专利名称：细胞周期调节及细胞过敏性反应诱导基因的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及植物基因及其分离技术。
利用传统遗传学方法，只适用于分离克隆功能产物已知的基因。即，首先要鉴定目标基因的表达产物，从而分离蛋白，通过测定氨基酸序列，推测基因的DNA序列，进而用它做探针分离目标基因。但是，绝大多数植物抗病基因产物是未知的，因此，利用传统基因分离技术无法克隆这些基因。
分离产物未知的植物抗病基因方法主要是图位克隆法和转座子标签克隆法。
1.图位克隆法其原理是依据基因在基因图谱中的位置，利用与目的基因紧密连锁的分子标记，借助于染色体步移及登陆技术克隆基因。它包括三个关键环节①构建高分辨率的遗传图谱和物理图谱，定位目标基因，获得位于目标基因两侧，并与其紧密连锁的分子标记；②构建大片段基因文库；③可行的遗传转化技术。
目前利用该方法从西红柿中克隆出番茄抗霜霉病基因Pto等3个基因，从拟南芥中克隆出抗细菌病RPs2等5个基因，从水稻中克隆出Xa21、Xa1两个抗白叶枯病基因，从甜菜中克隆出抗线虫病基因Hs1。
由于麦类基因组含量大，尚没有致密的遗传图谱。另外，小麦族植物基因组中含有大量的重复DNA序列，约占总基因组含量的75％。很难利用染色体步移或登陆法去定位基因。
2.转座子标签技术其原理是诱发转座子跳跃，插入到目的基因内部或其邻近位点，引起表现型变异。因此，可以用转座子为探针克隆出该突变基因，再利用突变基因做探针从正常植物中克隆出目的基因。利用这种方法已成功地克隆了烟草抗花叶病毒基因N，西红柿抗叶霉病基因cf9，亚麻抗绣病基因L，玉米抗圆斑病基因Hm1及玉米抗条锈基因RP1。但是，由于小麦族植物中尚没有发现可以利用的转座子，因此，该法不能用于小麦族植物基因克隆。
染色体显微分离技术现状染色体显微分离技术是指在显微镜下对特定染色体进行显微切割、分离、随后进行DNA扩增，并将扩增产物连接到特定载体上，构建特定染色体DNA文库。通常的基因文库是由基因组总DNA构成的，与其相比，染色体DNA文库是由基因组中某一特定染色体DNA构成，通过分析文库特征，可以直接获得该染色体上的遗传信息。当要分离位于特定染色体上的目的基因时，可以应用染色体显微分离技术分离回收该染色体，构建DNA文库，分离与目的基因相关的DNA片段，进而分离基因。该法特别适用于是基因组含量较大的植物。染色体分离技术包括(1)染色体标本制作与染色体的识别鉴定；(2)染色体显微切割、分离；(3)DNAPCR扩增；(4)构建DNA文库。其中关键技术是染色体显微切割与分离。
目前，通常采用玻璃针切割法和显微激光切割分离法两种方法(1)玻璃针切割分离法它是将细微的玻璃针装载在显微操纵器上，用玻璃针的端部直接挑取目标染色体。利用玻璃针法相继构建了一些人类染色体区带探针池，用于分离染色体特定区域的基因分子标记。1992年该技术首次应用于构建野生甜菜(Beta patellaris)特定染色体的基因文库。此后，Schondelmaier等(1993)构建了大麦1HS的DNA文库，Chen等(1995)构建了栽培燕麦第21号DNA文库等等。其优点是实验装置简单，只需一台倒置显微镜。但是，用玻璃针直接挑取染色体，技术上要求很高，不易掌握。
(2)染色体显微激光分离技术为解决染色体分离回收技术要求高，不易操作的问题，日本科学家福井希一等人(1992)[Fukui K，等，Theor，Appl.Genet.，1992，84787-791]开发了染色体显微激光分离技术。它是采用美国Meridian公司开发的激光共聚焦扫描系统(Cell Work Station，ACAS 470型)对水稻、大麦染色体进行显微切割，分离。该显微操作装置可发射波长350-528nm的激光，用激光直接照射染色体标本上不要的染色体和细胞核，利用激光产生的热能使被照射的部分受热蒸发，最后只保留所需要的部分。由于激光的照射强度、时间及位置都是通过计算机控制的，容易操作。
