉体上的死亡，苦不堪言，更给社会和家庭带来沉重负担。人口老龄化被认为是仅次于战争，瘟疫，饥荒，资源能源短缺而影响社会发展和安定的不利因素。
防治衰老和治疗老年痴呆的药物种类繁多，如脑血管扩张药，通过改善脑血流量有助于提供能量和改善智能，但真正有价值的脑血管扩张药必须具有高度选择性，不影响脑代谢，无“窃血”现象，有抗血小板聚集和抗血栓作用。钙拮抗剂尼莫地平虽符合上述某些条件，但它仅作用于电压依赖性钙通道中的L通道，对N型和T型钙通道无影响。增强胆碱系统功能的药物中，Ach前体仅有微弱的治疗作用，Ach受体激动剂和胆碱脂酶抑制剂虽有一定效果，但作用较短暂，毒副作用较大。多种神经肽和神经生长因子曾被认为有治疗痴呆症的希望，但临床效果不佳，可能主要归因于这类物质难以通过血脑屏障进入脑内发挥作用，2吡咯烷酮乙酰胺(piracetam国内已生产，商品名脑复康)问世后，在早期文献中属没有争论的一类新型促智药(nootropil，该词是从希腊词noo(脑)和tropein(向)衍化而来)，近几年来国内外报道，该药对各类型的记忆障碍和老年痴呆作用轻微或尚无定论，一个主要原因是该药为水溶性化合物，通过血脑屏障率低，不易集中到靶点发挥作用。
本申请人从芸香科植物黄皮[Clausena Lansium(lour.)Skells]中第一次分离出含有脑复康药的γ内酰胺骨架的化合物，称之为黄皮酰胺(Clausenamide)。黄皮酰胺是具有四个手性中心的γ内酰胺，天然品为消旋体，消旋黄皮酰胺的合成方法曾申请欧洲专利，其申请号为EP0414020。中国专利申请86107090，90107145.5和90107144.7。
现有技术中，消旋(±)黄皮酰胺的制备路线和方法如下 但是，这种方法不能直接用于制备本发明所述的具有光学活性的黄皮酰胺或其衍生物。
为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种光学活性黄皮酰胺或其衍生物；本发明的另一目的目的在于提供一种光学活性黄皮酰胺的制备方法；本发明的另一目的在于提供一种该光学活性化合物(-)黄皮酰胺在制备促智，抗衰老作用药物的应用。
现对(-)、(+)黄皮酰胺的制备方法，促智，抗衰老作用及其可能的作用机制报道于后。本发明所述的化合物具有如下通式(I)所示的结构，其绝对构型为(3S，4R，5R，6S)，具有左旋光性，其中R1及R2可以是H、卤素、C1-6的烷基、 烷氧基、次甲二氧基、硝基；也可以是多取代；R1和R2可以相同，也可以不同。R1，R2＝H时，为(-)黄皮酰胺，另外，本发明也包括制备过程中的产生的光活中间体。
本文中*表示为光活物质。
本发明还涉及一种制备具有如通式I所示的光活化合物的方法，它是一种不对称从头(de novo)合成法，该本合成法采用分子内诱导不对称Darzen’s反应，以光活R*为配体。它包括以下步骤(1)以氯乙酰氯与手性醇R*OH形成手性醇的氯乙酸酯(1)*；所述的手性醇包括(+)薄荷醇、(+)8苯基薄荷醇或者(+)8β萘基薄荷醇。
(2)得到的手性醇的氯乙酸酯与苯甲醛或R1取代的苯甲醛反应，获得相应光活的芳基缩甘油酸手性醇酯(2a)*、(2b)*；(3)经酯交换得(+)-(2S，3R)-3-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*，(4)得到的+)-(2S，3R)-3-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*与相应的胺缩合得(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-(β-羟基-苯乙基)-3-苯基缩水甘油酰胺(3)*，再经氧化得(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-苯甲酰甲基-3-苯基缩水甘油酰胺(4)*；(5)所述的(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-苯甲酰甲基-3-苯基缩水甘油酰胺(4)*在碱性条件下环合得光活(-)黄皮酰胺酮(5)*所述的碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、二异丙胺基锂，丁基锂，四烷基氢氧化胺及三烷基胺。
环合时使用的溶剂为水、甲醇、乙醇等低烷基醇或它们的混合物，如甲醇和水等。
(6)光活黄皮酰胺酮(5)*经硼氢化钠还原可得光活黄皮酰胺或其衍生物。
应当指出的是在上述的方法中，所述的手性醇包括(+)薄荷醇、(+)8苯基薄荷醇或者(+)8β萘基薄荷醇。环合步骤所用的碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、二异丙胺基锂，丁基锂，四烷基氢氧化胺及三烷基胺。环合时使用的溶剂为水、甲醇、乙醇等低烷基醇或它们的混合物。
本发明的光活黄皮酰胺或其衍生物还可以经另一步骤制得。换言之，本发明的光活的黄皮酰胺及其衍生物可通过中间体拆分法获得。
1.化学拆分方法在本发明的方法中，可以利用消旋黄皮酰胺酮化合物(5)的C3位的羟基与拆分剂手性酸成酯，然后经重结晶或层析分离所得一对差向异构体。
该拆分剂手性酸包括L孟氧乙酸，樟脑磺酸、(-)S邻苯二甲酰丙氨酸或者N-对甲苯磺酰脯氨酸，优选的是(-)S邻苯二甲酰丙氨酸。
该方法包括以下步骤利用中间体消旋黄皮酰胺酮化合物(5)的C3位的羟基与手性酸成酯，然后经重结晶或层析分离得一对差向异构体。
具体地讲，是将(-)-S-邻苯二甲酰丙氨酸，在SOCl2的存在下，在甲苯中与消旋黄皮酰胺酮反应，得到(-)-(3S，4R，5R)-5-苯甲酰基-1-甲基-4-苯基-3-[(S)-α-(邻苯二甲酰亚胺基)丙酰氧基]吡咯烷-2-酮和(+)-(3S，4R，5R)-5-苯甲酰基-1-甲基-4-苯基-3-[(S)-α-(邻苯二甲酰亚胺基)丙酰氧基]吡咯烷-2-酮。经重结晶得旋光为(-)的差向异构体，后者在NaBH4和NaOH的存在下水解，经减压浓缩，重结晶得到本发明的(-)黄皮酰胺。
另外，将消旋黄皮酰胺酮投入(-)孟氧乙酰氯的CH2Cl2溶液中，室温反应，反应物经重结晶，得(-)-(3S，4R，5R)-5-苯甲酰基-3-孟氧乙酰氧基-1-甲基-4苯基吡咯烷-2-酮。后者以对甲苯磺酸水解，得光活(-)黄皮酰胺酮，然后，按照上述步骤(b)经NaBH4还原，制得(-)黄皮酰胺。
