专利名称：8－(苯胺基)－1－萘磺酸盐类似物及其在分析物的检测分析中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及染料组合物，尤其是适用于分析物检测分析如葡萄糖检测分析的染料组合物。
背景技术：
在当今的社会，在生理液体(如血液或血液衍生的产品)中分析物检测越来越重要。分析物的检测分析应用于各种用途，包括临床试验测试、家庭测试等，这些测试结果在各种疾病状态的诊断和治疗中起着重要的作用。感兴趣的分析物包括用于糖尿病治疗的葡萄糖、胆固醇等。为了响应分析物检测重要性的这种增加，已开发了各种临床和家庭用途的分析物检测方法和装置。
至今所开发的许多方法和装置用产生信号的系统来检测生理样品(如血液)中是否存在感兴趣分析物。例如，如今的一种葡萄糖检测系统所用的产生信号的系统包括葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、问-[3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙]N-磺酰基苯磺酸单钠(MBTHSB)和8-(苯胺基)-1-萘磺酸盐(ANS)。参见美国专利No.5,563,031。当存在氧气下葡萄糖与上述产生信号的系统结合时，就发生如下的反应
尽管用上述MBTHSB-ANS染料对已取得良好结果，该系统还有改进的余地。例如，由上述产生MBTHSB/ANS染料对信号的系统所产生的蓝色染料产物在分析的检测阶段的过程中有漂移，从而将最终导致结果的不精确性。
因此，依旧需要开发新型化合物用于分析物检测的产生信号的系统。特别令人感兴趣的是开发可以产生在检测过程中不会漂移的蓝色反应产物的ANS替代物。
相关文献感兴趣的专利包括4,935,346、4,962,040、5,453,360、5,563,031、5,776,719和5,922,530。同样感兴趣的是Kosower & Kanety，“分子内给体-受体体系.10.8-(苯基氨基)-1-萘磺酸盐的多种荧光”J.Am.Chem.Soc.(1983)1056236-6243。
发明概述本发明提供了ANS类似物及其使用方法。ANS类似物与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐(MBTH)或其类似物(如MBTHSB)反应，产生的反应产物与ANS和MBTH(或相同的MBTH类似物)的反应产物相比，漂移降低。本发明ANS类似物还有一个特点是在它们的苯基部分上存在至少一个非氢取代基。本发明的类似物可用于多种用途，且特别适用于分析物检测分析如葡萄糖的检测分析。
具体实施例描述本发明提供新型ANS类似物。本发明类似物的特点是在它们的苯基部分具有至少一个非氢的取代基。这种至少一个非氢取代基的存在使本发明类似物与MBTH(或其类似物)的反应产物漂移(如下定义)减低。同样，本发明提供了在分析物检测分析(如葡萄糖检测分析)中本发明ANS类似物的用法。在本发明的进一步描述中，将首先描述本发明的类似物，然后再讨论在分析物的检测分析中本发明的类似物的使用方法。
在进一步描述本发明的目的之前，应该理解本发明并不限于本发明以下的具体实施例，可以对具体实施例进行各种改变，且这些改变依旧在所附权利要求书的范围之内。还应理解所用的专用术语仅是对本发明具体实施例的描述并非限制。而且，本发明的范围由所附的权利要求书所限制。
在本发明的说明书和权利要求书中，除非明确指出，单数形式包括复数形式。除非特别指出，本文所用的所有技术和科学术语都是本发明所属领域技术人员通常所理解的含义。
ANS类似物本发明提供了新型ANS类似物。本发明的ANS类似物的特点为，存在氧化剂、过氧化物酶和氧时，它们与MBTH或其类似物反应产生显色的，尤其是漂移减低的蓝色反应产物。“漂移减低”指本发明ANS类似物与MBTH(或其类似物)结合产生的反应产物与ANS和MBTH(或相同的MBTH类似物)反应所观察到的读数漂移相比更稳定，所述的漂移是从反应起始2分钟时间内测定的。读数漂移测定的详细试验方法参见以下的试验部分。由本发明类似物所产生的反应产物的读数漂移通常减低约至少35％，较佳地约至少60％，在许多实施例中至少约80％。另外，由本发明类似物产生的反应产物所得到的颜色收率经常比在本发明许多实施例中用ANS所观察到的大，当颜色收率增加时，颜色收率可至少增加5％，通常增加至少20％，在许多实施例中增加至少约35％。按如下试验部分的试验方法测定颜色的收率。