通过检索GenBank，表明在哺乳动物(如人、鼠)基因组中，已经发现癌抑制基因P53基因，该基因序列同本发明的基因具有一定的同源性。
P53基因是一类转录因子，它可以激活下游基因表达。1984年该基因被克隆。该基因的cDNA由1179个碱基对组成，编码393个氨基酸，包括N末端区域(转录活性区)、中央区域(DNA结合区域)和C末端区域(核内转移区)。我们获得的pMAg139的序列与P53基因序列比较发现，P53基因第321碱基到第1125碱基区域与pMAg139存在着一定的同源性。从编码氨基酸上看，pMAg139编码了中央区域及C末端区域一部分(缺少18个氨基酸)(图2)。
P53基因功能在正常细胞中，P53基因产物含量很低，没有活性。当细胞受到如病原菌感染，紫外线照射，高温等生物及非生物胁迫作用，造成基因组内DNA受损时，P53基因被激活，其产物在细胞内大量积累，并逐渐转移到细胞核内，与靶基因的启动子结合，激活靶基因。P53基因的信号传递模式如图3所示，其功能之一是调控细胞周期。首先，当基因受损较轻时，P53蛋白将与P21基因结合，使其表达。该基因产物是细胞周期调节因子CDK(cyclin dependent kinase)阻遏蛋白，转录因子E2F可以激活DNA合成基因转录，使细胞周期由G1期向S期过渡。Rb因子是调控E2F活性的。通常在细胞周期过程中，在G1前期低磷酸化型Rb因子与E2F结合，但到了G1后期Rb因子将变成高磷酸化型，并与E2F脱离，诱导DNA合成基因表达，向S期过渡。当P21基因表达，阻遏CDK基因表达，低磷酸化Rb大量积累，与E2F结合使其失活，从而抑制了细胞由G1期向S期过渡。细胞周期一旦停止，遭受损伤的DNA将得到修复，细胞周期将再次恢复。如果P53基因失活，细胞周期不能暂停，受损的基因得不到及时修复，受损的细胞就会继续增殖产生病变(表1)。
P53基因的另一功能是诱导细胞主动死亡，表现出抗病性。当基因受损严重无法修复时，P53基因将启动细胞主动死亡系统，从组织中排除受损细胞，保证邻近细胞不受影响。P53基因产物与BAX基因(Bcl 2Associated X Protein)或Fas/Apol基因的启动子结合，诱导基因表达。这两种基因产物都具有抑制Bcl-2、促进Caspase基因活性的作用。Caspase基因可以诱导细胞主动死亡，使细胞表现抗病性。近年来，在医学上利用P53基因治疗癌症已进入临床实验。
在粮食作物玉米中，利用人类P53蛋白抗体，进行免疫反应分析，发现了P53基因编码蛋白(Georgieva，E等，plana，1994，192(1)125-129)。说明植物中也含有与哺乳动物的P53基因类似的功能基因。但是，迄今为止，国内外尚没有在植物基因组中发现与P53基因同源的DNA序列。目前还没有应用哺乳动物P53基因进行植物抗病育种的报道。
本发明的目的是采用染色体显微激光分离技术，分离回收中间偃麦草染色体2Ai-2染色体，构建DNA文库，从中筛选与抗病基因有关的基因片段，进而克隆抗病基因。
本发明的方案是这样实现的一种细胞周期调节及细胞过敏性反应诱导基因，该基因为pMAg139基因，由804个碱基对组成，其序列如
图1。