2酶拆分方法可以利用酶对对映异构体的不同反应速度，可以将消旋的3-苯基缩水甘油酸甲酯经酶拆分的方法制得(+)-(2S，3R)-3-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*，其中，采用具有产生水解酶能力的选自真菌，细菌，酵母，和放线菌的微生物在培养基中，pH为5-8，温度为10-50℃，优选为20～40℃下有氧发酵，所产生的菌丝对化合物(+)β-苯基缩水甘油酸甲酯进行立体选择性水解反应，其水解反应的pH值介于5～10之间，温度为10-50℃，分离萃取得到光活性黄皮酰胺。
在本发明之酶拆分方法中使用的，具有产生水解酶的能力的微生物可以是真菌，细菌，酵母，和放线菌。这些细菌包括如无色杆菌(Achromobacter，sp)，产碱杆菌(Alcaligenes，sp)，节杆菌(Archrobacter，sp)，芽孢杆菌(Bacillus sp)，短杆菌(Breubacillus，sp)，棒杆菌(Corynebacterium，sp)，欧文氏菌(Erwinia sp)，假单孢菌(Pseudomonas sp)属，酵母的假丝酵母(Candidasp)和毕赤(Pichiasp)，红酵母(Rhadatorula sp)，汉荪酵母(Hansenula sp)属，真菌中的曲霉(Aspergillus)，毛霉(Mucor sp)，米曲霉(Aspergillus，sp)，青霉(Penicillium)，根霉(Rhizopus sp)以及放线菌中的诺卡氏(Nocardia sp)，链霉菌(Streptomycessp)等菌株均有这种产酶能力。这些菌种很容易从市场上得到。
在培养基中也可以加入表面活性剂，以增大底物在缓冲溶液中的溶解度，表面活性剂包括聚乙二醇、吐温、聚乙烯醇、十六烷基三甲基溴化铵，表面活性剂的浓度控制在0.05～5％，优选为0.5～2％。
在上述的立体选择性水解反应中，底物的浓度可以控制在0.05～10％之间，最好为0.5～5％，pH为5～11，最好为6～9。
所述的立体选择性水解反应可以在缓冲液和有机溶剂中两相中进行，所述的有机溶剂包括苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯、异丙醚、四氯化碳、氯仿，优选是甲苯或二甲苯或异丙醚。
所述的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、邻苯二甲酸缓冲液、酒石酸缓冲液、二乙基巴比妥酸钠缓冲液、2，4，6-三甲基吡啶-盐酸缓冲液、2-氨基-2-羟甲基-(1，3)丙二醇-盐酸缓冲液，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和N-乙基吗啉-盐酸缓冲液。
换言之，培养上述微生物，可产生上述水解酶，发酵产生的细胞均可用作酶源。使用本领域技术人员熟知的包括碳源，氮源的培养基和适当的诱导物和常用的无机盐。发酵在加热或常温，优选在20～40℃下，有氧的情况下进行，pH值介于5～8之间。
立体选择性的水解反应可在适当的溶剂中进行。所述的有机溶剂包括苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯、异丙醚、四氯化碳、氯仿，优选是甲苯或二甲苯或异丙醚。
底物的浓度可控制在0.05～10％之间，优选在0.5～5％之间。反应可在室温或在加热的情况下进行，加热温度优选在10～50℃之间，反应液的pH值对水解反应也有很大的影响，因此反应过程中要调节pH值并控制在5～10之间，优选在6～9之间。
外消旋β-苯基缩水甘油酸甲酯的酶促水解反应可在缓冲溶液中进行，也可在缓冲溶液和如甲苯、苯、乙醚、乙酸乙酯、异丙醚，二甲苯，四氯化碳，氯仿等两相有机溶剂中进行，优选的有机溶剂为甲苯，二甲苯，异丙醚。
将光学活性β-苯基缩水甘油酸甲酯从反应体系中的分离纯化可按本领域技术人员熟知的常规方法进行。
由于反应过程中有苯乙醛生成，因此产物须用饱和亚硫酸氢钠的水溶液进行洗涤。
如果反应是在水相和有机相两相间进行，则将有机相分离出来，水层以有机溶剂萃取，合并有机层，并以饱和的亚硫酸氢钠水溶液洗涤，干燥，浓缩。若反应是在水相中进行，则以有机溶剂萃取，并以饱和的亚硫酸氢钠水溶液洗涤，干燥，浓缩。
因此，按照上述酶拆分方法可以得到(+)β-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*，可作为合成(-)黄皮酰胺的关键中间体。
经本发明方法得到的(-)黄皮酰胺对正常鼠或记忆障碍鼠的记忆改善作用所需口服剂量为5～10mg·kg-1，而(+)黄皮酰胺无效。现有技术中，曾对(±)、(+)、(-)黄皮酰胺的易化学习、记忆及加强突触长时程增强(LTP)的作用及其与脑复康(Piracetam)的比较进行了详细研究。
脑复康的口服有效剂量为500mg·kg-1，(Dall R.Demographic andepidemiological trends today.InWolff HP et al eds.Drug research and drugdevelopment in 21’st century.BerlinSpring-verlag.199825-26.)，故(-)黄皮酰胺改善记忆作用的强度是脑复康的50～100倍，(-)黄皮酰胺也能增强突触基础传递和加强高频电刺激引起的LTP的幅度，(+)黄皮酰胺和脑复康对LTP无影响。
本发明化合物可用口服方法或非肠胃道用药。口服用药可以是片剂、胶囊剂、包衣剂，非经肠用药剂型有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备的。为制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的助剂，例如淀粉，明胶，阿拉伯胶，硅石，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂例如有水，乙醇，丙二醇，植物油类如玉米油，花生油，橄榄油等。含有本发明化合物的制剂中还可有其他助剂，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂，色素等。