本发明ANS类似物的特点是在其苯基部分具有至少一个非氢的取代基。苯基部分上的非氢取代基的数目范围可以为约1-5，通常为约1-3，更常为约1-2。可将任何合适的非氢取代基用作苯基上的取代基，只要得到的ANS类似物具有上述漂移减低的特性。一般而言，非氢取代基将减少由类似物与MBTH(或其类似物)产生的染料产物的聚集倾向。典型的非氢取代基包括烷基(取代的和/或支链的)、芳基(取代的或未取代的)、卤素、OR、SeR、SR和SiR3，其中R可以是取代的和/或支链的烷基或芳基。
特别令人感兴趣的是烷基取代基，尤其是1-6个碳原子，通常为1-4个碳原子的低级烷基取代基，这些烷基取代基可以是直链的或支链的。特别感兴趣的烷基取代基包括甲基、异丙基和叔丁基。
在一些实施例中，本发明的类似物还有如下限制即当苯基上的取代基是甲基时，其不能结合于苯基部分的3’、4’或5’位。
在许多实施例中，本发明的类似物为如下结构通式 其中n是1-5的整数，通常为1-3，更常为1-2；且各X分别为非氢取代基，合适的取代基包括上述那些取代基，在许多实施例中各X是烷基，通常为1-6个碳原子(常常为1-4个碳原子)的低级烷基，直链或支链。如上所述，在一些优选实施例中，各X是甲基、异丙基或叔丁基。在一些实施例中，如果X是甲基，则其不在苯基部分的3’、4’或5’位。
特别感兴趣的是以下ANS类似物8-(4’-叔丁基苯基)氨基-1-萘磺酸盐；8-(4’-异丙基苯基)氨基-1-萘磺酸盐；8-(2’-叔丁基苯基)氨基-1-萘磺酸盐；8-(3’，5’-二叔丁基苯基)氨基-1-萘磺酸盐；8-(4’-甲基苯基)氨基-1-萘磺酸盐；和8-(2’-甲基苯基)氨基-1-萘磺酸盐。
感兴趣的是以酸或盐形式的类似物，盐形式中的阳离子包括铵、钠、钾、钙、镁等。
可用简便试验方法制备本发明的上述ANS类似物，下文试验部分提供了典型合适的试验方法。
用途本发明的ANS化合物(酸或盐形式)可在各种不同的应用中作为指示剂以表明氧化剂的存在与否。换而言之，本发明的类似物可用作检测氧化剂存在与否的产生信号系统中的反应物部分。用含有本发明类似物的产生信号的系统可用于检测的氧化剂包括过氧化物如过氧化氢、氢过氧化枯烯、氢过氧化脲、过氧苯甲酰；过硼酸盐如过硼酸钠、过硼酸钾等。
本发明的类似物特别适用于作为试剂用于设计成检测样品中分析物存在与否的产生信号的系统，所述的样品通常为生理样品如血液或由全血衍生的血产品。用包括本发明类似物的产生信号的系统可检测的感兴趣分析物包括葡萄糖、胆固醇、尿酸、醇(如甲醇、乙醇)、甲醛、甘油-3-磷酸酯等。特别感兴趣的是在设计成检测生理样品(尤其是全血)中是否存在葡萄糖的产生信号的系统中使用本发明的类似物。
本发明类似物作为组成部分的产生信号的系统还包括氧化酶、过氧化物酶和染料对的第二部分(其中本发明的一种ANS类似物为第一部分)。这种产生信号系统中存在的氧化酶通常是依据待检测分析物的特性选择的，合适的氧化酶包括葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、尿酸酶、醇氧化酶、醛氧化酶、甘油磷酸酯氧化酶等。作为产生信号系统组成部分的过氧化物酶包括辣根过氧化物酶、其它具有过氧化物酶活性的酶和合成的类似物或氧化剂等。参见如Y.Ci.F.Wang；Analytica Chimica Acta，233(1990)，299-302。
产生信号系统染料对的第二个部分(其中本发明的类似物为第一部分)通常为MBTH或其类似物。合适的可用作产生信号系统组成部分的MBTH类似物包括美国专利No.5,922,530、5,776,719、5,563,031、5,453,360和4,960,040中所公开的MBTH类似物，本文将它们全部纳入作为参考。特别感兴趣的是以下MBTH类似物间[3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙]N-磺酰基苯磺酸单钠(MBTHSB)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐(MBTH)、3-甲基-6-(磺酸钠)苯并噻唑啉酮-2-腙、6-羟基-3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙、4-羟基-3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙和6-羧基-3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙。
在用本发明的类似物作为组成部分(如上所述即染料对的部分)的产生信号的系统检测分析物时，将怀疑含有感兴趣分析物(即靶分析物)的样品(通常为生理样品，如全血或血液衍生的产物)与产生信号系统的部分依次或同时接触。如果存在分析物则产生氧化物如过氧化氢，且上述产生信号系统的两种染料对部分的共价键合产生显色的反应产物。这种显色的反应产物通常为蓝色反应产物，其特点为如上所述的在某些分析结构(如SureStep分析结构)中漂移低。显色产物的存在与最初样品中分析物的存在相关，从而可以定量地或定性地确定最初样品中分析物的量。
