新分子探针的制作方法

专利名称：新分子探针的制作方法
专利说明新分子探针 发明领域 本发明涉及用于检测、表征、定位和分离γ-分泌酶的新分子探针。

背景技术：
阿耳茨海默氏病(AD)是一种进行性的、神经变性的疾病，其临床特征是记忆力、认知力、推理力、判断力和情绪稳定性的进行性缺失。AD是人类痴呆的普通原因，并且在美国是导致死亡的主要原因。已经在世界范围内的种族(races)和民族(ethnic groups)中对AD进行了观察，并且AD呈现为全世界的主要公共卫生问题。目前无法获得有效地防止AD或逆转临床症状和基本病理生理学的治疗手段，并且专家认为目前该疾病是不能治愈的。
AD的组织病理学表现为特征损伤(characteristic lesions)，称为淀粉样蛋白斑(或老年斑)和神经原纤维缠结，它们出现在大脑中与记忆力、推理和认知相关的区域中。在患有21三体综合征(唐氏综合征)和Dutch型遗传性脑出血伴淀粉样变的患者中观察到类似的变更。
淀粉样蛋白斑的主要组分是淀粉样β蛋白。淀粉样β蛋白源于淀粉样前体蛋白(APP)的溶蛋白性切割。将APP加工成淀粉样β蛋白和其它APP碎片的过程由一组称为分泌酶的酶支配。一类分泌酶——γ-分泌酶是引起蛋白质切割的原因，而蛋白质切割产生淀粉样β蛋白。
迄今，仅部分表征了γ-分泌酶复合体的性质。认为它是至少4种蛋白质的复合体早老因子1(PS1)，其主要为通过全长多肽的内切蛋白酶解而产生的N-和C-末端片段的异二聚体，呆蛋白(nicastrin)、APH-1和PEN-2。目前需要开发用于研究γ-分泌酶的生化同一性的可靠和坚固的分子探针，并表征酶复合体的相互作用。
申请人:通过开发用于解释γ-分泌酶分子机理的新分子探针已经满足了这种需要。


发明内容
因此，本发明的第一实施方式中，提供式I的化合物
其中 R1选自间苯甲酰基(m-benzoyl)、对苯甲酰基(p-benzoyl)或对叠氮基(p-azido)； R2独立地选自H、-CH3、

或
R3独立地选自H或
其中n为2或3；并且R4选自

或
本发明另一实施方式的化合物选自
本发明另一实施方式的化合物选自 N-[5-({[(2R，3R)-3-({N-[(3-苯甲酰苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基}氨基)-2-苯基-3，4-二氢-1，5-苯并氧氮杂-5(2H)-基]乙酰基}氨基)戊基]-4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰胺 (N-[5-({[(2R，3R)-3-({N-[(3-benzoylphenyl)acetyl]-L-alanyl}amino)-2-phenyl-3，4-dihydro-1，5-benzoxazepin-5(2H)-yl]acetyl}amino)pentyl]-4-[(3aS，4S，6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3，4-d]imidazol-4-yl]butanamide)； N1-[(2R，3R)-5-(2-氧代-2-{[5-({4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰基}氨基)戊基]氨基}乙基)-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-3-基]-N2-[(4-三氮杂-1，2-二烯-2--1-基苯基)乙酰基]-L-丙氨酰胺 (N1-[(2R，3R)-5-(2-oxo-2-{[5-({4-[(3aS，4S，6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3，4-d]imidazol-4-yl]butanoyl}amino)pentyl]amino}ethyl)-2-phenyl-2，3，4，5-tetrahydro-1，5-benzoxazepin-3-yl]-N2-[(4-triaza-1，2-dien-2-ium-1-ylphenyl)acetyl]-L-alaninamide)； N-[5-({[(2S，3S)-3-({N-[(3-苯甲酰苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基}氨基)-2-苯基-3，4-二氢-1，5-苯并氧氮杂-5(2H)-基]乙酰基}氨基)戊基]-4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d)咪唑-4-基]丁酰胺； N1-[(2S，3S)-5-(2-氧代-2-{[5-({4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰基}氨基)戊基]氨基}乙基)-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-3-基]-N2-[(4-三氮杂-1，2-二烯-2--1-基苯基)乙酰基]-L-丙氨酰胺； N-(5-{[(2R，3R)-3-({N-[(3-苯甲酰苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基}氨基)-5-甲基-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-7-基]氧}戊基)-4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰胺； N1-((2R，3R)-5-甲基-7-{[5-({4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰基}氨基)戊基]氧}-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-3-基)-N2-[(4-三氮杂-1，2-二烯-2--1-基苯基)乙酰基]-L-丙氨酰胺； N-(5-{[(2S，3S)-3-({N-[(3-苯甲酰苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基}氨基)-5-甲基-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-7-基]氧}戊基)-4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰胺； N1-((2S，3S)-5-甲基-7-{[5-({4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰基}氨基)戊基]氧}-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-3-基)-N2-[(4-三氮杂-1，2-二烯-2--1-基苯基)乙酰基]-L-丙氨酰胺。
该部分中阐述的定义意图阐明遍及本申请所使用的术语。术语“本申请”是指整个申请。
当任何变量(例如R1、R7、Ra、Re等)在化合物的任何组分或通式中出现不止一次时，每次出现时，它的定义是各自独立的。因此，例如如果示出一个基团被0-3个R1取代，那么所述基团可任选地被0、1、2或3个R1基团取代，Re每次出现时独立地选自Re的定义。而且，取代基和/或变量的组合是容许的，只要这种组合得到稳定的化合物。
本申请所述的化合物可具有不对称中心。含有不对称取代原子的本发明化合物可以分离为旋光形式或外消旋形式。本领域熟知如何制备旋光形式，例如通过拆分外消旋形式或由旋光原料合成来制备。当需要时，可使用本领域已知的方法分离外消旋物质。烯烃、C＝N双键等的多种几何异构体也可存在于本申请所述的化合物中，并且所有这种稳定的异构体都包括在本发明中。描述了本发明化合物的顺式和反式几何异构体，并且可将它们作为异构体的混合物或作为分开的异构形式分离。除非特别说明具体的立体化学或异构体形式，意图包括结构的所有手性形式、非对映异构形式、外消旋形式和所有几何异构体形式。
当连接到取代基的键显示为穿过连接环中两个原子的键时，那么该取代基可连接到环上的任何原子。当列出了取代基，而没有指明该取代基通过哪个原子连接到给定通式化合物的剩余部分时，那么该取代基可通过该取代基中的任何原子连接。取代基和/或变量的组合也是容许的，只要这种组合得到稳定的化合物。
可以利用有机合成领域的技术人员熟知的许多方法制备本发明的化合物。可使用下述方法以及合成有机化学领域中已知的合成方法，或本领域技术人员所理解的这些方法的变化形式，来合成本发明的化合物。这种方法包括但不限于下述那些方法。在此引入所引用的所有参考文献的全部内容，作为参考。
可使用本申请中所述的反应和技术制备本发明的新化合物。该反应在适合于所用试剂和物质的溶剂中进行，并且适合于进行的转化。而且，在以下所述的合成方法的描述中，应该理解，所有提出的反应条件，包括溶剂、反应气氛、反应温度、实验和操作过程的持续时间的选择，被选择为该反应的标准条件，本领域技术人员应该容易地确定这些条件。有机合成领域的技术人员应该理解，该分子的各种位置上出现的官能团必须与提出的试剂和反应相容。这种对取代基要与反应条件相容的限制对于本领域技术人员将是明显的，然后必须使用替代的方法。
以下借助实施例说明本发明，但是不限于此。
缩写 溶剂/试剂缩写 DCM 二氯甲烷 HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基六氟磷酸盐 PyAOP {7-氮杂苯并三唑-1-基氧三(吡咯烷子基)六氟磷酸盐 HOBt 羟基苯并三唑(Hydroxybenenetriazole) Et3N 三乙胺 i-Pr2EtN 二异丙基乙基胺 NMM N-甲基吗啉 MeCN 乙腈 DMF N，N-二甲基甲酰胺 EtOAc 乙酸乙酯 Et2O 乙醚 THF 四氢呋喃 TFA 三氟乙酸 BOC N-叔丁氧羰基 CBZ 苄氧羰基(carbobenzyloxy) DBU 1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯 DIEA N，N-二异丙基乙基胺 EDAC-HCl 1-乙基-3-(二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐 NMM N-甲基吗啉 p-TSA 对甲苯磺酸 TBAB 溴化四丁铵 Ether 乙醚 Tos-Cl对甲苯磺酰氯 “min.”表示分钟；“h”表示小时；“RT”表示室温。
实验步骤 除非另外指出，有机溶液经无水硫酸钠“干燥”。
HPLC方法APhenomenex Luna 3μC18(2)，4.6×75mm柱。溶剂A＝含0.1％TFA的H2O，B＝含0.1％TFA的乙腈。流速2.0mL/min。20％B直到0.5min，然后第3min时线性梯度至95％B。保持95％B直到第6min。
HPLC方法BPhenomenex Luna 3μC18(2)，4.6×75mm柱。溶剂A＝含0.1％TFA的H2O，B＝含0.1％TFA的乙腈。流速2.0mL/min。第5min时线性梯度从10％至95％B。保持95％B直到第7min。
HPLC方法C5μSB-C8柱2.1mm×5cm。溶剂A＝含0.05％TFA的H2O，B＝10％H2O，90％乙腈，0.05％TFA。流速1.4mL/min。梯度(5-90％B历时5min，90％B保持2min)。
HPLC方法DAgilent Zorbax 5μ SB-C8柱2.1mm×5cm。溶剂A＝含0.1％TFA的H2O，B＝含0.1％TFA的乙腈。流速1.4mL/min。第3min时线性梯度从9％至81％B。然后第4min时线性梯度至95％B。保持95％B直到第4.5min。
HPLC方法EAgilent Zorbax 5μSB-C8柱2.1mm×5cm。溶剂A＝含0.05％TFA的H2O，B＝90％乙腈，10％H2O，0.05％TFA。流速1.4mL/min。历时12分钟线性梯度从15％至90％B。
LC/MSHPLC方法Agilent Zorbax 5μSB-C8柱2.1mm×5cm。溶剂A＝含0.05％TFA的H2O，B＝10％H2O，90％乙腈，0.05％TFA。梯度历时3分钟从10％至90％B，第4min保持90％B，第5min时B为10％，并且保持在10％B直到第6min。
除非另外指出，使用10g填充聚丙烯的筒(Supelco part#57134A)用DCM∶MeOH的不连续梯度(用DCM开始洗脱，然后加入MeOH，100∶150∶120∶1)，操作快速柱色谱(fcc＝快速柱色谱)。
使用Gilson制备型色谱体系纯化制备型反相液相色谱-研究样品。使用Hewlett Packard CombiHT SB-C18半制备柱(5μm，21.2mm×150mm；part#870150-902 KJ1018)或Modcol C18制备柱(10μm，50.8mm×250mm；part#PA000-050025)纯化样品。流速半制备柱(20mL/min)，制备柱(50-80mL/min)。洗脱液由MeCN/H2O改性的w/0.1％TFA的混合物组成。
通常的顺序包括 a)平衡(在初始梯度浓度进行3min) b)梯度(从40-50％MeCN开始，历时7-15分钟达到90％MeCN) c)冲洗(在90％MeCN进行5min) *除非另外指出，如果存在胺，则将产物在纯化之后转化成游离碱--为了除去残留的TFA，将纯化的产物溶于20％的K2CO3水溶液中，并用DCM萃取。有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压蒸发溶剂。将产物在高真空抽吸18小时。