在片剂、胶囊剂、包衣剂，注射剂或栓剂中含有本发明通式(I)化合物的剂量是以单元剂型中存在的化合物量计算的。
在上述工作基础上，本发明人取得了新的进展，基本阐明了(-)黄皮酰胺易化学习记忆和LTP的作用机制，观察到(-)黄皮酰胺对β-amyloid(β-A)致记忆障碍的改善作用和抗神经细胞凋亡作用。
附图简要说明
图1是本发明方法的化学合成路线图，其中，(+)2表示(+)-(2S，3R)-3-苯基缩水甘油酸甲酯；(+)3表示(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-(β-羟基-苯乙基)-3-苯基缩水甘油酰胺；(+)4表示(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-苯甲酰甲基-3-苯基缩水甘油酰胺；(-)5表示(-)黄皮酰胺酮；(-)-(3S，4R，5R)-3-羟基-5-苯甲酰甲基-1-甲基-4-苯基吡咯烷-2-酮；(-)I表示(-)黄皮酰胺；(-)-(3S，4R，5R，6S)-3-羟基-5-(a-羟基苄基)-1-甲基-4-苯基吡咯烷-2-酮。
图2为四种典型的搜寻策略在Morris水迷宫训练中出现频率的动态变化图。其中1，2，3，4，5，6和7分别代表对照组、模型组、模型加(-)黄皮酰胺8mg/kg治疗组、模型(-)黄皮酰胺40mg/kg治疗组、模型(+)黄皮酰胺8mg/kg治疗组、模型(+)黄皮酰胺40mg/kg治疗组、模型加脑复康400mg/kg治疗组。
图3为大鼠齿状回苔状神经纤维发芽的区分布图，其中A对照，B(-)黄皮酰胺8mg·kg-1，C(-)黄皮酰胺40mg·kg-1，D(+)黄皮酰胺8mg·kg-1，E(+)黄皮酰胺40mg·kg-1与对照组比较，*P＜0.05及**P＜0.01。
图4为大鼠海马CA3区苔状神经纤维发芽的区分布图，其中，A对照，B(-)黄皮酰胺8mg·kg-1，C(-)黄皮酰胺40mg·kg-1，D(+)黄皮酰胺8mg·kg-1，E(+)黄皮酰胺40mg·kg-1与对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01。
图5为BDNF蛋白在海马锥体细胞和皮层细胞内表达的相对量的分布图，其中，A对照，B(-)黄皮酰胺8mg·kg-1，C(-)黄皮酰胺40mg·kg-1，D(+)黄皮酰胺8mg·kg-1，E(+)黄皮酰胺40mg·kg-1。
图中*及**表示与对照组比较，P＜0.05及**P＜0.01本文以下使用的字“孟”应为具有草字头的“孟”。
以下将结合实施例详细描述本发明，但是非限定的目的。
实施例1 (+)-2S，3R-3-苯基缩水甘油酸(+)-8-β-萘取代醇酯(2a)*将NaH(80％)430mg加入20ml干燥的THF中，N2保护下磁力搅拌，缓慢滴加1g苯甲醛和2.3g(+)-8-β-萘基醇氯乙酸酯(1a)*的10mlTHF溶液，加毕，室温搅拌40小时，将反应液倾入30ml的冰水中(含1ml冰乙酸)，用乙醚(40ml×3)萃取，依次用饱和的NaHSO3水溶液，饱和NaHCO3水溶液，饱和NaCl水溶液洗涤，加无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩至干，得2.9g油状物。经硅胶柱层析得2.16g白色固体。
收率79.0％，mp38～40C，[α]15D＝+35.8°(C1.31CHCl3)。NMR 500MHz，δ，ppm7.03-6.4(12H，m)，4.96(1H，td，J＝2.2Hz，10.7Hz)，3.96(1H，d，J＝1.27Hz)，2.64(1H，d，J＝1.2Hz)，1.48(3H，s)，0.98(3H，d，J＝6.48Hz)，0.9-2.2(9H，m)实施例2.(+)-2S，3R-3-苯基缩水甘油酸(+)醇酯(2b)*
将NaH(80％)3.27g加入100ml无水THF中搅匀，滴加11.6g苯甲醛和11.85g氯乙酸(+)孟醇酯(1b)*的100ml无水THF溶液，加毕，室温搅拌10小时，抽滤，滤液减压浓缩至干，加入适量乙醚溶解，依次用饱和NaHSO3水溶液，饱和NaHCO3水溶液，饱和NaCl水溶液洗至中性，加无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，所得油状物冷冻固化，重结晶三次，得白色结晶7.62g。收率35％，mp62～63℃，[α]15D＝+167°(C1.0 CHCl3)。
实施例3 (+)-2S，3R-3-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*将4.28g化合物(2a*或2b*)溶于80ml甲醇，磁力搅拌，加入200mg甲醇钠，反应6小时后，滴加0.2ml冰乙酸，减压浓缩干，加入100ml乙醚搅拌30分钟过滤，减压浓缩至干，得4.3g油状物，经硅胶柱层析，得1.33g油状化合物(2)*。收率75％，[α]15D＝+170.9°(C1.33 CHCl3)。
实施例4(+)-2S.3R-N-甲基-N-(β-羟基苯乙基)-3-苯基缩水甘油酰胺(3)*将1.78g化合物(2)*，1.51g N-甲基-β-羟基苯乙胺分别溶于5ml甲醇中，冷却至-20℃后混合，加入100mg甲醇钠，溶解后冰箱中放置2天；滴加0.2ml2N盐酸，减压浓缩干，得白色固体，过滤得2.3g化合物(3)*。收率77.3％，mp93～94℃，[α]15D＝+70.2°(C0.684 CH3OH)。
实施例5(+)-2S.3R-N-甲基-N-α-苯甲酰甲基-3-苯基缩水甘油酰胺(4)*将2.97g化合物(3)*，2.2g无水CuSO4和6.32g KMnO4依次加入到100mlCH2Cl2中搅拌3小时，过滤、用CH2Cl2洗、减压浓缩干，得2.9g油状物，重结晶，得2.3g化合物(4)*。收率78.0％，mp86～87℃，[α]15D＝+140.2°(C0.5CH3OH)。