含有本发明类似物的产生信号的系统特别适用于分析物的检测分析装置，其中产生信号系统的部分在多孔载体如带上，载体上可以放上样品并由此读取信号。可使用本发明类似物的典型装置包括如下文献所述的装置4,734,360、4,900,666、4,935,346、5,059,394、5,304,468、5,306,623、5,418,142、5,426,032、5,515,170、5,526,120、5,563,042、5,620,863、5,753,429、5,573,452、5,780,304、5,789,255、5,843,691、5,846,486等，本文将它们全部纳入作为参考。
以下实施例仅起说明作用，对本发明无任何限制。
实施例I.ANS类似物的合成A.4’-叔丁基ANS铵盐在Teflon容器中混合8-氨基-1-萘磺酸(1.53g)、4’-叔丁基苯胺(3.60g)和2，6-二乙基苯胺-HCl盐(0.95g)，用N2吹扫后将此容器密封。然后将此容器置于Parr高压气体储罐中，并将此储罐置于炉中，在165℃加热18小时。再搅拌此混合物，并加热15小时。反应完成后，在冰浴中冷却此储罐。将混合物转移到烧杯中，用乙酸乙酯溶解。有色谱法(填装硅胶60GF254的柱)纯化，用乙酸乙酯为洗脱液。制备4’-叔丁基ANS铵盐将4’-叔丁基ANS溶解于乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂中。将NH4OH水溶液加到此化合物中，蒸发掉溶剂得到浅黄色晶体。用乙醇漂洗此固态产物除去一些暗红色的杂质。
B.4’-异丙基ANS铵盐在Teflon容器中混合8-氨基-1-萘磺酸(1.53g)、4’-异丙基苯胺(3.60g)和2，6-二乙基苯胺-HCl盐(0.95g)，用N2吹扫后将此容器密封。然后将此容器置于Parr高压气体储罐中，并将此储罐置于炉中，在165℃加热18小时。再搅拌此混合物，并加热15小时。反应完成后，在冰浴中冷却此储罐。利用2-丙醇洗涤将混合物转移到烧杯中(通常，可以观察到大量晶体产物，其可以重结晶成相应的铵盐)。用色谱法(填装硅胶60GF254的柱)纯化，用乙酸乙酯为洗脱液。制备4’-异丙基ANS铵盐将4’-异丙基ANS溶解于乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂中。将NH4OH水溶液加到此化合物中，蒸发掉溶剂得到浅黄色晶体。用乙醇漂洗此固态产物除去一些暗红色的杂质。
C.2’-叔丁基ANS铵盐在Teflon容器中混合8-氨基-1-萘磺酸(1.53g)、2’-叔丁基苯胺(3.60g)和2，6-二乙基苯胺-HCl盐(0.95g)，用N2吹扫后将此容器密封。然后将此容器置于Parr高压气体储罐中，并将此储罐置于炉中，在195℃加热48小时。再搅拌此混合物，并加热48小时。反应完成后，在冰浴中冷却此反应物。将混合物转移到烧杯中，用乙酸乙酯溶解。层析(填装硅胶60GF254的柱)纯化，用乙酸乙酯为溶剂。制备2’-叔丁基ANS铵盐将2’-叔丁基ANS溶解于乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂中。将NH4OH水溶液加到此化合物中，蒸发掉溶剂得到浅黄色晶体。用乙醇漂洗此固态产物除去一些暗红色的杂质。
D.3’，5’-二叔丁基ANS铵盐在Teflon容器中混合8-氨基-1-萘磺酸(1.53g)、3’，5’-二-叔-丁基苯胺(3.80g)和2，6-二乙基苯胺-HCl盐(0.95g)，用N2吹扫后将此容器密封。然后将此容器置于Parr高压气体储罐中，并将此储罐置于炉中，在190℃加热24小时。再搅拌此混合物，并加热24小时。反应完成后，在冰浴中冷却此储罐。将混合物转移到烧杯中，用乙酸乙酯溶解。用色谱法(填装硅胶60GF254的柱)纯化，用乙酸乙酯为溶剂。制备(3’，5’-二叔丁基)ANS铵盐将(3’，5’-二叔丁基)ANS溶解于乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂中。将NH4OH水溶液加到此化合物中，蒸发掉溶剂得到浅黄色晶体。
II.对ANS类似物的测试如下试验以上合成的ANS类似物A.制备测试带将0.35μm聚砜膜(反应基质-获自U.S.Filter，San Diego，CA)的多孔面浸泡在表1所示的水溶液中至饱和。从浸泡液中取出，并用玻璃棒滗去过量的试剂。然后将此带悬挂在56℃循环空气的烘箱中约10分钟，然后取下此带，将其浸泡在表2所示的有机浸泡液中至饱和。然后再如上步骤干燥。将如此得到的带修整成测试所需的形状。