LC/MSHPLC方法Agilent Zorbax 5μ SB-C8柱2.1mm×5cm。溶剂A＝含0.05％TFA的H2O，B＝10％H2O，90％乙腈，0.05％TFA。梯度历时3分钟从10％至90％B。第4min保持B为90％，第5min时10％B，并且保持在10％B直到第6min。分子离子是M+，或者另外指出。对于每个化合物在实验阶段结束时，给出LC/MS保留时间(分钟)作为表征数据的一部分。
分子探针
实施例15-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[2-((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(3-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-酰胺(1) 在N2气氛下，向5-((3aS，4S，6aR)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)-戊酸(5-{2-[(6R，7S)-7-((S)-2-氨基-丙酰氨基)-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂苯并环庚烯-9-基]-乙酰氨基}-戊基)-酰胺(1h)(66mg，0.096mmol)的DMF(2mL)冷溶液(0℃)中，加入间苯甲酰基苯乙酸(使用类似于J.A. Zderic，J.Org.Chem.，1961，26，635所述的步骤，由间甲基二苯甲酮制备)(24mg，0.100mmol)、HOBt(19mg，0.140mmol)、i-Pr2EtN(40μL，0.230mmol)和EDAC-HCl(27mg，0.141mmol)。将该混合物在环境温度搅拌过夜，用EtOAc(30mL)稀释，然后用20％K2CO3水溶液、H2O(3×20mL)和盐水萃取。干燥(Na2SO4)有机溶液，过滤并蒸发。用制备型RPHPLC纯化残余物，得到46mg(52％)灰白色固体。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ8.06-7.03(m，18H)，5.63(d，J＝7.1Hz，1H)，5.21-5.09(m，1H)，4.65和4.38(AB，J＝16Hz，2H)，4.45(dd，J＝7.7，4.7Hz，1H)，4.26(dd，J＝7.9，4.4Hz，1H)，4.21(q，J＝6.9Hz，1H)，3.55(s，2H)，3.26-3.04(m，5H)，2.89(dd，J＝12.7，4.9Hz，1H)，2.67(d，J＝12.7Hz，1H)，2.15(t，J＝7.2Hz，2H)，1.81-1.25(m，12H)，1.20(d，J＝7.2Hz，3H).MS APCI，m/z＝916(M+).LC/MS2.33min.HRMS(TOF ES+)C50H57N7O8S(M+H)的计算值916.4067，实测值916.4061. 如下制备原料(1h)
(6R，7S)-7-氨基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂苯并环庚烯-8-酮盐酸盐(1a)如专利申请AZ WO2004031154A1中所述制备。

((6R，7S)-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸叔丁酯(1b)向(6R，7S)-7-氨基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂苯并环庚烯-8-酮(1a)(745mg，2.56mmol)在DCM(40mL)中冷却至0℃的浆料中，加入Et3N(720μL，5.17mmol)，接着加入二碳酸二叔丁酯(560mg，2.56mmol)。将反应物在环境温度搅拌过夜，用60mL DCM稀释，用H2O(2×50mL)、饱和NaHCO3水溶液和盐水萃取。干燥(Na2SO4)有机层，过滤，并真空除去溶剂，得到固体(870mg，96％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.57(s，1H)，7.49-7.31(m，4H)，7.31-7.11(m，4H)，7.09-7.01(m，1H)，5.76(d，J＝6.4Hz，1H)，5.01(t，J＝7.3Hz，1H)，4.94(d，J＝7.7Hz，1H)，1.39(s，9H)；MSES+，m/z＝377(M+Na+).LC/MS2.34min.
((6R，7S)-7-叔丁氧羰基氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂苯并环庚烯-9-基)-乙酸甲酯(1c)将((6R，7S)-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸叔丁酯(1b)(349mg，0.985mmol)在10mL DMF中的溶液与粉末状Cs2CO3一起搅拌15分钟。向其中加入溴乙酸甲酯(110μL，1.16mmol)，并将反应混合物搅拌24h。此时，用EtOAc(100mL)稀释反应物，用H2O(4×50mL)、20％K2CO3水溶液和盐水萃取。干燥(Na2SO4)有机层，过滤，并真空除去溶剂。在二氧化硅上通过fcc(DCM∶EtOAc洗脱液)纯化粗产物(透明油状物)，得到白色泡沫(383mg，91％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.50-7.31(m，5H)，7.31-7.15(m，4H)，5.70(d，J＝7.0Hz，1H)，5.02(t，J＝7.4Hz，1H)，4.92(d，J＝7.6Hz，1H)，4.69和4.54(AB，J＝17.2Hz，2H)，3.79(s，3H)，1.38(s，9H)；MS ES+，m/z＝327(M+H-100).LC/MS2.51min。

((6R，7S)-7-叔丁氧羰基氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂苯并环庚烯-9-基)-乙酸(1d)向搅拌着的((6R，7S)-7-叔丁氧羰基氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂苯并环庚烯-9-基)-乙酸甲酯(1c)(1.10g，2.57mmol)在THF(27mL)中的溶液中，加入氢氧化锂水溶液(0.6M，9mL)，接着加入3mL MeOH。将该混合物在RT搅拌1h，用0.5mL HOAc猝灭(quenched)，蒸发THF，用几滴1N HCl酸化含水残余物，然后用DCM(3×30mL)萃取。干燥(Na2SO4)有机层，过滤，并真空除去溶剂，得到白色泡沫(1.08g，基本上是定量的)，所述白色泡沫不经过进一步纯化而使用。1NMR(300.132MHz，CDCl3)δ9.14(br s，1H)，7.52-7.13(m，9H)，5.70(d，J＝6.9Hz，1H)，5.03(t，J＝7.4Hz，1H)，4.94(d，J＝7.8Hz，1H)，4.72(d，J＝17.5Hz，1H)，4.54(d，J＝17.5Hz，1H)，1.41-1.33(m，9H)；MS APCI，m/z＝413(M+H).LC/MS2.24min.
[(6R，7S)-8-氧代-9-({5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊基氨基甲酰基}-甲基)-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-氨基甲酸叔丁酯(1e) 在N2气氛下，向((6R，7S)-7-叔丁氧羰基氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸(1d)(445mg，1.08mmol)和5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸(5-氨基-戊基)-酰胺(1j)(355mg，1.08mmol)在DMF(10mL)中的冷溶液(0℃)中，加入HOBt(178mg，1.32mmol)、N-甲基吗啉(170μL，1.56mmol)和EDAC-HCl(260mg，1.36mmol)。将该混合物在环境温度搅拌5h，用EtOAc(200mL)稀释，用20％K2CO3水溶液、H2O和盐水萃取。干燥(Na2SO4)有机溶液，过滤，并蒸发，得到固体产物，在二氧化硅上通过fcc纯化该固体产物(198mg，25％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.50-7.18(m，9H)，6.94-6.76(m，1H)，6.09-5.98(m，1H)，5.96(s，1H)，5.67(d，J＝7.2Hz，1H)，5.21(s，1H)，5.00(t，J＝7.7Hz，1H)，4.84(d，J＝7.9Hz，1H)，4.62和4.48(AB，J＝16.2Hz，2H)，4.55-4.41(m，1H)，4.35-4.23(m，1H)，3.37-3.02(m，6H)，2.89(dd，J＝12.8，4.8Hz，1H)，2.70(d，J＝12.7Hz，1H)，2.11(t，J＝6.7Hz，2H)，1.80-1.55(m，6H)，1.53-1.15(m，3H)，1.36(s，9H)；MS APCI，m/z＝723(M+).LC/MS2.12min.
5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[2-((6R，7S)-7-氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-酰胺(1f) 使用类似于实施例(1h)中描述的步骤，所不同的是使用[(6R，7S)-8-氧代-9-({5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊基氨基甲酰基}-甲基)-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-氨基甲酸叔丁酯(1e)(198mg，0.274mmol)作为原料，得到标题化合物(1f)(158mg，93％)，其不经过进一步纯化而使用。1H NMR(300.132MHz，DMSO)δ7.98(t，J＝5.4Hz，1H)，7.69(t，J＝4.9Hz，1H)，7.52-7.16(m，9H)，6.38(s，1H)，6.32(s，1H)，5.38(d，J＝6.9Hz，1H)，4.57和4.25(AB，J＝16.2Hz，2H)，4.34-4.24(m，1H)，4.17-4.08(m，1H)，4.05-3.94(m，1H)，3.17-2.91(m，5H)，2.81(dd，J＝12.4，5.0Hz，1H)，2.57(d，J＝12.4Hz，1H)，2.03(t，J＝7.3Hz，2H)，1.70-1.07(m，14H)；MS APCI，m/z＝623(M+).LC/MS1.44min.
{(S)-1-[(6R，7S)-8-氧代-9-({5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊基氨基甲酰基}-甲基)-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基氨基甲酰基]-乙基}-氨基甲酸叔丁酯(1g) 在N2气氛下，向5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[2-((6R，7S)-7-氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-酰胺(1f)(141mg，0.227mmol)在DMF(5mL)中的冷溶液(0℃)中，加入N-(叔丁氧羰基)-L-丙氨酸(44mg，0.234mmol)、HOBt(40mg，0.297mmol)、i-Pr2EtN(130μL，0.746mmol)和EDAC-HCl(50mg，0.258mmol)。将该混合物在环境温度搅拌过夜，用EtOAc(30mL)稀释，然后用20％K2CO3水溶液、H2O和盐水萃取。干燥(Na2SO4)有机溶液，过滤，并蒸发，得到白色固体(138mg，77％)。1H NMR(300.132MHz，DMSO)δ8.08(t，J＝5.2Hz，1H)，7.70(t，J＝5.4Hz，1H)，7.49-7.24(m，9H)，7.14(d，J＝5.9Hz，1H)，6.96(d，J＝5.4Hz，1H)，6.38(s，1H)，6.38(s，1H)，5.58(d，J＝6.9Hz，1H)，4.98(t，J＝6.9Hz，1H)，4.56(d，J＝16.4Hz，1H)，4.41-4.20(m，2H)，4.18-4.04(m，1H)，3.85(t，J＝6.8Hz，1H)，3.14-2.93(m，5H)，2.81(dd，J＝12.4，5.0Hz，1H)，2.57(d，J＝12.4Hz，1H)，2.04(t，J＝7.3Hz，2H)，1.72-1.13(m，11H)，1.32(s，9H)，1.06 (d，J＝7.2Hz，3H)；MS APCI，m/z＝794(M+).LC/MS1.99min.