本发明的优点和积极效果为最近的研究表明动植物可能采用相同的调控机制诱导过敏性反应(Pazo，O.，Lam，E1998 Current Biol.，8，1129-1132)。过敏性反应是动植物体内抵御病原菌侵染的一种防卫反应。它是通过诱导细胞主动死亡，将病原菌限制在局部组织细胞内，阻止其进一步向周边组织细胞扩展，从而起到自身防御作用。
哺乳动物中的P53基因其功能主要有二个，(1)具有调节细胞周期，使受损伤的基因得以修复。(2)癌抑制作用。当人体内P53基因失活，就会产生各种癌变(见表1)。
在玉米中已发现有P53基因的表达产物，在豌豆发现由P53基因产物诱导的P21基因与人体内的P21基因之间具有高度的同源性。说明植物体内存在与P53基因相似的P53类似功能基因，该基因在植物细胞内应具有调节植物细胞周期，和诱导植物细胞产生过敏性反应的功能，从而使植物表现出抗病性。
有实验证明，病原菌侵入植物细胞内，会导致核内DNA受损(Hadwiger，LA and Adams MJ.1978，Physiological Plant Pathology，1263-72)。因此，可以推测，当植物感染病原菌时，P53类似基因将被激活，其产物不断积累，进入细胞核内，诱导细胞周期调节系统活化，修复受损的DNA，或者是诱导细胞内产生过敏性反应，将病原菌限制在局部范围内，防止其继续扩展，表现出抗病性。
本发明得到的pMAg139基因是来自小麦近缘种中间偃麦草，已经证实，中间偃麦草具有抗条锈病(Puccinia striiformis f.)、叶锈病(Puccinia recondita f.)、秆锈病(Puccinia striiformis f.)、小麦黄花叶病毒病WYMV等抗性基因，这些抗性都是通过产生过敏性反应体现的，pMAg139基因可能就是诱导这些过敏性反应的转录因子。
小麦锈病(条锈、叶锈、秆锈)及小麦黄花叶病毒病是小麦的重要病害，对小麦的产量影响很大，常年损失5-10％。在我国小麦条锈病主要分布在华北、西北、淮北等北方冬麦区。秆锈病主要发生在东南沿海，长江流域中下游冬麦区，东北、西北、内蒙古等春麦区。叶锈病主要发生在西南及长江中下游冬麦区。小麦黄花叶病毒病主要分布在长江中下游地区，特别是近年来有逐年上升趋势。
本发明获得的pMAg139基因，可能就是诱导小麦细胞体内产生过敏性反应的转录因子，可做为一种广谱抗病基因加以利用。将该基因导入当地主栽品种，可选育出抗锈病、抗黄花叶病毒病小麦新品种。由于抗病品种育成和推广，还可大量减少农药的使用，因此，该基因的应用，可产生巨大的经济和社会效益。
图1为本发明的pMAg139基因序列2为本发明pMAg139基因与P53基因的蛋白质一级结构比较图3为P53基因诱导的细胞周期停止及细胞主动死亡模式下面叙述
具体实施例方式本发明申请人是最早利用染色体显微激光切割技术构建小麦近缘种中间偃麦草染色体2Ai-2 DNA文库的。通过对DNA文库的筛选，获得了一个能够在2Ai-2染色体附加系(即2Ai-2染色体附加到普通小麦品种中)与普通小麦品种之间出现多态性的探针pMAg139，序列分析结果表明pMAg139由804个碱基对组成(如图1)。具体分离技术如下一、材料(一)植物材料①中间偃麦草，它是小麦的近缘野生种，具有小麦抗黄矮病、小麦黄花叶病毒病、锈病等抗性基因。
②附加系Z2携带有黄矮病抗性基因的中间偃麦草染色体2Ai-2添加到普通小麦品种宛7107，其染色体数2n＝44(包括普通小麦21对染色体和1对2Ai-2染色体)。
③2Ai-2染色体受体品种宛7107。
(二)质粒与菌种采用质粒pUC18及宿主大肠杆菌DH5α，构建2Ai-2染色体DNA文库。