表1
表2
B.测试用SureStep带结构来测试葡萄糖应答。在35℃和50％相对湿度的环境室内进行测试。在改进的SureStep仪上收集反射率数据。一般将血液样品调节到120mg/dl葡萄糖的全血溶液。
表3
K/S＝K/S是反射的测定值，见美国专利4,935,346,14栏的所述和定义，本文将其纳入作为参考率。
Max.K/S＝2分钟测定中K/S的最大值。
％K/S＝[(类似物的Max K/S)/(ANS的Max K/S)×10060s K/S＝将血液加到带之后60秒于660nm测得的K/S％漂移＝[(K/SMax-60sK/S)/(K/S max)]×100III.结果发现当将本发明的ANS类似物用于上述II中的葡萄糖分析中，可以观察到与用ANS的系统相比，染料产物漂移降低。另外，与用ANS的系统相比颜色的收率增加。最后，发现4’-叔丁基ANS达到反应完成的速度比ANS或其它测试的ANS类似物都快。
由上述结果和讨论可以看出当用于还含有MBTH(或其类似物)的产生信号的系统时，与ANS相比本发明的ANS类似物具有许多优点。这些优点包括减低漂移和增加颜色收率。另外，本发明的类似物还比ANS适用于更广范围的MBTH类似物。因此，本发明为本领域提供了极大的贡献。
将所有本说明书所引用的出版物和专利都结合入本发明供参考，如同各出版物或专利都特别和单独指明是纳入参考的。引用的任何出版是在本申请日之前公开的，不应认为由于在先发明而本发明无权预料这样的出版内容。
虽然已用说明和实施例的方式详细描述了本发明从而可清楚理解，对本领域技术人员而言，在本发明的启示下可以进行一些变化和改进，而这些都不偏离所附权利要求的精神或范围。
权利要求
1.一种8-(苯胺基)-1-萘磺酸盐(ANS)类似物，其特征在于，它能与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐(MBTH)或其类似物反应产生染料产物，该染料产物与ANS和MBTH或其类似物反应产生相比染料产物相比漂移减少，所述的ANS类似物具有至少一个结合于苯基部分的烷基取代基，条件是当所述的取代基是甲基时，所述的取代基不在3’、4’或5’位。
2.如权利要求1所述的8-(苯胺基)-1-萘磺酸盐类似物，其特征在于，所述的烷基取代基含有1-6个碳原子。
3.如权利要求1所述的8-(苯胺基)-1-萘磺酸盐类似物，其特征在于，所述的烷基取代基是支链的。
4.如权利要求1所述的8-(苯胺基)-1-萘磺酸盐类似物，其特征在于，所述的烷基取代基是直链的。
5.一种下式的化合物或其盐 其特征在于，其中n为1-5；和X各自是含有1-6个碳原子的烷基，条件是当X在3’、4’或5’位时，X不是甲基。
6.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述的n为1或2。
7.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述的烷基是直链的。
8.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述的烷基是支链的。
9.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述的烷基是甲基、异丙基或叔丁基。
10.一种下式的化合物或其盐 其特征在于，其中n是1或2；和X各自是选自甲基、异丙基和叔丁基的烷基，条件是当X在3’、4’或5’位时，X不是甲基。
11.如权利要求10所述的化合物，其特征在于，所述的n为1。
12.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，所述的X是2’甲基。
13.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，所述的X是4’叔丁基。
14.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，所述的X是4’异丙基。
15.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，所述的X是2’叔丁基。
16.如权利要求10所述的化合物，其特征在于，所述的n为2。
17.如权利要求16所述的化合物，其特征在于，所述的第一个X为3’叔丁基，第二个X为5’叔丁基。