实施例6(-)-黄皮酰胺酮的合成(5)*将2.95g化合物(4)*粉末加入到6.6mg LiOH·H2O的30ml水溶液中，于30～35℃水浴中磁力搅拌8小时，冷却、过滤、干燥，重结晶，得1.5g化合物(5)*。收率50.8％，mp196～198℃，[α]15D＝-338°(C0.6 CH3OH)。
实施例7(-)-黄皮酰胺的合成(-)I将2.95g左旋化合物(5)*加入到200ml甲醇中，磁力搅拌溶解，加入1.52gNaBH4，反应3小时；滴加1ml 2N盐酸，减压浓缩干，用CH2Cl2洗涤，加无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩干，重结晶得2.4g化合物(I)*。收率80.8％，mp160～161℃，[α]15D＝-144°(C0.2 CH3OH)。
实施例8.经消旋黄皮酰胺酮(±)5的拆分制备(-)黄皮酰胺(-)I将3g(-)醇氧乙酸溶于10g SOCl2中，加热回流5小时，减压蒸出SOCl2，加入5ml甲苯，再减压蒸去甲苯，残余物为棕色油状物重3.5g，将其溶于50mlCH2Cl2，再投入2g消旋黄皮酰胺酮(±)5，冰浴冷却，加入1ml无水吡啶，室温搅拌4小时。TLC显示两点，反应物依次用2N盐酸，饱和NaHCO3水溶液，饱和NaCl水溶液洗，无水Na2SO4干燥，得棕色固体5.4g，经层离与重结晶，得两种白色结晶(+7)*和(-7)*。
(+7)*0.86g，收率24.8％(理论收率50％)，mp152～153℃，[α]20D＝+156°(C1.1 CHCl3)；(-7)*1.06g，收率30.9％(理论收率50％)，mp177～178℃，[α]18D＝-249°(C0.21 CHCl3)。
分别以对甲苯磺酸作为催化剂在30ml甲醇中回流2小时，蒸去甲醇，有机层依次用稀盐酸，稀碱水洗至中性，由(+7)*得(+)黄皮酰胺酮(+5)*，收率82％，mp193～194℃，[α]18D＝+339°(C0.21 CH3OH)。由(-7)*得(-)黄皮酰胺酮(-5)*，收率88％，mp193～194℃，[α]18D＝-340°(C0.22 CH3OH)。
将(-)黄皮酰胺酮(-5)*0.59g，按照实施例7相同的方法，以0.11gNaBH4还原，重结晶得0.5g(-)黄皮酰胺(I)*，收率83％，mp161～162℃，[α]18D＝-145°(C0.24 CH3OH)。具体制备流程如下 实施例9.经消旋体黄皮酰胺酮(5)的拆分法制备(-)黄皮酰胺将3.56g(-)-S-邻苯二甲酰丙氨酸，5g SOCl2加入到50ml甲苯中，加热回流5小时，减压蒸去SOCl2，再加入20ml甲苯，减压浓缩至干，加入100ml干燥的CH2Cl2，用冰浴中冷却至0℃以下，加入4g消旋黄皮酰胺酮(5)，磁力搅拌，滴加1.6g吡啶，加毕室温搅拌10小时，加入30ml水，分取有机层，用30mlCH2Cl2萃取，合并有机相，依次用30ml 2N盐酸，饱和NaHCO3水溶液，饱和NaCl水溶液洗，加无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩干，重结晶，得(-6)*方晶1.42g，收率21.0％(理论量50％)，mp189～190℃，[α]15D＝-241°(C0.5 CHCl3)；(+6)*mp153～154℃，[α]15D＝+128.5°(C2.1 CHCl3)。
将4.96g方晶(-6)*加入到200ml甲醇中，磁力搅拌溶解，加入1.52g NaBH4，室温反应5小时，加入1ml 2N HCl，减压浓缩干，重结晶，得(-)-黄皮酰胺+(I)2.38g，收率81％，mp161～163℃，[α]20D＝-144.4°(C0.46 CH3OH)。其具体制备流程如下 实施例10.真菌酶拆分方法制备(+)-2S，3R-3-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*将含有3％蔗糖，1％蛋白胨，0.5％磷酸二氢钾，0.5％的聚乙二醇，1％的橄榄油30ml培养基置于250ml的烧瓶中，在120℃和一大气压下灭菌30分。冷却后，向该培养基中接入一接种环的米曲霉(Aspergillus，sp)菌，30℃下，转速220rpm，培养40小时，将菌体离心分离。并将菌体加入至pH值为7的10ml含有150mg的β-苯基缩水甘油酸甲酯的磷酸盐缓冲溶液中，30℃下反应72小时。反应完毕，加入20ml的乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，并以饱和的亚硫酸氢钠的水溶液洗涤，饱和的碳酸氢钠溶液洗涤，无水MgSO4干燥。浓缩得66mg油状物。该油状物经手性气相色谱分析(G-TA型手性柱，柱长为l0米，氮气为载气，流速为2.5ml/min，炉温为105℃)，其ee％值为98％，[α]D20＝+180°(c＝1，CHCl3)。
实施例11.放线菌拆分方法制备(+)-2S，3R-3-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*将含有1％蔗糖，2％蛋白胨，0.3％磷酸二氢钾，1％的聚乙二醇，2％橄榄油，30ml的培养基置于250ml的烧瓶中，在120℃和一大气压下灭菌30分。冷却后，向该培养基中接入一接种环的诺卡氏(Nocardia sp)菌，30℃，转速250rpm，培养36小时，将菌体离心分离。并将菌体加入至pH值为7.5的10ml含有200mg的消旋β-苯基缩水甘油酸甲酯(2)的磷酸盐缓冲溶液中，30℃下反应72小时。反应完毕，加入20ml的乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，并以饱和的亚硫酸氢钠的水溶液洗涤，饱和的碳酸氢钠溶液洗涤，无水MgSO4干燥。浓缩得80mg油状物。该油状物经手性气相色谱分析(G-TA型手性柱，柱长为10米，氮气为载气，流速为2.5ml/min，炉温为105℃)，其ee％值为98％，[α]D20＝+180°(C＝1 CHCl3)。