二、方法(一)利用染色体显微切割技术构建染色体DNA文库主要包括以下步骤1.染色体标本制备从孕穗期小穗上采集的花药，分别用新鲜配制的卡诺固定液(乙醇∶冰醋酸＝3∶1)固定，通常要固定12小时以上，为了保证染色体DNA不受损伤，将固定时间减少到10-15分钟，然后转到70％乙醇置-20℃保存。采用2.5％纤维素酶/2.5％果胶酶，37℃酶解40-60分钟，蒸馏水中低渗10-20分钟后，将花药移到底部粘有薄膜的培养皿上，涂片。
2.染色体识别为了便于识别目标染色体，以附加系Z2作母本，与其小麦亲本宛7107杂交，杂种F1减数分裂中期I染色体构成为2n＝21II+I，其中配对的21对二价体是普通小麦染色体，而剩下一条未能配对的染色体是2Ai-2染色体。此外，后期I停滞在赤道板附近的单条染色体2Ai-2也很容易从小麦遗传背景中识别出来。
3.目标染色体的分离利用紫外激光共聚焦扫描系统(ACAS570UVA)，采用消除法进行目标染色体的分离回收。将染色体标本置于倒置显微镜下，寻找到合适的中期I或后期I分裂相后，以90-110mW功率的激光(波长488nm)切出一个以目标染色体为中心的长方形膜，然后再用激光(波长488nm，功率80-90mW)照射长方形膜内不要的细胞和染色体，使其蒸发，最后只保留所需要的染色体。用镊子回收长方形膜(此时，膜上附有目标染色体)，放入0.5ml离心管内。
4.回收染色体蛋白酶及内切酶处理蛋白酶处理参照Fukui等(1992)[Fukui K，等，Theor，Appl.Genet.，1992，84787-791]方法进行。限制内切酶Sau3AI处理参照夏家辉等的方法(1994，遗传学报21(4)253-256)5.LA-PCR参照夏家辉等(1994，遗传学报21(4)253-256)人类染色体LA-PCR扩增时采用的连接接头与引物，与Sau3AI酶解的2Ai-2染色体DNA产物连接。
PCR扩增第一轮PCR扩增向蛋白酶处理后的染色体DNA溶液加入30μl PCR反应液，包括1.5pmol引物，0.5mM dNTP，3mM MgCl2，1XBuffer，1单位Taq DNA聚合酶。反应条件95℃，5分钟；96℃ 1分钟--62℃ 2分钟--72℃ 2分钟，30个循环。
第二轮PCR扩增取第一轮PCR扩增产物2μl做为第二轮扩增的模板，其它反应液组成与第一轮扩增相同，扩增反应条件如下94℃ 1分钟-55℃ 1.5分钟-72℃ 1分钟，一个循环。94℃ 1分钟--42℃2分钟--72℃2分钟，30-35个循环。第二轮扩增产物用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)纯化，供与载体pUC18连接使用。
6.DNA文库的构建LA-PCR扩增产物经纯化后与载体pUC18连接，将重组质粒转化到宿主E.coli DH5α内。-70℃保存。
按上述方法，我们在国际上首次采用染色体激光显微分离技术，获得中间偃麦草染色体2Ai-2，并构建了该染色体DNA文库。
(二)从构建的染色体DNA文库中筛选中间偃麦草特异基因片段分别以中间偃麦草及普通小麦品种中国春基因组DNA为探针进行常规的菌落原位杂交，筛选与中间偃麦草只有微弱杂交信号的克隆。通过RFLP分析，我们筛选出异附加系Z2、小麦品种宛7107(亲本)之间出现多态性的克隆pMAg139。
(三)pMAg139的基因序列分析提取pMAg139克隆质粒DNA，利用Pharmacia公司的DNA测序仪和由该公司提供的标准方法，对pMAg139进行了DNA序列测定，表明，pMAg139基因片段由804个碱基对组成，具体组成如图1所示。