18.由苯基部分上具有至少一个非氢取代基的8-(苯胺基)-1-萘磺酸盐(ANS)类似物和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐(MBTH)或BMTH类似物反应产生的反应产物，其特征在于，所述的反应产物与ANS和MBTH或MBTH类似物反应所产生的反应产物相比漂移降低。
19.如权利要求18所述的反应产物，其特征在于，所述8-(苯胺基)-1-萘磺酸盐类似物的所述取代基是烷基。
20.如权利要求19所述的反应产物，其特征在于，所述的反应产物是所述的ANS类似物与MBTHSB的反应产物。
21.存在氧、氧化剂和过氧化物酶时3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐或其类似物与8-(苯胺基)-1-萘磺酸盐类似物反应所产生的化合物，其特征在于，所述的ANS类似物的结构式如下 其中n为1-5；和X各自是非氢取代基。
22.如权利要求21所述的化合物，其特征在于，所述的X是烷基。
23.如权利要求22所述的化合物，其特征在于，所述的烷基含有1-6个碳原子。
24.如权利要求23所述的化合物，其特征在于，所述的烷基是甲基、异丙基或叔丁基。
25.含有权利要求18所述的反应产物的组合物。
26.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述的反应产物是在多孔基质上存在的。
27.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述的多孔基质是带。
28.一种组合物，其特征在于，它含有3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐或其类似物；和下式的8-(苯胺基)-1-萘磺酸盐类似物或其盐 其中n为1-5；和X各自是非氢取代基。
29.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述的8-(苯胺基)-1-萘磺酸盐类似物和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐或其类似物是在多孔基质上存在的。
30.如权利要求29所述的组合物，其特征在于，所述的多孔基质是带。
31.如权利要求29所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有氧化酶和过氧化物酶。
32.一种产生显色反应产物的方法，其特征在于，所述的方法包括存在氧、过氧化氢和过氧化物酶时，将下式的化合物或其盐与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐或其类似物反应 其中n为1-5；和X是非氢取代基。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述的n是1-2。
34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述的X是含有1-6个碳原子的烷基。
35.一种检测样品中分析物存在与否的方法，其特征在于，所述的方法使用含有3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐或其类似物和第二种染料化合物的染料对，其中的改进包括所使用的第二种染料化合物为下式的化合物或其盐 其中n为1-5；和X是非氢取代基。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述的X是含有1-6个碳原子的烷基。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，n是1或2。
38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述的分析物是葡萄糖。
全文摘要
公开了8－(苯胺基)－1－萘磺酸盐(ANS)类似物及其在分析物的检测分析中的用法。本发明的ANS类似物的特点是在其苯基部分上具有至少一个非氢取代基，而且与3－甲基－2－苯并噻唑啉酮腙盐酸盐(MBTH)或其类似物如MBTHSB产生的产物反应表现出漂移降低。在一些优选实施例中，本发明的ANS类似物如式(I)所示，其中n是1－5，且X是非氢取代基。本发明的ANS有各种应用，尤其可用于分析物检测分析中，如葡萄糖的检测分析。
文档编号C07C309/47GK1413235SQ00814721
公开日2003年4月23日 申请日期2000年10月17日 优先权日1999年10月27日
发明者郑小玲, Y·S·余, A·雅尼, P·C·黄 申请人:生命扫描有限公司