实施例12.酵母酶拆分方法制备(+)-2S，3R-3-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*将含有4％蔗糖，2％蛋白胨，1％磷酸二氢钾，2％的聚乙二醇，1％橄榄油，30ml的培养基置于250ml的烧瓶中，在120℃和一大气压下灭菌30分。冷却后，向该培养基中接入一接种环的假丝酵母(Candida sp)菌，30℃下转速200rpm，培养40小时，将菌体离心分离。并将菌体加入至pH值为8的30ml含有300mg的消旋β-苯基缩水甘油酸甲酯(2)的磷酸盐缓冲溶液中，30℃反应72小时。反应完毕，加入30ml的乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，并以饱和的亚硫酸氢钠的水溶液洗涤，饱和的碳酸氢钠溶液洗涤，无水MgSO4干燥。浓缩得120mg油状物。该油状物经手性气相色谱分析(G-TA型手性柱，柱长为10米，氮气为载气，流速为2.5ml/min，炉温为105℃)，其de％值为98％，[α]D20＝+180°(c＝1，CHCl3)。
实施例13细菌酶拆分方法制备(+)-2S.3R-3-苯基缩甘油酸甲酯(2)*将含有2.5％柠檬酸钠，1％大豆蛋白胨，0.5％磷酸二氢钾，2.5％的聚乙二醇，1％橄榄油30ml的培养基置于250ml的烧瓶中，在120℃和一大气压下灭菌30分。冷却后，向该培养基中接入一接种环的无色杆菌(Achromobacter.sp)，40℃下转速200rpm，培养40小时，将菌体离心分离。并将菌体加入至pH值为7的10ml含有150mg的消旋β-苯基缩水甘油酸甲酯(2)的磷酸盐缓冲溶液中，30℃反应72小时。反应完毕，加入20ml的乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，并以饱和的亚硫酸氢钠的水溶液洗涤，饱和的碳酸氢钠溶液洗涤，无水MgSO4干燥。浓缩得66mg油状物。该油状物经手性气相色谱分析(G-TA型手性柱，柱长为10米，氮气为载气，流速为2.5ml/min，炉温为105℃)，其de％值为99％，[α]D20＝+181°(C＝1 CHCl3)。
实施例14细菌酶拆分方法制备(+)-2S，3R-3-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*将含有2％乳酸，1.5％硫酸胺，0.5％磷酸二氢钾，0.5％的聚乙二醇，0.1％橄榄油30ml的培养基置于250ml的烧瓶中，在120℃和一大气压下灭菌30分。冷却后，向该培养基中接入一接种环的芽孢杆菌(Bucillus.sp)，50℃下转速220rpm，培养40小时，将菌体离心分离。并将菌体加入至pH值为10的10ml含有150mg的消旋β-苯基缩水甘油酸甲酯(2)的磷酸盐缓冲溶液中，50℃反应72小时。反应完毕，加入20ml的乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，并以饱和的亚硫酸氢钠的水溶液洗涤，饱和的碳酸氢钠溶液洗涤，无水MgSO4干燥。浓缩得66mg油状物。该油状物经手性气相色谱分析(G-TA型手性柱，柱长为10米，氮气为载气，流速为2.5ml/min，炉温为105℃)，其de％值为98％，[α]D20＝+181°(C＝1 CHCl3)。
实施例13 X-光晶体衍射法测定(-)-黄皮酰胺的绝对构型为了确定(-)-黄皮酰胺的绝对构型，采用实施例9中的化合物(-7)的单晶 由于(-)-盖氧乙酸的绝对构型是已知的，根据化合物(-7)的单晶X-光衍射测定结果，表明化合物(5)*的绝对构型如下结构式所示。
将(-)7化合物水解，经硼氢化钠还原得(-)-黄皮酰胺(-)I，根据由Sharpless还原方法所得黄皮酰胺旋光为(+)，构型为3R*，4S*，5S*，6R*(+)I，且其绝对值与所得的(-)I相同，符号相反，熔点也-致，由此C6应有6S的构型，即(-)-黄皮酰胺(+)I应具有3S，4R，5R，6S的构型。 经实验得出(-)黄皮酰胺的促智活性至少是(±)黄皮酰胺的5倍，(+)黄皮酰胺就本发明的作用几乎没有生物活性；(-)黄皮酰胺不仅在行为学上，也在电生理方面证明它易化学习记忆和增强神经可塑性的作用；(-)黄皮酰胺不但有很强的促智作用，并具有潜在的防治老年痴呆作用，它表现在抗神经细胞凋亡以及抑制Tau蛋白过磷酸化；除了已经从生化学，分子生物学和形态结构等方面阐明(-)黄皮酰胺的促智作用机制以外，特别是在形态结构方面证明它可以刺激海马苔状神经末梢的发芽；经对(-)(+)黄皮酰胺的研究，证明其代谢产物也有生物活性。实验例1(-)黄皮酰胺增强大鼠海马齿状回突触传递活动的机制采用麻醉大鼠，将刺激电极埋藏于内嗅区前穿质通路，记录电极埋藏于海马齿状回(DG)颗粒细胞层，以群峰电位(PS)作为DG颗粒细胞群兴奋性的指标，LTP是由10串200Hz的高频电刺激所诱导，每串刺激由5个波宽0.2ms的方波刺激组成，(-)、(+)黄皮酰胺和相应浓度的助溶剂DMSO都是通过植入侧脑室的篓管给予，记录30min的PS代表给药前的基础突触传递水平，然后于5分钟内将5μl的相应药物或助溶剂缓慢注入侧脑室。
1.研究证明，在麻醉大鼠DG部位用200Hz高频刺激诱导出一种NMDA受体和VDCC依赖性的LTP。(-)黄皮酰胺增强麻醉大鼠海马DG突触传递过程是VDCC依赖性的而与NMDA受体无关，高频刺激诱导的LTP和(-)黄皮酰胺增强的突触传递活动都伴有海马依赖性的蛋白磷酸酶Calcineurin和Calpain活性的提高，(参见下表1和表2)提示参与LTP和(-)黄皮酰胺对突触传递活动增强作用的不仅是蛋白激酶，而且有蛋白磷酸酶，说明蛋白磷酸化和脱磷酸化过程都有所增强，可能是由这两个过程最后相互协调和互为补充的结果决定突触水平的高低。