5-((3aS，4S，6aR)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)-戊酸(5-{2-[(6R，7S)-7-((S)-2-氨基-丙酰氨基)-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基]-乙酰氨基}-戊基)-酰胺(1h) 向{(S)-1-[(6R，7S)-8-氧代-9-({5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊基氨基甲酰基}-甲基)-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基氨基甲酰基]-乙基}-氨基甲酸叔丁酯(1g)在10mL DCM中冷却至0℃的溶液中，加入TFA(2mL)。将该混合物升温至室温，搅拌30分钟，蒸发溶剂/TFA，将残余物与20％K2CO3水溶液混合，并用EtOAc∶MeOH(25∶1，3x)萃取。干燥(Na2SO4)萃取液，过滤，并蒸发，得到白色固体(120mg，99％)。1H NMR(300.132MHz，DMSO)δ8.14(t，J＝5.2Hz，1H)，7.86-7.58(m，2H)，7.51-7.21(m，9H)，6.43(s，1H)，6.36(s，1H)，5.58(d，J＝7.0Hz，1H)，5.08-4.83(m，1H)，4.61(d，J＝16.4Hz，1H)，4.37-4.20(m，2H)，4.18-4.06(m，2H)，3.25-2.91(m，6H)，2.81(dd，J＝12.5，5.1Hz，1H)，2.56(d，J＝12.5Hz，1H)，2.04(t，J＝7.2Hz，2H)，1.74-1.11(m，14H)，1.04(d，J＝6.8Hz，3H).MS APCI，m/z＝694(M+).LC/MS1.48min. 生物素化的戊胺
{5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊基}-氨基甲酸叔丁酯(1i)用Tachibana，K.在Tetrahedron，2000，56，9003中所述的方法制备。

5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸(5-氨基-戊基)-酰胺(1j) 向{5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊基}-氨基甲酸叔丁酯(1i)(860mg，2.00mmol)在25mL DCM中的溶液中加入TFA(4mL)。将该混合物搅拌2h，蒸发溶剂/TFA，在高真空下抽吸残余物1小时。将粗产物溶于30mL 5∶1 DCM∶MeOH中，加入4.65g(2.34mmol)Si-胺(Silicycle衍生化的硅胶，part#R52030B，装载量1.99mmol/g)，并将混合物搅拌2h。过滤混合物，用DCM洗涤二氧化硅，真空浓缩滤液，得到半固体。将该产物与10mL MeCN混合，并静置1h，此时发生结晶。过滤收集产物，并用冷MeCN(3×5mL)洗涤，得到白色固体(583mg，89％)。1HNMR(300.132MHz，MeOH)δ7.94(s，1H)，4.49(dd，J＝7.9，4.9Hz，1H)，4.30(dd，J＝7.8，4.5Hz，1H)，3.26-3.13(m，3H)，2.99-2.86(m，3H)，2.70(d，J＝12.7Hz，1H)，2.20(t，J＝7.3Hz，2H)，1.81-1.32(m，12H)；MS ES+，m/z＝329(M+H).LC/MS0.57min.
实施例25-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[2-((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(4-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-酰胺(2) 使用类似于实施例(1)的步骤，所不同的是使用对苯甲酰基苯乙酸(使用J.A.Zderic，J.Org.Chem.，1961，26，1635描述的步骤，由对甲基二苯甲酮制备)(24mg，0.100mmol)作为酸组分，用制备型RPHPLC分离标题化合物，得到灰白色固体的标题化合物(2)(48mg，53％)。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.76(d，J＝7.0Hz，2H)，7.72(d，J＝8.2Hz，2H)，7.64(t，J＝7.4Hz，1H)，7.52(t，J＝7.5Hz，2H)，7.47-7.26(m，10H)，7.21(d，J＝7.1Hz，1H)，5.66(d，J＝7.1Hz，1H)，5.27-5.07(m，1H)，4.67(d，J＝16.4Hz，1H)，4.45(dd，J＝7.8，5.0Hz，1H)，4.38(d，J＝16.4Hz，1H)，4.31-4.18(m，2H)，3.58(s，2H)，3.21(t，J＝6.8Hz，2H)，3.17-3.09(m，3H)，2.90(dd，J＝12.8，4.9Hz，1H)，2.67(d，J＝12.7Hz，1H)，2.16(t，J＝7.2Hz，2H)，1.81-1.18(m，12H)，1.23(d，J＝7.2Hz，3H)；MSAPCI，m/z＝916(M+).LC/MS2.31min.HRMS(TOF ES+)C50H57N7O8S(M+H)的计算值916.4067，实测值916.4069.
实施例35-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[2-((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(4-叠氮基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-酰胺(3) 使用类似于实施例(1)中描述的步骤，所不同的是使用对叠氮基苯乙酸(使用R.Seyer，J.Med.Chem.，1994，37，1841描述的步骤，由对氨基苯乙酸制备)(20mg，0.113mmol)作为酸组分，用制备型RPHPLC分离标题化合物，得到灰白色固体的标题化合物(3)(68mg，74％)。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.47-7.30(m，9H)，7.27(d，J＝8.4Hz，2H)，6.99(d，J＝8.4Hz，2H)，5.65(d，J＝7.1Hz，1H)，5.16(d，J＝7.1Hz，1H)，4.69和4.39(AB，J＝16.4Hz，2H)，4.46(dd，J＝7.8，4.8Hz，1H)，4.27(dd，J＝7.9，4.5Hz，1H)，4.20(q，J＝7.2Hz，1H)，3.45(s，2H)，3.30-3.05(m，6H)，2.90(dd，J＝12.7，5.0Hz，1H)，2.68(d，J＝12.7Hz，1H)，2.16(t，J＝7.2Hz，2H)，1.82-1.26(m，14H)，1.20(d，J＝7.2Hz，3H)；MSAPCI，m/z＝853(M+).LC/MS2.25min.HRMS(TOF ES+)C43H52N10O7S(M+H)的计算值853.3819，实测值853.3823.
实施例45-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[2-((6S，7R)-7-{(S)-2-[2-(3-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-酰胺(4) 在N2气氛下，向5-((3aS，4S，6aR)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)-戊酸(5-{2-[(6S，7R)-7-((S)-2-氨基-丙酰氨基)-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基]-乙酰氨基}-戊基)-酰胺(4k)(76mg，0.109mmol)在7.5mL DCM∶MeCN(2∶1)中的溶液中，加入间苯甲酰基苯乙酸(25.9mg，0.108mmol)、HATU(118mg，0.310mmol)和i-Pr2EtN(105μL，0.603mmol)。将该反应混合物在环境温度搅拌过夜。蒸发溶剂，并用制备型RPHPLC纯化残余物，得到54mg(54％)灰白色固体。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.83-7.71(m，2H)，7.69-7.58(m，3H)，7.56-7.26(m，13H)，7.11(d，J＝7.1Hz，1H)，5.64(d，J＝7.2Hz，1H)，5.23-5.15(m，1H)，4.68和4.36(AB，J＝16.4Hz，1H)，4.45(dd，J＝7.6，4.8Hz，1H)，4.31-4.20(m，2H)，3.51(s，2H)，3.22(t，J＝6.9Hz，2H)，3.19-3.14(m，1H)，3.13(t，J＝6.8Hz，2H)，2.89(dd，J＝12.8，5.0Hz，1H)，2.67(d，J＝12.7Hz，1H)，2.15(t，J＝7.2Hz，2H)，1.81-1.24(m，12H)，1.16(t，J＝3.6Hz，3H)；MS APCI，m/z＝916(M+).LC/MS2.36min.HRMS(TOFES+)C50H57N7O8S(M+H)的计算值916.4067，实测值916.4093. 如下制备原料(4k)
(2R，3S)-3-苯基-环氧乙烷-2-羧酸(2-羟基-苯基)-酰胺(4a)在氮气下，在冰水浴中冷却，向搅拌着的(2R，3S)-3-苯基环氧乙烷-2-羧酸钾(如专利申请AZ WO2004031154A1中所述制备)(6.45g，31.9mmol)在无水THF(100mL)中的悬浮液中，通过注射器缓慢加入氯甲酸异丁酯(4.2mL，32mmol)。加入NMM(0.80mL，7.30mmol)，并且搅拌该混合物，同时历时75分钟逐步升温至10℃。将混合物冷却至0℃，并加入2-氨基苯酚，然后除去冷浴，将反应物在环境温度搅拌42h。用Et2O(100mL)稀释反应物，然后将其过滤通过硅藻土垫以除去悬浮的固体。对溶液进行旋转蒸发，得到橙色固体，用乙醚(200mL)研制该固体，并过滤收集。在过滤器上用另外的乙醚清洗该固体，得到纯的标题化合物(6.76g，83％)，为灰白色固体。1H NMR(300.132MHz，DMSO)δ9.98(s，1H)，9.28(s，1H)，7.96(d，J＝7.0Hz，1H)，7.46-7.31(m，5H)，7.01-6.93(m，1H)，6.92-6.86(m，1H)，6.84-6.75(m，1H)，4.22(d，J＝1.6Hz，1H)，4.00(d，J＝1.6Hz，1H)；MS APCI，m/z＝256(M+H).LC/MS2.22min.
(6S，7S)-7-羟基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮(4b)向(2R，3S)-3-苯基-环氧乙烷-2-羧酸(2-羟基-苯基)-酰胺(4a)(5.23g，20.5mmol)在100mL MeCN中的溶液中，加入Sc(OTf)3(0.95g，1.92mmol)。将混合物在66℃加热75min，然后冷却至室温。减压蒸发溶剂，在二氧化硅上通过fcc(DCM∶EtOAc洗脱液)纯化残余物，得到灰白色泡沫(2.77g，53％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ8.30(s，1H)，7.51-7.31(m，5H)，7.18-7.00(m，3H)，6.94-6.82(m，1H)，5.29(d，J＝9.8Hz，1H)，4.64(dd，J＝9.8，5.0Hz，1H)，3.75(d，J＝5.0Hz，1H)； MS APCI，m/z＝256(M+H).LC/MS1.95min.