利用BLAST2程序，进行GenBank检索，表明在植物基因组中没有与pMAg139同源的DNA序列，说明该基因片段在植物基因组中是首次发现。在哺乳动物基因组中(如人、鼠)，发现癌抑制基因P53与pMAg139有极高的同源性。癌抑制基因P53基因的cDNA由1179个碱基对组成，其中从第321对碱基到第1125对碱基区间与pMAg139具有99％的同源性。从氨基酸序列组成上看，pMAg139基因片段编码P53基因的DNA结合区域和C末端一部分区域(末端缺少18个氨基酸)。
在明确pMAg139的DNA序列的基础上，采用常规的5’-RACE和3’-RACE法，可以获得pMAg139编码的基因的5’端序列和3’端序列，在以它们为两端引物进行PCR扩增，可获得该基因的全部序列。将获得的完整基因序列整合到植物表达载体，可得到在植物体内表达的功能基因。
(四)pMAg139基因的克隆技术1、cDNA两端连接接头采用《分子克隆》(科学出版社，第二版，343～407)提供的方法，提取中间偃麦草mRNA，合成双链cDNA，并按下列程序在cDNA两端连接接头。
采用接头的序列如下其中包括BamHI酶切位点，5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGGGATCCCAGGT-3’AGGTCCA-P04-5’反应液组成 双链cDNA5μl(0.25～0.5μg)10μMcDNA接头2μl5倍连接酶2μlT4 DNA连接酶 1unit合计 10μl反应条件①16℃，过夜。
②70℃，5分钟热处理，使T4 DNA连接酶失活。
2.5’及3’RACE反应，明确P53类似基因两端的序列根据pMAg139的DNA序列设计、合成引物GSP-1 5’-AGTGC TCGCT TAGTG CTCCC-3’GSP-2 5’-GAGGC CCATC CTCAC CATCA T-3’5’端及3’端引物AP1序列(接头的部分序列)5’-CACTATAGGGCTCGAGCGGCCGGGATCCCAGGT-3’反应成分如下带有接头的cDNA 0.5～1pg10pmol/μl AP1 1μl10pmol/μl GSP1或GSP2 1μl10mM dNTP混合溶液 1μl10×Taq PCR缓冲液 5μl50×Advantage klen Taq Polymerase 1μldH2O 36μl合计 50μlPCR反应条件94℃ 1分钟 扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，采用promega公司提供的载体pGEM-T及由该公司提供的标准方法，将扩增产物克隆到pGEM-T上。
利用pharmacia公司的DNA测序仪和由该公司提供的标准方法，测定P53类似基因的两末端序列，并根据测序结果设计合成P53类似基因两端DNA序列5’GSP(5端引物)和3’GSP(3端引物)。以5’GSP，3’GSP为引物，带接头cDNA为模板进行PCR，即可获得完整的pMAg139基因。
反应液组成如下带有接头的双链cDNA 0.5-1pg10μM 5’GSP 1μl10μM 3’GSP 1μl10×Klen Tag PCR缓冲液 5μl50×Klen Taq聚合酶 1μl10mM dNTP混合液 1μldH2O36μl合计50μl反应条件 T依5’GSP，3’GSP序列组成而定。
3.将完整P53类似基因克隆到pBI121载体上，获得可表达的P53类似基因①限制性内切酶BamHI酶切用BamHI分别酶切载体pBI121、带接头cDNA。
酶切反应液成分载体pBI121质粒DNA(或cDNA)4μgBamHI缓冲液2μlBamHI 20unitdH2O Xμl总反应液 20μl反应条件37℃ 1小时。②外源DNA片段与载体分子数比为3∶1，载体用量约15ng/反应反应液组成载体DNA1μl(15ng)P53类似基因2μl(45ng)连接酶缓冲液 1μl连接酶 1μl反应条件16℃过夜。