表1.大鼠皮层和海马组织的Calcineurin活性组 别 Calcineurin活性(umol Pi/hr/μg蛋白)脑皮层海马对照 8.3±0.4 7.8±0.6AP5 7.9±0.7 8.1±0.7尼莫地平 8.4±0.5 7.7±0.8高频电刺激(HFS) 9.2±1.1 8.5±0.7APS+HFS 8.8±0.7 9.6±0.5*尼莫地平+HFS 7.7±1.4 9.8±0.4*APS+尼莫地平+HFS 8.0±0.9 7.9±0.7(-)黄皮酰胺 11.2±0.9*10.4±0.5*(-)黄皮酰胺+APS 11.6±1.4*10.1±0.8*(-)黄皮酰胺+尼莫地平 9.1±1.2 8.3±0.6*与对照组比较，P＜0.05表2.大鼠皮层和海马组织的Calpain活性组 别 Calpain(ΔA595nm/hr/mg蛋白)脑皮层 海马对照 1.5±0.27.8±0.6AP51.6±0.41.6±0.6尼莫地平 1.7±0.31.8±0.5HFS1.8±0.74.3±0.7**APS+HFS1.7±0.42.9±0.8*#尼莫地平+HFS 1.8±0.52.6±0.7*#APS+尼莫地平+HFS 1.7±0.41.8±0.6(-)黄皮酰胺2.6±0.5*2.7±0.8*APS+(-)黄皮酰胺2.7±0.6*2.6±0.7*尼莫地平+(-)黄皮酰胺 1.6±0.61.9±0.6*及**表示与对照组相比，P＜0.05及P＜0.01#与HFS组相比P＜0.05。
2.研究证明，正常成年大鼠海马CA3区和DG存在少量苔状纤维末稍出芽现象。(-)黄皮酰胺8mg·kg-1和40mg·kg-1剂量依赖性地促进这两个海马区域的苔状纤维末梢的出芽，而同剂量(+)黄皮酰胺却对其没有明显的影响，提示(-)、(+)黄皮酰胺这种作用的明显差异可能是其长期给药对海马突触传递不同影响的形态学基础(结果列于图3、图4)3. BDNF(脑源性神经营养因子)大量地在正常大鼠皮层神经元和海马颗粒细胞和锥体细胞内表达，(-)黄皮酰胺(8，40mg·kg-1)剂量依赖性增加BDNF在这两个区域的表达，(+)黄皮酰胺(40mg·kg-1)对其也有轻度增加作用，提示(-)(+)黄皮酰胺长期给药对海马突触传递活动的不同影响可能与其对BDNF蛋白表达的作用差异有关。结果见图54.谷氨酸受体在(-)黄皮酰胺致LTP中的作用。兴奋性神经递质谷氨酸在中枢神经系统中含量丰富，它从突触前释放，激活突触后多种谷氨酸受体，在LTP中占有重要地位，G蛋白偶联性受体mGluR不直接调节电信号，而是激活多种第二信使级联反应。我们观察了mGluR拮抗剂(±)MCPG对(-)黄皮酰胺诱发在体海马齿状回LTP的影响，结果表明，(±)MCPG(10μmol，icv)抑制HFS和(-)黄皮酰胺诱导的LTP，在给予HFS和(-)黄皮酰胺后15min侧脑室注射(±)MCPG可以逆转已经建立的LTP，提示MCPG敏感的mGluR受体是(-)黄皮酰胺诱导和维持LTP所必须的，(-)黄皮酰胺通过mGluR受体引起突触传递功能增强。
实验例2(-)和(+)黄皮酰胺对β-A致记忆障碍的改善作用老年斑是早老性痴呆症患者的主要神经病理特征。其核心成分是一种由40-42个氨基酸组成的多肽，这种被称为β-淀粉样蛋白(β-A)的多肽已被大量的研究证实其具有神经毒性作用。β-A结构中一个由11个氨其酸(25-35)组成的片断β-A(25-35)具有与β-A相似的神经毒性作用和自我凝聚能力，跟β-A一样，凝聚态β-A(25-35)的神经毒性较其溶解态强，利用向大鼠侧脑室注射凝聚态β-A(25-35)成功地造成了动物在Morris水迷宫中的记忆障碍模型。
脑室内注射15nmolβ-A(25-35)后第15天开始采用Morris水迷宫训练测试大鼠的空间学习记忆能力，每天训练4次，每次3min。结果以动物找到平台所需的时间即潜伏期，朝向错误角度(动物躯体长轴所指方向与入水点到平台间连线的夹角)和动物寻找平台所采用的策略来表示。
训练的第2天开始，β-A(25-35)模型组的潜伏期明显比对照组长(F＝3.04，P＜0.05)至第5天，差别最显著(F＝13.7，P＜0.01)。从第3天开始，(-)黄皮酰胺8mg·kg-1组和40mg·kg-1组的潜伏期比β-A(25-35)模型组明显缩短(F＝2.68，P＜0.05和F＝2.73，P＜0.05)。(+)黄皮酰胺8和40mg·kg-1组和脑复康400mg·kg-1组训练各天的潜伏期与β-A(25-35)模型组没有显著差异。各组动物的错误朝向角度随着训练次数的增加逐渐减小，从第3天开始模型组的错误朝向角度明显大于对照组，(-)黄皮酰胺8mg·kg-1和40mg·kg-1组明显小于模型组。同剂量的(+)黄皮酰胺8mg·kg-1和400mg·kg-1脑复康组与模型组间无显著性差异。(见表3)表3.β-AP(25-35)对Morris水迷宫训练中朝向错误角度的影响及(-)、(+)黄皮酰胺的作用。朝向错误角度以MEAN±S.D.表示。组别 训练天数1 23 4 5A93.6±34.6 76.8±29.847.3±15.129.6±10.7 15.4±20.4B106.3±29.898.7±30.473.5±20.3*60.6±23.8*46.7±19.4*C89.7±29.4 72.3±19.846.5±21.2# 30.4±14.8#17.6±9.5#D101.5±24.383.5±21.851.2±18.7# 28.4±13.2#20.7±8.7#E99.4±31.7 93.5±29.682.1±26.770.2±21.5 59.2±18.3F112.4±32.8102.5±28.7 94.2±22.583.1±26.5 65.4±20.8G92.5±28.9 87.3±24.274.6±23.762.5±19.6 44.5±14.3*P＜0.05vs对照组#P＜0.05vs模型组。A对照组B模型组C模型(-)黄皮酰胺8mg/kg治疗组D模型(-)黄皮酰胺40mg/kg治疗组E模型(+)黄皮酰胺8mg/kg治疗组F模型(+)黄皮酰胺40mg/kg治疗组G模型脑复康400mg/kg治疗组。
本实验中大鼠四种典型的搜索站台的方式随机式，边缘式，趋向式和直线式都观察到了。在训练开始时各组动物都主要以边缘式和随机式策略寻找站台，随着训练次数的增加，这两种搜索策略的出现率逐渐下降。从第三天开始，正常对照组和(-)黄皮酰胺治疗组这种下降的速度和程度较其它组快。同时，趋势向式和直线式的出现逐渐增加。其结果见说明书附图2。实验例3(-)黄皮酰胺对Baxc DNA高表达的PC12细胞凋亡的抑制作用1、首次建成Baxα稳定表达的PC12细胞系首先用限制性内切酶去除了BaxαcDNA3’末端加PolyA信号序列及部分其它序列，构建了中间载体Pbluescript SK-Baxα(PA)然后用内切酶从中间载体将BaxαcDNA切出，以单一方向与真核表达载体PcDNA3相连接获得PcDNA3 Baxα重组质粒。序列重组的Baxα cDNA含有-50bp的5’非翻译末端(5’-UTR)，576bp的开放读码框架(ORF)以及137bp的3’非翻译末端(3’-UTR)。用lipofectamine脂质体转染法将pcDNA3-Baxα转入PC12细胞，用G-418选择抗性细胞克隆。Western印迹法和免疫组织化学法都显示PC-12细胞系内有Baxα蛋白高水平的表达，故本研究成功地首次建立了Baxα稳定表达的PC12细胞素。