(6S，7R)-7-叠氮基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮(4c) 在氮气气氛和-18℃，通过注射器将三氟甲磺酰氯(4.5mL，42mmol)加到搅拌着的(6S，7S)-7-羟基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮(4b)(2.66g，10.4mmol)和Et3N(5.8mL，42mmol)在DCM(27mL)的溶液中。将该混合物保持在-18℃过夜。加入另外的三氟甲磺酰氯(1.2mL，11mmol)和三乙胺(1.5mL，11mmol)，并且将该混合物继续保持在-18℃1h。在-18℃真空浓缩反应物，然后在氮气气氛和-18℃，将所得的残余物立即溶解到DMF(25mL)中。将叠氮化钠(3.86g，59.0mmol)加到溶液中，并历时30min将混合物升温至环境温度。又过了2h之后，用EtOAc(200mL)稀释反应物，用H2O(4×80mL)、20％K2CO3水溶液(2×80mL)和盐水萃取。干燥(MgSO4)有机萃取液，过滤，并蒸发。在二氧化硅上通过fcc(DCM∶EtOAc洗脱液)纯化粗产物(褐色固体)，得到标题化合物(1.20g，41％)，为泡沫状白色固体。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.67(br s，1H)，7.60-7.51(m，2H)，7.47-7.37(m，3H)，7.29-7.12(m，3H)，7.07-6.99(m，1H)，5.56(d，J＝6.5Hz，1H)，4.46(d，J＝6.0Hz，1H)；MS APCI，m/z＝280(M+H).LC/MS2.14min.
(6S，7R)-7-氨基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮盐酸盐(4d)向Parr氢烧瓶中加入5％Pd/C(185mg)，接着加入70mL无水EtOH。然后向其中加入(6S，7R)-7-叠氮基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮(4c)(1.20g，4.28mmol)。用热枪(heat gun)温和地加热混合物，以溶解叠氮化物。加入1N HCl水溶液(15mL)，将烧瓶置于Parr摇床上，用氢气排空/回填(backfilled)(4次循环)。在50psi的氢气中将混合物振荡2h(室温为3℃)，过滤通过硅藻土垫，并蒸发EtOH。用250mL Et2O搅拌残余物2h，过滤沉淀的产物，洗涤(Et2O)，并在高真空下干燥18h。这样得到1.05g(84％)白色粉末。1H NMR(300.132MHz，DMSO)δ10.65(s，1H)，8.36(s，3H)，7.61-7.39(m，5H)，7.35-7.14(m，4H)，5.88(d，J＝6.1Hz，1H)，4.54(d，J＝6.5Hz，3H)；MS APCI，m/z＝255(M+H).LC/MS1.32min.
((6S，7R)-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸叔丁酯(4e)使用类似于实施例(1b)中描述的步骤，所不同的是使用(6S，7R)-7-氨基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮盐酸盐(4d)(1.03g，3.54mmol)作为原料，得到标题化合物(4e)(1.26g，97％)，其不经过进一步纯化而使用。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.94(s，1H)，7.49-7.11(m，8H)，7.10-6.99(m，1H)，5.76(d，J＝6.5Hz，1H)，5.09-4.87(m，2H)，1.40(s，9H)；MS APCI，m/z＝418(M+Na++MeCN).LC/MS2.56min.
((6S，7R)-7-叔丁氧羰基氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸甲酯(4f)使用类似于实施例(1c)中描述的步骤，所不同的是使用((6S，7R)-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸叔丁酯(4e)(1.26g，3.54mmol)作为原料，通过fcc纯化之后得到标题化合物(4f)(1.46g，97％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.52-7.31(m，5H)，7.31-7.15(m，4H)，5.70(d，J＝7.0Hz，1H)，5.02(t，J＝7.4Hz，1H)，4.92(d，J＝7.6Hz，1H)，4.68和4.54(AB，J＝17.2Hz，2H)，3.79(s，3H)，1.38(s，9H)；MS APCI，m/z＝449 (M+Na+).LC/MS2.74min.
((6S，7R)-7-叔丁氧羰基氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸(4g)使用类似于实施例(1d)中描述的步骤，所不同的是使用((6S，7R)-7-叔丁氧羰基氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸甲酯(4f)(954mg，2.24mmol)作为原料，得到标题化合物(4g)(940mg，基本上是定量的)，其不经过进一步纯化而使用。1HNMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.48-7.32(m，5H)，7.32-7.18(m，4H)，5.70(d，J＝7.0Hz，1H)，5.03(t，J＝7.5Hz，1H)，4.92(d，J＝7.8Hz，1H)，4.73和4.56(AB，J＝17.5Hz，2H)，1.38(s，9H)；MS ES+，m/z＝413(M+H).LC/MS2.25min.
[(6S，7R)-8-氧代-9-({5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊基氨基甲酰基}-甲基)-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-氨基甲酸叔丁酯(4h)在N2气氛下，向((6S，7R)-7-叔丁氧羰基氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸(4g)(385mg，0.933mmol)在30mL DCM中的溶液中，加入5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸(5-氨基-戊基)-酰胺(1j)(308mg，0.938mmol)、PyAOP(577mg，1.11mmol)和i-Pr2EtN(480μL，2.76mmol)。将反应混合物在环境温度搅拌70h，蒸发溶剂，并且将残余物溶解在200mL EtOAc∶MeOH(20∶1)中。用H2O(3×50mL)、20％K2CO3水溶液和盐水萃取。真空除去溶剂并用制备型RPHPLC纯化粗产物，得到480mg(71％)白色固体。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.52-7.24(m，9H)，5.62(d，J＝7.1Hz，1H)，4.95(d，J＝7.1Hz，1H)，4.67(d，J＝16.4Hz，1H)，4.47(dd，J＝7.7，5.0Hz，1H)，4.40(d，J＝16.4Hz，1H)，4.28(dd，J＝7.8，4.4Hz，1H)，3.28-3.10(m，6H)，2.91(dd，J＝12.8，4.9Hz，1H)，2.69(d，J＝12.8Hz，1H)，2.16(t，J＝7.2Hz，2H)，1.78-1.27(m，12H)，1.37(s，9H)；MS APCI，m/z＝723(M+).LC/MS2.38min.
5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[2-((6S，7R)-7-氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-酰胺(4i)使用类似于实施例(4k)中描述的步骤，所不同的是使用[(6S，7R)-8-氧代-9-({5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊基氨基甲酰基}-甲基)-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-氨基甲酸叔丁酯(4h)(480mg，0.664mmol)作为boc-保护的胺组分，分离标题化合物(4i)，获得灰白色固体(413mg，基本上是定量的)。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.66-7.30(m，9H)，5.71(d，J＝7.2Hz，1H)，4.80和4.44(AB，J＝16.2Hz，2H)，4.69(d，J＝7.2Hz，1H)，4.51-4.43(m，1H)，4.28(dd，J＝7.8，4.5Hz，1H)，3.30-3.09(m，6H)，2.92(dd，J＝12.8，5.0Hz，1H)，2.69(d，J＝12.7Hz，1H)，2.18(t，J＝7.3Hz，2H)，1.79-1.22(m，13H) MS APCI，m/z＝623(M+).LC/MS1.72min.
{(S)-1-[(6S，7R)-8-氧代-9-({5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊基氨基甲酰基}-甲基)-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基氨基甲酰基]-乙基}-氨基甲酸叔丁酯(4j)在N2气氛下，向5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[2-((6S，7R)-7-氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-酰胺(4i)(413mg，0.664mmol)在35mL DCM中的溶液中，加入N-(叔丁氧羰基)-L-丙氨酸(133mg，0.703mmol)、HATU(382mg，1.00mmol)和i-Pr2EtN(300μL，1.72mmol)。将反应混合物在环境温度搅拌7h，蒸发溶剂，并将残余物溶解于200mL EtOAc∶MeOH(20∶1)中。用H2O(3×50mL)、20％K2CO3水溶液和盐水萃取。真空除去溶剂，并用制备型RPHPLC纯化残余物，得到510mg(97％)白色固体。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.53-7.23(m，9H)，7.09(d，J＝7.2Hz，1H)，5.65(d，J＝7.2Hz，1H)，5.27-5.14(m，1H)，4.69和4.40(AB，J＝16.4Hz，2H)，4.47(dd，J＝7.7，5.0Hz，1H)，4.28(dd，J＝7.8，4.5Hz，1H)，3.99(q，J＝7.1Hz，1H)，3.24(t，J＝6.7Hz，2H)，3.23-3.16(m，1H)，3.15(t，J＝6.9Hz，2H)，2.91(dd，J＝12.7，4.9Hz，1H)，2.69(d，J＝12.7Hz，1H)，2.17(t，J＝7.2Hz，2H)，1.81-1.26(m，11H)，1.37(s，9H)，1.13(d，J＝7.1Hz，3H)；MS APCI，m/z＝795(M+H).LC/MS2.25min.
5-((3aS，4S，6aR)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)-戊酸(5-{2-[(6S，7R)-7-((S)-2-氨基-丙酰氨基)-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基]-乙酰氨基}-戊基)-酰胺(4k)向{(S)-1-[(6S，7R)-8-氧代-9-({5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊基氨基甲酰基}-甲基)-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基氨基甲酰基]-乙基}-氨基甲酸叔丁酯(4j)(500mg，0.630mmol)在10mLDCM的溶液中，加入TFA(4mL)。将混合物搅拌2h，蒸发溶剂/TFA，在高真空下抽吸残余物1h。将粗产物溶解于30mL 5∶1 DCM∶MeOH中，加入1.92g(1.30mmol)Si-胺(Silicycle衍生化的硅胶，part#R52030B，装载量1.46mmol/g)，并将混合物搅拌2h。过滤混合物，用DCM洗涤二氧化硅，真空浓缩滤液，得到固体(490mg，基本上是定量的)。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.55-7.21(m，9H)，5.66(d，J＝7.4Hz，1H)，5.27(d，J＝7.3Hz，1H)，4.77和4.34(AB，J＝16.3Hz，2H)，4.47(dd，J＝7.7，4.9Hz，1H)，4.28(dd，J＝7.8，4.5Hz，1H)，3.89(q，J＝6.9Hz，1H)，3.30-3.10(m，6H)，2.92(dd，J＝12.8，5.0Hz，1H)，2.69(d，J＝12.7Hz，1H)，2.17(t，J＝7.2Hz，2H)，1.81-1.26(m，13H)，1.22(d，J＝7.0Hz，3H)；MS APCI，m/z＝694(M+).LC/MS1.75min.