4.用于遗传转化的感受态细胞制备及转化按《分子克隆》(科学出版社，第二版，49～55)提供的方法制备感受态细胞。
(五)将得到的pMAg139的基因转移植物基因组中受体材料的准备取授粉后12-14天的未成熟胚，在75％乙醇中浸泡30秒，0.1％升汞消毒10min。经无菌水3-5次冲洗后，接种于SD2培养基上形成胚性愈伤组织，作为基因枪转化的靶材料。
培养基诱导培养基为MS+Asp 150mg/L+2，4-D 2.0mg/L。分化培养基是1/2 MS+1.0mg/LK+0.5mg/L NAA。壮苗培养基是1/2MS无机盐类+VB11mg /L+0.5mg/L IAA+1.5mg/L多效唑+20％蔗糖+琼脂4.5g pH5.8。
基因枪转化在转化前4小时，将胚性愈伤组织块转移到高渗透压培养基(SD2培养基附加0.6M甘露醇，0.6M山梨醇)上，将50-60块愈伤组织放置在培养皿中央直径约2.5cm范围内。用目的基因包裹直径1.0μm金粉，采用PDS-1000/He基因枪(Bio-Rad公司生产)，选择可裂膜压力为1100Psi，靶材料至目的基因距离为6cm，按照该基因枪说明书所述过程对靶材料进行轰击。
转化体的筛选及植株的再生轰击后，愈伤组织在上述高渗培养基避光培养16小时，然后转到原培养基上恢复培养。2周后将愈伤组织转移到含1/2 MS+NAA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+4mg/L Basta筛选培养基上，在光照条件下诱导胚性愈伤组织的分化和植株的再生。3周后，将再生的小苗移植到含1/2MS+8mg/LBasta的培养基上生长。再生植株长到2-4cm后，移入壮苗培养基。
外源基因检测利用常规的外源基因检测技术对外源基因进行跟踪鉴定。结合接种病原菌，可筛选出具有抗病性的转基因植株。
表1. P53基因突变引起的肿瘤部位 肿瘤脑 星状胶细胞肿瘤、多形胶芽肿瘤、中枢神经原发恶性淋巴肿瘤头颈部 扁平上皮癌皮肤 黑色肿瘤、扁平上皮癌、基底细胞癌肺 腺癌、小细胞癌、扁平上皮癌、乳房 乳腺癌消化器系统 食道癌、胃癌、大肠癌、胆囊、胆管癌、肝癌内分泌系统 甲状腺癌、副肾皮质癌、泌尿系统 膀胱癌、尿管癌生殖器 前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫颈癌血液 各种白血病、恶性淋巴肿瘤引自多田光宏，池田润，细胞工学，1992，16(4)，519—52权利要求
1.一种细胞周期调节及细胞过敏性反应诱导基因，其特征在于该基因为pMAg139基因，由804个碱基对组成，其序列如图1。
全文摘要
一种细胞周期调节及细胞过敏性反应诱导基因,该基因为pMAg139基因,由804个碱基对组成,其序列如图。本发明获得的pMAg139基因,可能就是诱导小麦细胞体内产生过敏性反应的转录因子,可做为一种广谱抗病基因加以利用。将其导入当地主栽品种,可选育出抗锈病、抗黄化叶病毒病小麦新品种。由于抗病品种育成和推广,还可大量减少农药的使用,因此,该基因的应用,可产生巨大的经济和社会效益。
文档编号C07H21/00GK1342755SQ0012472
公开日2002年4月3日 申请日期2000年9月14日 优先权日2000年9月14日
发明者马有志, 辛志勇, 何聪芬, 陈孝, 张增艳, 李连城, 徐琼芳, 徐惠君, 林志珊, 叶兴国, 杜丽璞 申请人:中国农业科学院作物育种栽培研究所