2、Baxα高表达PC12细胞系凋亡模型的建立及(一)黄皮酰胺的抗细胞凋亡作用原位末端标记(TUNEL)和流式细胞仪观察表明6-羟基多巴胺(6-OHDA)100μmol/L可以诱导Baxα高表达PC-12细胞系的凋亡损伤，与转空载细胞相比较凋亡的比例明显上升(49.96％vs32.9％)，说明Baxα在凋亡过程中起重要作用，给予(-)黄皮酰胺10-7～10-5mol/L后可使细胞凋亡比例从49.96％分别下降到36。23％，28.1％和9.5％。
3、(-)黄皮酰胺抗细胞凋亡作用机制的研究(1)Baxα高表达PC12细胞经6-OHDA诱导后24小时，细胞内Bcl-2抗细胞凋亡基因的水平有一定程度下降，给予(-)黄皮酰胺10-7和10-6/mol/L后，可使Bcl-2蛋白的水平明显升高。
(2)Baxα高表达PC12细胞经6-OHDA作用后24小时，线粒体内GSH的含量明显降低(9.84±1.20 vs 14.98±1.18n mol/mg pro)，MDA的含量明显升高(2.46±0.19 vs 2.01±0.12n mol/mg pro)给予(-)黄皮酰胺10-710-610-5mol/L后可使线粒体内GSH的含量显著升高(12.29±0.99，15.10±0.95，17.78±1.04nmol/mg pro)MDA的含量明显下降(1.76±0.17，1.54±0.13，1.33±0.11n mol/mg
Baxα高表达PC12细胞与转空载细胞相比较具有较高的线粒体膜电位(95.08VS 83.03)。经6-OHDA诱导后12小时，Baxα高表达PC12细胞的线粒体膜电位明显降低(95.08 vs 24.6)给予(-)黄皮酰胺10-7和10-6mol/L后可以使线粒体膜电位明显升高(30.7±3.3，56.0±5.0)。另外，Baxα高表达PC12细胞经6-OHDA诱导后12小时，线粒体电子传递链复合酶I的活性显著降低(1.44±0.16 vs 1.68±0.14μmol/mg pro/min)，复合酶IV的活性也显著降低(0.09±0.019 vs 0.15±0.022μmol/mg pro/min)。给予(一)黄皮酰胺10-7，10-6，10-5mol/L后，可使线粒体电子传递链复合酶I活性升高(1.57±0.12，1.98±0.05，2.16±0.2μmol/mgpro/min)。以及使复合酶IV活性升高(0.12±0.015，0.15±0.02，0.18±0.01μmol/mgpro/min)。
(4)(一)黄皮酰胺对体外分离线粒体细胞色素C释放的影响细胞在受到凋亡信号的刺激后，细胞色素C进入到细胞浆内激活死亡程序，本研究首先用固相金属离子纯化法分离得到Baxα蛋白，当将其加入到分离的线粒体后，可使线粒体细胞色素C含量减少(74.43±5.69μg/mg pro.vs 50.2±30.65μg/mg pro)，(一)黄皮酰胺10-7，10-6，10-5mol/L可使细胞色素C释放分别降低为58.73±3.77，61.7±5.3和67.95±7.6μg/mg pro。
实验例4(±)、(-)、(+)黄皮酰胺改善记忆作用的比较本发明采用一次性回避条件反射跳台法和避暗法以多次学习的水迷宫法观察(±)、(-)、(+)黄皮酰胺对改善记忆的作用进行了比较性试验。
跳台法和避暗法系于实验前口服药物一次。水迷宫法共实验5天，每天训练前腹腔注射药物一次，连续5天，结果以潜伏期、错误次数表示。
表4为脑复康和(-)黄皮酰胺对跳台法和避暗法因注射樟柳碱引起记忆获得障碍的作用。
表4
N＝10x±SD**＜0.05***P＜0.01 VS 0.9％Nacl(樟柳碱)表5为脑复康和(-)、(±)黄皮酰胺对水迷宫的学习记忆潜伏期和记忆过程的影响。
表5药物剂量mg/kg第二天 第三天 第四天达到平台的潜伏 达到平台的潜伏期(秒) 期(秒)0.9％Nacl 32.4±29.225.8±18.4 26.1±38.4脑复康 50032.2±22.618.6±9.9**16.7±16.3**(-)黄皮酰胺 10 28.7±35.217.4±10.9**12.1±6.9**(±)黄皮酰胺10 35.8±35.223.9±22.6 17.1±14.3(±)黄皮酰胺10036.6±37.025.7±13.8 14.6±10.4**N＝10，x±SD**P＜0.05***P＜0.01 VS 0.9％Nacl表6为脑复康、(-)、(±)黄皮酰胺对水迷宫实验中因注射樟柳碱(10mg/kg)引起记忆获得障碍的作用。表6药物 N剂量(mg/kg) 错误次数樟柳碱 1015.9±11.3脑复康 9500 23.5±25.0(-)黄皮酰胺 10 10 9.4±5.9**(±)黄皮酰胺 810 16.6±23.9(±)黄皮酰胺 8100 9.11±3.8****P＜0.05 VS樟柳碱组表7为(-)、(+)黄皮酰胺对避暗实验中樟柳碱引起记忆获得障碍的作用表7药物 剂量(mg/kg) 潜伏期(秒) 错误次数0.9％Nacl 152.1±64.2 2.0±3.8樟柳碱 10 35.8±76.4**14.1±8.9**(+)黄皮酰胺 10 138.2±86.7**6.7±11.0*(-)黄皮酰胺 50 140.6±96.4**5.4±4.1**(±)黄皮酰胺 10 43.0±65.8 11.3±21.5(±)黄皮酰胺 50 79.9±63.6 14.4±12.3*P＜0.05**P＜0.01 VS樟柳碱组**P＜0.01 VS 0.9％Nacl组(-)、(+)黄皮酰胺于训练前30分钟灌喂给药。樟柳碱组于训练前10分钟腹腔注射给药。
权利要求