实施例55-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[2-((6S，7R)-7-{(S)-2-[2-(4-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-酰胺(5) 使用类似于实施例(4)中描述的步骤，所不同的是使用对苯甲酰基苯乙酸(26.4mg，0.110mmol)作为酸组分，用制备型RPHPLC分离标题化合物，得到标题化合物(5)(49mg，51％)，为灰白色固体。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.82-7.59(m，5H)，7.58-7.48(m，2H)，7.45-7.27(m，12H)，7.13(d，J＝7.0Hz，1H)，5.65(d，J＝7.2Hz，1H)，5.26-5.14(m，1H)，4.70和4.36(AB，J＝16.4Hz，2H)，4.45(dd，J＝7.7，4.3Hz，1H)，4.32-4.23(m，1H)，3.55(s，2H)，3.22(t，J＝6.9Hz，2H)，3.13(t，J＝6.9Hz，2H)，3.20-3.13(mH)，2.89(dd，J＝12.8，5.0Hz，1H)，2.67(d，J＝12.7Hz，1H)，2.15(t，J＝7.2Hz，2H)，1.78-1.25(m，13H)，1.19(d，J＝7.2Hz，3H)；MS APCI，m/z＝916(M+). LC/MS2.36min.HRMS(TOF ES+)C50H57N7O8S(M+H)的计算值916.4067，实测值916.4080.
实施例65-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[2-((6S，7R)-7-{(S)-2-[2-(4-叠氮基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-酰胺(6) 使用类似于实施例(4)中描述的步骤，所不同的是使用对叠氮基苯乙酸(22.0mg，0.124mmol)作为酸组分，用制备型RPHPLC分离标题化合物，得到标题化合物(6)(49mg，51％)，为灰白色固体。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.47-7.27(m，10H)，7.21(d，J＝8.5Hz，2H)，7.10(d，J＝7.1Hz，1H)，6.96(d，J＝8.4Hz，2H)，5.64(d，J＝7.2Hz，1H)，5.26-5.14(m，1H)，4.70和4.37(AB，J＝16.4Hz，2H)，4.46(dd，J＝7.7，4.8Hz，1H)，4.32-4.21(m，2H)，3.41(s，1H)，3.24(t，J＝6.9Hz，2H)，3.22-3.15(m，1H)，3.14(t，J＝6.8Hz，2H)，2.90(dd，J＝12.8，5.0Hz，1H)，2.68(d，J＝12.7Hz，1H)，2.16(t，J＝7.2Hz，2H)，1.80-1.25(m，13H)，1.17(d，J＝7.2Hz，3H)；MS APCI，m/z＝853(M+).LC/MS2.28min.HRMS(TOF ES+)C43H52N10O7S(M+H)的计算值853.3819，实测值853.3836.
实施例75-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸[5-((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(3-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-2-基氧)-戊基]-酰胺(7) 在N2气氛下，向5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[(6R，7S)-7-((S)-2-氨基-丙酰氨基)-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-2-基氧]-戊基}-酰胺(7p)(70.7mg，0.106mmol)在DMF(7mL)中的溶液中，加入间苯甲酰基苯乙酸(35.0mg，0.146mmol)、HOBt(21.2mg，0.157mmol)、i-Pr2EtN(60μL，0.340mmol)和EDAC-HCl(33.2mg，0.173mmol)。将该混合物在环境温度搅拌过夜，蒸发DMF，用制备型RPHPLC纯化残余物，得到52mg(56％)白色固体。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.87-7.41(m，10H)，7.41-7.23(m，5H)，7.17(d，J＝8.8Hz，1H)，7.12(d，J＝7.1Hz，1H)，6.93(d，J＝2.8Hz，1H)，6.85(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，5.54(d，J＝7.1Hz，1H)，5.08-4.98(m，1H)，4.43(dd，J＝7.6，4.6Hz，1H)，4.26(dd，J＝7.8，4.4Hz，1H)，4.18(q，J＝7.2Hz，1H)，4.02(t，J＝6.2Hz，2H)，3.56(s，2H)，3.42(s，3H)，3.27-3.12(m，2H)，2.93-2.79(m，1H)，2.65(d，J＝12.7Hz，1H)，2.20(t，J＝7.2Hz，2H)，1.89-1.35(m，12H)，1.20(d，J＝7.2Hz，12H)；MS APCI，m/z＝889(M+).LC/MS2.29min.HRMS(TOF ES+)C49H56N6O8S(M+H)的计算值889.3953，实测值889.3952. 如下制备原料(7p)
2-氨基-4-甲氧基-苯酚(7a) 根据Lok，R在J.Org.Chem.，1996，61，3289中所述的方法制备。

(2R，3S)-3-苯基-环氧乙烷-2-羧酸(2-羟基-5-甲氧基-苯基)-酰胺(7b)使用类似于实施例(4a)中描述的步骤，所不同的是使用(2R，3S)-3-苯基环氧乙烷-2-羧酸钾(4.03g，19.9mmol)作为酸组分，2-氨基-4-甲氧基-苯酚作为胺组分(2.81g，20.2mmol)，分离标题化合物(7b)，得到黄褐色固体(4.12mg，72％)。1H NMR(300.132MHz，DMSO)δ9.51(s，1H)，9.25(s，1H)，7.68(d，J＝2.9Hz，1H)，7.45-7.33(m，5H)，6.81(d，J＝8.8Hz，1H)，6.56(dd，J＝8.7，3.0Hz，1H)，4.23(d，J＝1.5Hz，1H)，4.01(d，J＝1.5Hz，1H)，3.67(s，3H)；MS APCI，m/z＝286(M+H).LC/MS2.02min.
(6R，7R)-7-羟基-2-甲氧基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮(7c)使用类似于实施例(4b)中描述的步骤，所不同的是使用(2R，3S)-3-苯基-环氧乙烷-2-羧酸(2-羟基-5-甲氧基-苯基)-酰胺(7b)(860mg，3.02mmol)作为原料，得到标题化合物(7c)(500mg，58％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ8.03(s，1H)，7.49-7.32(m，5H)，6.76(d，J＝8.6Hz，1H)，6.66-6.55(m，2H)，5.25(d，J＝9.8Hz，1H)，4.65(dd，J＝9.8，5.3Hz，1H)，3.78(s，3H)，3.70(d，J＝5.3Hz，1H)；MS APCI，m/z＝286(M+H).LC/MS1.77min.
(6R，7S)-7-叠氮基-2-甲氧基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮(7d)使用类似于实施例(4c)中描述的步骤，所不同的是使用(6R，7R)-7-羟基-2-甲氧基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮(7c)(2.49g，8.72mmol)作为原料，在二氧化硅上通过fcc(DCM∶EtOAc洗脱液)纯化之后，得到标题化合物(7d)(1.73g，64％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ8.27(s，1H)，7.59-7.50(m，2H)，7.44-7.36(m，3H)，7.15(d，J＝8.9Hz，1H)，6.72(dd，J＝8.8，2.9Hz，1H)，6.59(d，J＝2.9Hz，1H)，5.52(d，J＝6.3Hz，1H)，4.45(d，J＝6.3Hz，1H)，3.77(s，3H)；MS ES+，m/z＝311(M+H). C/MS2.18min.
(6R，7S)-7-氨基-2-甲氧基-9-甲基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮盐酸盐(7e)使用类似于实施例(4d)中描述的步骤，所不同的是使用(6R，7S)-7-叠氮基-2-甲氧基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮(7d)(1.19g，3.83mmol)作为原料，得到标题化合物(7e)(1.12g，91％)。唯一的例外是没有进行Et2O研制。1H NMR(300.132MHz，DMSO)δ10.60(s，1H)，8.34(br s，3H)，7.60-7.39(m，5H)，7.23(d，J＝8.8Hz，1H)，6.82(dd，J＝8.8，2.9Hz，1H)，6.71(d，J＝2.9Hz，1H)，5.80(d，J＝6.8Hz，1H)，4.50(d，J＝6.8Hz，1H)，3.77(s，3H)；MS APCI，m/z＝285(M+H).LC/MS1.26min.
((6R，7S)-2-甲氧基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸叔丁酯(7f)使用类似于实施例(1b)中描述的步骤，所不同的是使用(6R，7S)-7-氨基-2-甲氧基-9-甲基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮盐酸盐(7e)(420mg，1.29mmol)作为原料，通过fcc纯化之后得到标题化合物7(7f)(425mg，86％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.54(s，1H)，7.48-7.31(m，5H)，7.17(d，J＝8.8Hz，1H)，6.74(dd，J＝8.8，2.9Hz，1H)，6.59(d，J＝2.9Hz，1H)，5.69(d，J＝7.0Hz，1H)，5.00(t，J＝7.5Hz，1H)，4.88(d，J＝7.9Hz，1H)，3.80(s，3H)，1.39(s，9H)；MS ES+，m/z＝407(M+Na+).LC/MS2.38min.
((6R，7S)-2-甲氧基-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸叔丁酯(7g)向((6R，7S)-2-甲氧基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸叔丁酯(7f)(425mg，1.11mmol)在25mL MeCN中的溶液中，加入Cs2CO3(894mg，2.74mmol)和MeI(0.2mL，3.2mmol)。将混合物在环境温度搅拌24h。减压蒸发溶剂，在二氧化硅上通过fcc(DCM∶EtOAc洗脱液)纯化残余物，得到白色泡沫(392mg，89％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.46-7.30(m，5H)，7.20-7.11(m，1H)，6.84-6.70(m，2H)，5.70-5.52(m，1H)，5.04-4.85(m，2H)，3.83(s，3H)，3.46(s，3H)；MS APCI，m/z＝299(M+H-100).LC/MS2.77min.
(6R，7S)-7-氨基-2-羟基-9-甲基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮氢溴酸盐(7h)向((6R，7S)-2-甲氧基-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸叔丁酯(7g)(580mg，1.34mmol)在DCM(40mL)中的溶液中，加入BBr3(2mL 1M的DCM溶液)。在环境温度搅拌混合物1h，然后加入另外的BBr3(2mL 1M的在DCM中的溶液)。再搅拌混合物2h，然后用2mL H2O猝灭。真空蒸发DCM/H2O，在二氧化硅上通过fcc纯化粗产物，得到标题化合物(409mg，83％)，为褐色固体。1H NMR(300.132MHz，DMSO)δ9.74(br s，1H)，8.09(br s，3H)，7.52-7.34(m，5H)，7.15(d，J＝8.7Hz，1H)，6.88(d，J＝2.7Hz，1H)，6.73(dd，J＝8.7，2.7Hz，1H)，5.60(d，J＝7.0Hz，1H)，4.58(d，J＝6.7Hz，1H)，3.41(s，3H)；MS APCI，m/z＝285(M+H).LC/MS1.43min.
碳酸苄酯(6R，7S)-7-苄氧羰基氨基-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-2-基酯(7i) 向搅拌着的(6R，7S)-7-氨基-2-羟基-9-甲基-6-苯基-6，7-二氢-9H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮氢溴酸盐(7h)(404mg，1.11mmol)在60mL DCM中冷却至0℃的溶液中，加入Et3N(0.7mL，5.0mmol)，接着加入二碳酸二苄基酯(770mg，2.69mmol)。将混合物在0℃搅拌15min，用DCM(100mL)稀释，用H2O(100mL)、饱和的NaHCO3(100mL)水溶液萃取。干燥(Na2SO4)有机萃取液，过滤并蒸发。在二氧化硅上通过fcc(DCM∶EtOAc洗脱液)纯化粗产物，得到标题化合物(419mg，68％)，为透明油状物。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.53-7.18(m，16H)，7.14-7.03(m，2H)，5.65(d，J＝7.0Hz，1H)，5.29(s，2H)，5.19(d，J＝7.7Hz，1H)，5.07和4.99(AB，J＝12.2Hz，2H)，4.99(t，J＝7.3Hz，1H)，3.44(s，3H)；MS ES+，m/z＝553(M+).LC/MS3.08min.