1.一种制备具有如通式I所示的光活化合物(-)黄皮酰胺或其衍生物的方法，通式(I)所示的结构，其绝对构型为(3S，4R，5R，6S)，具有左旋光性，其中R1及R2可以是H、卤素、C1-6的烷基、 烷氧基、次甲二氧基、硝基；也可以是多取代R1和R2可以相同，也可以不同。R1，R2＝H时，为(-)黄皮酰胺，包括以下步骤(1)以氯乙酰氯与手性醇R*OH形成手性醇的氯乙酸酯(1)*；(2)得到的手性醇的氯乙酸酯与苯甲醛或R1取代的苯甲醛反应，获得相应光活的芳基缩甘油酸手性醇酯(2a)*、(2b)*(3)经酯交换得(+)-(2S，3R)-3-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*，(4)得到的+)-(2S，3R)-3-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*与相应的胺缩合得(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-(β-羟基-苯乙基)-3-苯基缩水甘油酰胺(3)*，再经氧化得(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-苯甲酰甲基-3-苯基缩水甘油酰胺(4)*；(5)所述的(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-苯甲酰甲基-3-苯基缩水甘油酰胺(4)*在碱性条件下环合得光活(-)黄皮酰胺酮(5)*(6)光活黄皮酰胺酮(5)*经硼氢化钠还原可得光活黄皮酰胺或其衍生物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的所述的手性醇包括(+)薄荷醇、(+)8苯基薄荷醇或者(+)8β萘基薄荷醇。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于环合所用的碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、二异丙胺基锂，丁基锂，四烷基氢氧化胺及三烷基胺。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于环合时使用的溶剂为水、甲醇、乙醇等低烷基醇或它们的混合物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于可以利用消旋黄皮酰胺酮化合物(5)的C3位的羟基与拆分剂手性酸成酯，然后经重结晶或层析分离所得一对差向异构体，所述的拆分剂手性酸包括L孟氧乙酸，樟脑磺酸、(-)S邻苯二甲酰丙氨酸或者N-对甲苯磺酰脯氨酸，优选的是(-)S邻苯二甲酰丙氨酸。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于可以将消旋的3-苯基缩水甘油酸甲酯经酶拆分的方法制得(+)-(2S，3R)-3-苯基缩水甘油酸甲酯(2)*，其中，采用具有产生水解酶能力的选自真菌，细菌，酵母，和放线菌的微生物在培养基中，温度为10-50℃，优选为20～40℃下有氧发酵对化合物(+)β-苯基缩水甘油酸甲酯进行立体选择性水解反应，其水解反应的pH值介于5～10之间，温度为10-50℃，分离萃取得到光活性黄皮酰胺。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的具有产生水解酶的能力的微生物包括无色杆菌(Achromobacter，sp)，产碱杆菌(Alcaligenes，sp)，节杆菌(Archrobacter，sp)，芽孢杆菌(Bacillus sp)，短杆菌(Breubacillus，sp)，棒杆菌(Corynebacterium，sp)，欧文氏菌(Erwinia sp)，假单孢菌(Pseudomonas sp)属，酵母的假丝酵母(Candida sp)和毕赤(Pichia sp)，红酵母(Rhadatorula sp)，汉荪酵母(Hansenula sp)属，真菌中的曲霉(Aspergillus)，毛霉(Mucorsp)，米曲霉(Aspergillus，sp)，青霉(Penicillium)，根霉(Rhizopus sp)以及放线菌中的诺卡氏(Nocardia sp)，链霉菌(Streptomyces sp)。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述的立体选择性水解反应中，底物的浓度可以控制在0.05～10％之间，最好为0.5～5％，pH为5～11，最好为6～9。
9.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于可以在培养基中加入表面活性剂，以增大底物在缓冲溶液中的溶解度，表面活性剂包括聚乙二醇、吐温、聚乙烯醇、十六烷基三甲基溴化铵，表面活性剂的浓度控制在0.05～5％，优选为0.5～2％。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在所述的立体选择性水解反应可以在缓冲液和有机溶剂中两相中进行，所述的有机溶剂包括苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯、异丙醚、四氯化碳、氯仿，优选是甲苯或二甲苯或异丙醚。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在所述的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、邻苯二甲酸缓冲液、酒石酸缓冲液、二乙基巴比妥酸钠缓冲液、2，4，6-三甲基吡啶-盐酸缓冲液、2-氨基-2-羟甲基-(1，3)丙二醇-盐酸缓冲液，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和N-乙基吗啉-盐酸缓冲液。
12.如权利要求1所述的光学活性化合物(-)黄皮酰胺在制备促智，抗衰老作用药物的应用。
全文摘要
一种制备光活(－)黄皮酰胺或其衍生物的方法,以氯乙酰氯与手性醇R
文档编号C07D207/273GK1345721SQ00124630
公开日2002年4月24日 申请日期2000年9月28日 优先权日2000年9月28日
发明者黄量, 张均田, 吴克美, 孙万儒 申请人:中国医学科学院药物研究所