((6R，7S)-2-羟基-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸苄酯(7j)使用类似于实施例(1d)中描述的步骤，所不同的是使用碳酸苄酯(6R，7S)-7-苄氧羰基氨基-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-2-基酯(7i)(417mg，0.755mmol)作为原料，得到标题化合物(7j)(316mg，基本上是定量的)，其含有残余的苄醇，并且不经过进一步纯化而使用。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.43-7.21(m，10H)，7.09(d，J＝8.8Hz，1H)，6.70-6.62(m，2H)，5.86(s，1H)，5.59(d，J＝7.2Hz，1H)，5.22(d，J＝8.1Hz，1H)，5.08(d，J＝12.3Hz，1H)，5.01(d，J＝13.0Hz，1H)，4.96(t，J＝7.8Hz，1H)，3.42(s，3H)；MS ES+，m/z＝419(M+).LC/MS2.29min.
[(6R，7S)-2-(5-叔丁氧羰基氨基-戊氧基)-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-氨基甲酸苄酯(7k)向搅拌着的K2CO3(721mg，5.22mmol)在DMF(15mL)中的浆料中，加入((6R，7S)-2-羟基-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸苄酯(7j)(315mg，0.755mmol)和(5-溴-戊基)-氨基甲酸叔丁酯(403mg，1.51mmol)。将混合物在环境温度搅拌20h。加入另外的K2CO3(584mg，4.23mmol)和(5-溴-戊基)-氨基甲酸叔丁酯(333mg，1.25mmol)，并且将混合物搅拌5天。用EtOAc(150mL)稀释反应物，用H2O(4×50mL)和盐水萃取。干燥(Na2SO4)有机萃取液，过滤并蒸发。在二氧化硅上通过fcc(DCM∶EtOAc洗脱液)纯化粗产物，得到标题化合物(429mg，94％)，为透明油状物。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.42-7.21(m，10H)，7.14(d，J＝9.3Hz，1H)，6.80-6.69(m，2H)，5.58(d，J＝7.1Hz，1H)，5.16(d，J＝7.8Hz，1H)，5.07和4.99(AB，J＝12.2Hz，2H)，5.02-4.94(m，1H)，4.53(br s，1H)，3.96(t，J＝6.3Hz，2H)，3.46(s，3H)，3.16(q，J＝6.0Hz，2H)，1.83(quintet，J＝6.7Hz，2H)，1.64-1.49(m，4H)，1.45(s，9H)；MS ES+，m/z＝604(M+).LC/MS2.91min.
[(6R，7S)-2-(5-氨基-戊氧基)-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-氨基甲酸苄酯(7l)向[(6R，7S)-2-(5-叔丁氧羰基氨基-戊氧基)-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-氨基甲酸苄酯(7k)(427mg，0.707mmol)在10mL DCM中的溶液中，加入TFA(1.2mL)。搅拌混合物2h，蒸发溶剂/TFA，将残余物与20％K2CO3水溶液(30mL)混合，并用DCM(3×30mL)萃取。干燥(Na2SO4)萃取液，过滤并蒸发，得到油(357mg，99％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.41-7.22(m，10H)，7.14(d，J＝8.6Hz，1H)，6.81-6.69(m，2H)，5.54(d，J＝7.1Hz，1H)，5.18(d，J＝8.1Hz，1H)，5.05和4.97(AB，J＝12.2Hz，2H)，5.00-4.91(m，1H)，3.97(t，J＝5.6Hz，2H)，3.44(s，3H)，3.05-2.91(m，2H)，1.90-1.67(m，4H)，1.65-1.49(m，2H)；MS APCI，m/z＝504(M+).LC/MS2.00min.
((6R，7S)-9-甲基-8-氧代-2-{5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊氧基}-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸苄酯(7m) 使用类似于实施例(7)中描述的步骤。胺组分[(6R，7S)-2-(5-氨基-戊氧基)-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-氨基甲酸苄酯(7l)(357mg，0.707mmol)与D-生物素(177mg，0.725mmol)结合，在用制备型RPHPLC纯化之后，得到标题化合物(291mg，56％)，为灰白色固体。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.41-7.22(m，10H)，7.19(d，J＝8.9Hz，1H)，6.97(d，J＝2.6Hz，1H)，6.86(dd，J＝8.9，2.9Hz，1H)，5.52(d，J＝7.1Hz，1H)，5.09和4.98(AB，J＝12.7Hz，2H)，4.92(d，J＝7.2Hz，1H)，4.44(dd，J＝7.7，4.9Hz，1H)，4.27(dd，J＝7.8，4.4Hz，1H)，4.03(t，J＝6.2Hz，2H)，3.45(s，3H)，3.26-3.13(m，3H)，2.88(dd，J＝12.8，4.3Hz，1H)，2.66(d，J＝12.8Hz，1H)，2.20(t，J＝7.2Hz，2H)，1.82(五重峰，J＝8.0Hz，2H)，1.76-1.35(m，10H)；MS APCI，m/z＝730(M+).LC/MS2.38min.
5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸[5-((6R，7S)-7-氨基-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-2-基氧)-戊基]-酰胺(7n) 向含有((6R，7S)-9-甲基-8-氧代-2-{5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]-咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊氧基}-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-氨基甲酸苄酯(7m)(279mg，0.382mmol)的烧瓶中，加入10mL TFA。在50℃加热混合物3h。减压蒸发TFA，将残余物与20％K2CO3水溶液(50mL)混合，并用50∶1 DCM∶MeOH(3×20mL)萃取。干燥(Na2SO4)萃取液，过滤并减压蒸发，得到固体(201mg，76％)。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.51-7.25(m，5H)，7.16(d，J＝8.9Hz，1H)，6.94(d，J＝2.9Hz，1H)，6.83(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，5.38(d，J＝7.0Hz，1H)，4.46(dd，J＝7.1，4.3Hz，1H)，4.28(dd，J＝7.8，4.4Hz，1H)，4.22(d，J＝5.6Hz，1H)，4.13-3.96(m，3H)，3.45(s，3H)，3.27-3.14(m，3H)，2.90(dd，J＝12.8，4.9Hz，1H)，2.68(d，J＝12.7Hz，1H)，2.20(t，J＝7.2Hz，2H)，1.91-1.24(m，12H)；MS APCI，m/z＝596(M+).LC/MS1.63min.
[(S)-1-((6R，7S)-9-甲基-8-氧代-2-{5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊氧基}-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基氨基甲酰基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(7o) 使用类似于实施例(1g)中描述的步骤，所不同的是使用5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸[5-((6R，7S)-7-氨基-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-2-基氧)-戊基]-酰胺(7n)(228mg，0.382mmol)作为胺组分，在使用制备型RPHPLC纯化之后，得到标题化合物(7o)(163mg，55％)。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.45-7.27(m，5H)，7.20(d，J＝8.8Hz，1H)，7.12-7.01(m，1H)，6.97(d，J＝2.3Hz，1H)，6.87(dd，J＝8.7，2.5Hz，1H)，5.59(d，J＝7.1Hz，1H)，5.04(t，J＝6.9Hz，1H)，4.45(dd，J＝7.5，4.5Hz，1H)，4.28(dd，J＝7.6，4.3Hz，1H)，4.03(t，J＝5.9Hz，2H)，3.88(q，J＝7.1Hz，1H)，3.46(s，3H)，3.26-3.14(m，3H)，2.87(dd，J＝12.7，4.7Hz，1H)，2.67(d，J＝12.7Hz，1H)，2.20(t，J＝7.0Hz，2H)，1.90-1.32(m，12H)，1.39(s，9H)，1.15(d，J＝7.1Hz，3H)；MS APCI，m/z＝767(M+).LC/MS2.19min.
5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸{5-[(6R，7S)-7-((S)-2-氨基-丙酰氨基)-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-2-基氧]-戊基}-酰胺(7p) 使用类似于实施例(1h)中描述的步骤，所不同的是使用[(S)-1-((6R，7S)-9-甲基-8-氧代-2-{5-[5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酰氨基]-戊氧基}-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基氨基甲酰基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(7o)(163mg，0.213mmol)作为原料，得到标题化合物(7p)(145mg，基本上是定量的)，其不经过进一步纯化而使用。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.46-7.28(m，5H)，7.21(d，J＝8.8Hz，1H)，6.98(d，J＝2.6Hz，1H)，6.87(dd，J＝8.7，2.7Hz，1H)，5.57(d，J＝7.1Hz，1H)，5.09(d，J＝7.1Hz，1H)，4.46(dd，J＝7.6，4.4Hz，1H)，4.45(dd，J＝7.3，5.3Hz，1H)，4.22(d，J＝5.2Hz，1H)，4.09(q，J＝6.2Hz，1H)，4.03(t，J＝5.8Hz，2H)，3.47(s，3H)，3.26-3.14(m，2H)，2.89(dd，J＝12.7，4.9Hz，1H)，2.67(d，J＝12.7Hz，1H)，2.20(t，J＝6.9Hz，2H)，1.90-1.18(m，10H)，1.24(t，J＝7.1Hz，2H)，1.13(d，J＝6.8Hz，3H)；MS APCI，m/z＝667(M+).LC/MS1.64min.
实施例85-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸[5-((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(4-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-2-基氧)-戊基]-酰胺(8) 使用类似于实施例(7)中描述的步骤，所不同的是使用对苯甲酰基苯乙酸(33.5mg，0.139mmol)作为酸组分，用制备型RPHPLC分离，得到标题化合物(8)(67mg，71％)，为白色固体。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.82-7.58(m，4H)，7.52(t，J＝7.4Hz，2H)，7.43(d，J＝8.1Hz，2H)，7.39-7.25(m，4H)，7.19(d，J＝8.8Hz，1H)，7.12(d，J＝7.1Hz，1H)，6.95(d，J＝2.7Hz，1H)，6.86(dd，J＝8.7，2.7Hz，1H)，5.56(d，J＝7.1Hz，1H)，5.04(t，J＝7.1Hz，1H)，4.43(dd，J＝7.7，5.0Hz，1H)，4.26(dd，J＝7.8，4.5Hz，1H)，4.20(q，J＝7.2Hz，1H)，4.02(t，J＝6.2Hz，2H)，3.59(s，2H)，3.44(s，3H)，3.27-3.12(m，4H)，2.85(dd，J＝12.7，5.3Hz，1H)，2.64(d，J＝12.7Hz，1H)，2.20(t，J＝7.2Hz，2H)，1.90-1.35(m，12H)，1.22(d，J＝7.2Hz，3H)；MS APCI，m/z＝889(M+).LC/MS2.28min.HRMS(TOF ES+)C49H56N6O8S(M+H)的计算值889.3953，实测值889.3980.
实施例95-((3aR，6S，6aS)-2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸[5-((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(4-叠氮基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-9-甲基-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-2-基氧)-戊基]-酰胺(9) 使用类似于实施例(7)中描述的步骤，所不同的是使用对叠氮基苯乙酸(24.2mg，0.137mmol)作为酸组分，用制备型RPHPLC分离标题化合物，得到标题化合物(9)(24mg，38％)，为浅橙色固体。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.42-7.23(m，6H)，7.19(d，J＝8.8Hz，1H)，7.12(d，J＝7.2Hz，1H)，7.00(d，J＝8.5Hz，2H)，6.96(d，J＝2.8Hz，1H)，6.86(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，5.56(d，J＝7.2Hz，1H)，5.04(t，J＝7.2Hz，1H)，4.43(dd，J＝7.7，4.9Hz，1H)，4.27(dd，J＝7.8，4.4Hz，1H)，4.16(q，J＝7.2Hz，1H)，4.03(t，J＝6.2Hz，2H)，3.46(s，3H)，3.27-3.11(m，4H)，2.86(dd，J＝12.7，4.9Hz，1H)，2.64(d，J＝12.7Hz，1H)，2.20(t，J＝7.2Hz，4H)，1.90-1.36(m，12H)，1.20(d，J＝7.2Hz，3H)；MS APCI，m/z＝826(M+).LC/MS2.22min.HRMS(TOF ES+)C42H51N9O7S(M+H)的计算值826.3710，实测值826.3748. 实施例10
在N2气氛下，向(S)-N-{(6R，7S)-9-[(5-氨基-戊基氨基甲酰基)-甲基]-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基}-2-[2-(4-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰胺(10g)(11mg，16μmol)在DMF(1.5mL)中的溶液中，加入3-(2-{[1-(二氟硼基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2H-吡咯-5-基)丙酸(BODIPYFL)(5.0mg，17μmol)、HOBt(6.0mg，45μmol)、i-Pr2EtN(5μL，29μmol)和EDAC-HCl(8.0mg，42μmol)。在环境温度搅拌反应混合物3.5h，蒸发溶剂，用制备型RPHPLC纯化残余物，得到9.0mg(55％)鲜红色固体。1H NMR(300.132MHz，CD3CN)δ7.84-7.74(m，2H)，7.72-7.60(m，2H)，7.59-7.26(m，15H)，7.00(d，J＝3.8Hz，1H)，6.83(d，J＝6.9Hz，1H)，6.77-6.66(m，1H)，6.62(d，J＝7.0Hz，1H)，6.56-6.43(m，1H)，6.31(d，J＝3.8Hz，1H)，6.23(s，1H)，5.64(d，J＝7.1Hz，1H)，5.04(t，J＝7.1Hz，1H)，4.52和4.36(AB，J＝16.3Hz，2H)，4.18(五重峰，J＝7.1Hz，1H)，3.50和3.44(AB，J＝14.9Hz，2H)，3.27-3.03(m，6H)，2.51(s，3H)，2.26(s，3H)，1.55-1.19(m，8H)，1.16(d，J＝7.1Hz，3H)；MS APCI，m/z＝987(M+Na+).LC/MS2.83min.HRMS(TOF ES+)C54H56N7O7BF2(M+H)的计算值964.4380，实测值964.4369. 如下制备原料(10g)
((6R，7S)-7-氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸甲酯(10a) 使用类似于实施例(1h)中描述的步骤，所不同的是使用((6R，7S)-7-叔丁氧羰基氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸甲酯(1c)(383mg，0.898mmol)作为原料，得到标题化合物(10a)(275mg，94％)，其不经过进一步纯化而使用。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.55-7.46(m，2H)，7.43-7.34(m，3H)，7.30-7.19(m，4H)，5.48(d，J＝7.1Hz，1H)，4.80和4.42(AB，J＝17.3Hz，2H)，4.17(d，J＝7.1Hz，1H)，3.81(s，3H)，1.15(s，2H)；MS APCI，m/z＝327(M+H).LC/MS1.54min.
[(6R，7S)-7-((S)-2-叔丁氧羰基氨基-丙酰氨基)-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基]-乙酸甲酯(10b) 使用类似于实施例(1g)中描述的步骤，所不同的是使用((6R，7S)-7-氨基-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸甲酯(10a)(270mg，0.827mmol)作为胺组分，得到标题化合物(10b)(412mg，基本上是定量的)，其不经过进一步纯化而使用。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.45-7.34(m，5H)，7.32-7.19(m，4H)，6.37(d，J＝6.5Hz，1H)，5.78(d，J＝7.2Hz，1H)，5.18(t，J＝7.1Hz，1H)，4.77-4.60(m，1H)，4.68和4.54(AB，J＝17.2Hz，2H)，4.05-3.88(m，1H)，3.79(s，3H)，1.40(s，9H)，1.21(d，J＝7.1Hz，3H)；MS ES+，m/z＝498(M+H).LC/MS2.30min.
[(6R，7S)-7-((S)-2-氨基-丙酰氨基)-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基]-乙酸甲酯(10c) 使用类似于实施例(7n)中描述的步骤，所不同的是使用[(6R，7S)-7-((S)-2-叔丁氧羰基氨基-丙酰氨基)-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基]-乙酸甲酯(10b)(411mg，0.827mmol)作为原料，得到标题化合物(10c)(332mg，基本上是定量的)，其不经过进一步纯化而使用。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.56-7.17(m，9H)，5.74(d，J＝7.4Hz，1H)，5.22(t，J＝7.4Hz，1H)，4.72和4.51(AB，J＝17.2Hz，2H)，4.47(s，3H)，3.33(q，J＝6.8Hz，1H)，1.18(d，J＝7.0Hz，3H)；MS APCI，m/z＝398(M+H).LC/MS1.65min.
((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(4-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸甲酯(10d) 使用类似于实施例(1g)中描述的步骤，所不同的是在DCM中使用[(6R，7S)-7-((S)-2-氨基-丙酰氨基)-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基]-乙酸甲酯(10c)(166mg，0.414mmol)作为胺组分，对苯甲酰基苯乙酸(108mg，0.450mmol)作为酸组分，在二氧化硅上通过fcc纯化之后，得到标题化合物(10d)(233mg，91％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.89-7.72(m，4H)，7.66-7.18(m，14H)，6.17(d，J＝6.8Hz，1H)，5.85(d，J＝6.8Hz，1H)，5.72(d，J＝7.1Hz，1H)，5.17(t，J＝7.2Hz，1H)，4.67和4.55(AB，J＝17.3Hz，2H)，4.33-4.19(m，1H)，3.79(s，3H)，3.59(s，2H)，1.21(d，J＝7.0Hz，3H)；MSAPCI，m/z＝620(M+).LC/MS2.39min.
((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(4-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸(10e) 使用类似于实施例(1d)中描述的步骤，所不同的是使用((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(4-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸甲酯(10d)(233mg，0.376mmol)作为原料，得到标题化合物(10e)(224mg，98％)，其不经过进一步纯化而使用。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.89-7.71(m，4H)，7.68-7.12(m，14H)，6.70(br s，1H)，5.60(d，J＝6.9Hz，1H)，5.30-5.07(m，1H)，4.49和3.96(AB，J＝17.1Hz，2H)，4.19-3.85(m，2H)，3.67(s，2H)，0.92(d，J＝6.6Hz，3H)；MS APCI，m/z＝606(M+).LC/MS2.42min.
{5-[2-((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(4-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-氨基甲酸叔丁酯(10f) 使用类似于实施例(1g)中描述的步骤，所不同的是使用(5-氨基-戊基)-氨基甲酸叔丁酯(95mg，0.47mmol)作为胺组分，和((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(4-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸(10e)(220mg，0.360mmol)作为酸组分，在二氧化硅上通过fcc纯化后，得到标题化合物(10f)(191mg，67％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.85-7.72(m，4H)，7.60(t，J＝7.2Hz，1H)，7.49(t，J＝7.5Hz，2H)，7.44-7.23(m，11H)，6.68-6.38(m，1H)，6.22(br s，0.5H)，5.99(brs，0.5H)，5.70(d，J＝7.4Hz，1H)，5.13(t，J＝7.3Hz，1H)，4.70-4.11(m，3H)，3.73-2.82(m，6H)，1.56-1.11(m，9H)，1.42(s，9H)；MS ES+，m/z＝790(M+).LC/MS2.51min.
(S)-N-{(6R，7S)-9-[(5-氨基-戊基氨基甲酰基)-甲基]-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基}-2-[2-(4-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰胺(10g) 使用类似于实施例(1h)中描述的步骤，所不同的是使用{5-[2-((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(4-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-氨基甲酸叔丁酯(10f)(192mg，0.242mmol)作为原料，得到标题化合物(10g)(168mg，基本上是定量的)，其不经过进一步纯化而使用。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.82-7.59(m，5H)，7.52(t，J＝7.5Hz，2H)，7.47-7.25(m，11H)，5.66(d，J＝7.1Hz，1H)，5.17(d，J＝7.2Hz，1H)，4.67和4.40(AB，J＝16.4Hz，2H)，4.23(q，J＝7.1Hz，1H)，3.58(s，2H)，3.28-3.13(m，2H)，2.68(t，J＝7.0Hz，2H)，1.62-1.42(m，4H)，1.41-1.15(m，5H)；MS APCI，m/z＝690(M+).LC/MS2.09min. 实施例11
使用类似于实施例(10)中描述的步骤，所不同的是使用(S)-N-{(6R，7S)-9-[(5-氨基-戊基氨基甲酰基)-甲基]-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基}-2-[2-(3-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰胺(11d)(27mg，39μmol)作为胺组分，用制备型RPHPLC分离标题化合物，得到标题化合物(11)(13mg，40％，purity～83％)，为鲜红色固体。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.81-7.58(m，5H)，7.51(t，J＝7.4Hz，2H)，7.45-7.26(m，11H)，7.19(d，J＝7.1Hz，1H)，6.98(d，J＝3.7Hz，1H)，6.29(d，J＝4.1Hz，1H)，6.18(s，1H)，5.66(d，J＝7.0Hz，1H)，5.16(t，J＝7.1Hz，1H)，4.66和4.37(AB，J＝16.4Hz，2H)，4.22(q，J＝7.4Hz，1H)，3.57(s，2H)，3.24-3.09(m，6H)，2.49(s，3H)，2.25(s，3H)，1.57-1.27(m，8H)，1.22(d，J＝7.2Hz，3H)；MS APCI，m/z＝987(M+Na+).LC/MS2.82min.HRMS(TOF ES+)C54H56N7O7BF2(M+H)的计算值964.4380，实测值964.4376. 如下制备原料(11d)
((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(3-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸甲酯(11a)使用类似于实施例(1g)中描述的步骤，所不同的是在DCM中使用[(6R，7S)-7-((S)-2-氨基-丙酰氨基)-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基]-乙酸甲酯(10c)(166mg，0.414mmol)作为胺组分，和间苯甲酰基苯乙酸(103mg，0.429mmol)作为酸组分，在二氧化硅上通过fcc纯化之后，得到标题化合物(11a)(245mg，95％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.87-7.66(m，4H)，7.63-7.18(m，14H)，6.16(d，J＝7.1Hz，1H)，5.85(d，J＝6.9Hz，1H)，5.71(d，J＝7.1Hz，1H)，5.17(t，J＝7.2Hz，1H)，4.67和4.54(AB，J＝17.3Hz，2H)，4.24(五重峰，J＝7.0Hz，1H)，3.80(s，3H)，3.56(s，2H)，1.20(d，J＝6.9Hz，3H)；MS APCI，m/z＝620(M+).LC/MS2.39min.
((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(3-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸(11b) 使用类似于实施例(1d)中描述的步骤，所不同的是使用((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(3-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸甲酯(11a)(245mg，0.395mmol)作为原料，得到标题化合物(11b)(234mg，97％)，其不经过进一步纯化而使用。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.90-7.38(m，15H)，7.37-7.11(m，3H)，6.70(d，J＝6.8Hz，1H)，5.57(d，J＝7.5Hz，1H)，5.23(t，J＝7.9Hz，1H)，4.45和3.93(d，J＝17.1Hz，2H)，4.08-3.93(m，1H)，3.81-3.62(m，1H)，3.67(s，2H)，0.94(d，J＝6.8Hz，3H)；MS APCI，m/z＝606(M+).LC/MS2.42min.
{5-[2-((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(3-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-氨基甲酸叔丁酯(11c) 使用类似于实施例(1g)中描述的步骤，所不同的是使用(5-氨基-戊基)-氨基甲酸叔丁酯(95mg，0.47mmol)作为胺组分，和((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(3-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酸(11b)(230mg，0.380mmol)作为酸组分，在二氧化硅上通过fcc纯化之后，得到标题化合物(11c)(231mg，77％)。1H NMR(300.132MHz，CDCl3)δ7.80(d，J＝7.3Hz，2H)，7.73-7.55(m，3H)，7.51-7.21(m，13H)，6.62-6.31(m，1H)，6.25(br s，0.5H)，5.95(br s，0.5H)，5.69(d，J＝7.5Hz，1H)，5.20-5.06(m，1H)，4.68-4.11(m，3H)，3.54(s，2H)，3.39-3.11(m，2H)，2.99(q，J＝6.1Hz，2H)，1.57-1.14(m，6H)，1.42(s，9H)，1.18(d，J＝6.9Hz，3H)；MS ES+，m/z＝790(M+).LC/MS2.52min.
实施例11(S)-N-{(6R，7S)-9-[(5-氨基-戊基氨基甲酰基)-甲基]-8-氧代-6-苯基-6，7，8，9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基}-2-[2-(3-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰胺(11d) 使用类似于实施例(1h)中描述的步骤，所不同的是使用{5-[2-((6R，7S)-7-{(S)-2-[2-(3-苯甲酰基-苯基)-乙酰氨基]-丙酰氨基}-8-氧代-6-苯基-7，8-二氢-6H-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-9-基)-乙酰氨基]-戊基}-氨基甲酸叔丁酯(11c)(231mg，0.292mmol)作为原料，得到标题化合物(11d)(211mg，基本上是定量的)，其不经过进一步纯化而使用。1H NMR(300.132MHz，MeOH)δ7.83-7.73(m，2H)，7.72-7.59(m，3H)，7.58-7.23(m，13H)，5.63(d，J＝7.2Hz，1H)，5.14(d，J＝7.1Hz，1H)，4.64和4.40(AB，J＝16.4Hz，2H)，4.21(q，J＝7.2Hz，1H)，3.54(s，2H)，3.28-3.16(m，2H)，2.66(t，J＝6.8Hz，2H)，1.60-1.42(m，4H)，1.40-1.26(m，2H)，1.20(d，J＝7.3Hz，3H)；MS APCI，m/z＝690(M+).LC/MS2.10min. 实施例12γ分泌酶洗涤剂提取测定(γ-Secretase Detergent ExtractAssay) γ分泌酶测定测量通过切断C100——截短形式的淀粉样前体蛋白(APP)而产生的淀粉样蛋白β(Aβ)40产物的量。该C100底物是从大肠杆菌包含体纯化的重组蛋白质。用洗涤剂提取HeLa 8A8细胞膜而制备该γ分泌酶复合体。该酶反应含有10μl规定浓度的抑制剂，其是从DMSO储备液稀释到96孔微板中的(DMSO的最终浓度保持在5％)。将反应缓冲液(50mM MES，pH6.5，含有100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，1mg/mL BSA，0.25％Chapso，0.01％PE，0.01％PC和蛋白酶混合物(protease cocktail))中的20μlC100底物(600nM最终浓度)加到该板中。加入从储备液稀释20倍的酶(10μl)来引发该反应。每次测定包括在反应缓冲液加C100中稀释的Aβ40标准曲线。将板在37℃培养3小时。培养期之后，加入50μl抗体混合物含有0.5％牛血清白蛋白和0.5％Tween 20的DPBS(Fisher#MT21031CV)中的0.16μg/ml的兔抗-Aβ40抗体(Biosource#44-3481)和0.25μg/ml的生物素化的4G8(Senetek#240-10)。然后在4℃将板培养过夜。次日上午，加入稀释在相同DPBS缓冲液中的0.0625mg/ml钌标记的山羊抗兔IgG(自行标记的)和125μg/ml链霉抗生物素蛋白珠(Streptavadin beads)(Igen#M280)的50μl混合物以检测切割产物。在室温培养一小时之后，使用Igen M Series设备通过电化学发光来定量结果。
实施例13γ分泌酶全细胞测定(GSWC) 测定用细胞的制备将稳定表达人类淀粉样前体蛋白(app)和早老蛋白i(presenelin i)的人类胚胎肾(hek)细胞在dmem培养基(fisher mt10013cv)中生长，该dmem培养基含有10％胎牛血清(fisher#mt135011cv)、0.2mg/mlg418(fisher#mt30234cr)和1倍浓度的抗生素/抗真菌混合物(fisher#mt30004ci)。在组织培养瓶中生长细胞，并且每周以1∶30的比传代。
在与试验化合物培养之前30分钟，利用含有3mM EDTA的DPBS(Fisher#MT21031CV)处理单层来收集细胞。将细胞再悬浮在完全生长培养基中，密度为2百万细胞/mL。
将试验化合物以3.3mM的浓度溶于DMSO中。由该储备液，在细胞的完全生长培养基中制备稀释系列。然后将稀释系列转移到96孔测定板(Costar#3595)中，每孔100μL。将细胞(100μL)加到含试验化合物的各孔中。还包含两个对照物，一个仅含有细胞(总)，另一个仅含有生长培养基(背景)。在细胞培养箱中，将细胞与化合物一起培养14-16小时。
在培养14-16小时结束时，将100μL上清液从每孔中转移到聚丙烯96孔板中。将该上清液与100μLDPBS(Fisher#MT21031CV)混合，该DPBS含有0.5％牛血清白蛋白、0.5％Tween(或等价物)20、0.25μg/mL生物素化的4G8(Senetek#240-10)、0.18μg/mL兔抗-Aβ40抗体(Biosource#44-3481)、0.045μg/mL钌标记的山羊抗兔IgG(自行标记的)和60μg/mL的链霉抗生物素蛋白珠(Streptavadin beads)(Igen#M280)。在板摇床上于4℃培养该混合物4-6小时。
在培养4-6小时结束时，将板升温至室温，使用Igen M8分析器检测产生的Aβ40。将原始数据导入到Microsoft Excel软件中。使用Excel-Fit计算试验化合物抑制Aβ40产生的IC50值。
权利要求
1.式(I)的化合物
其中
R1选自间苯甲酰基、对苯甲酰基或对叠氮基；
R2独立地选自H、-CH3、
或
R3独立地选自H或
其中n为2或3；并且R4选自
或
2.权利要求1的化合物，其选自
3.权利要求1的化合物，其选自
N-[5-({[(2R，3R)-3-({N-[(3-苯甲酰苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基}氨基)-2-苯基-3，4-二氢-1，5-苯并氧氮杂-5(2H)-基]乙酰基}氨基)戊基]-4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰胺；
N1-[(2R，3R)-5-(2-氧代-2-{[5-({4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰基}氨基)戊基]氨基}乙基)-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-3-基]-N2-[(4-三氮杂-1，2-二烯-2--1-基苯基)乙酰基]-L-丙氨酰胺；
N-[5-({[(2S，3S)-3-({N-[(3-苯甲酰苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基}氨基)-2-苯基-3，4-二氢-1，5-苯并氧氮杂-5(2H)-基]乙酰基}氨基)戊基]-4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰胺；
N1-[(2S，3S)-5-(2-氧代-2-{[5-({4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰基}氨基)戊基]氨基}乙基)-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-3-基]-N2-[(4-三氮杂-1，2-二烯-2--1-基苯基)乙酰基]-L-丙氨酰胺；
N-(5-{[(2R，3R)-3-({N-[(3-苯甲酰苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基}氨基)-5-甲基-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-7-基]氧}戊基)-4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰胺；
N1-((2R，3R)-5-甲基-7-{[5-({4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰基}氨基)戊基]氧}-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-3-基)-N2-[(4-三氮杂-1，2-二烯-2--1-基苯基)乙酰基]-L-丙氨酰胺；
N-(5-{[(2S，3S)-3-({N-[(3-苯甲酰苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基}氨基)-5-甲基-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-7-基]氧}戊基)-4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰胺；和
N1-((2S，3S)-5-甲基-7-{[5-({4-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]丁酰基}氨基)戊基]氧}-2-苯基-2，3，4，5-四氢-1，5-苯并氧氮杂-3-基)-N2-[(4-三氮杂-1，2-二烯-2--1-基苯基)乙酰基]-L-丙氨酰胺。
全文摘要
本发明涉及具有通式(I)的新分子探针，其用于表征、检测、定位和分离γ-分泌酶。
文档编号C07F5/02GK101115730SQ200580047928
公开日2008年1月30日 申请日期2005年12月14日 优先权日2004年12月14日
发明者巴里·格林伯格, 丹尼尔·C·希尔, 罗伯特·雅各布斯, 桑格拉姆·S·西索迪亚 申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司, 芝加哥大学