专利名称：制备二肽的方法以及该方法的中间产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备下式1的二肽的方法， 其中G是一个保护基，而N保护性L-亮氨酸在一种活化剂存在下与L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺偶合。
WO-A-96/11209公开的方法中N-(1，1-二甲基乙氧基)羰基-L-亮氨酸与L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺偶合。
该已知方法的缺点是使用昂贵的保护基团，因此从商业的观点来看，此方法缺少吸引力。本发明提供一种具有商业价值的方法，用于制备在制备例如WO-A-96/11209介绍的药物中的上述中间产物。
按照本发明应用甲酰基作保护基来实现此目的。
涉及两个氨基酸偶合的二肽偶合是通常的已知方法，并且在文献中有详细说明。在这些偶合中，最终的N端氨基酸的活化酸基团与最终的C端氨基酸或氨基酸衍生物的氨基反应。本方法中最终的N端氨基酸的氨基基团借助于保护基团保护。
本发明的方法中，两种富含对映异构体的氨基酸进行偶合。富含对映异构体的氨基酸的对映体过量优选大于80％，尤其优选大于90％，更特别优选大于98％。众所周知，氨基酸偶合时N端氨基酸可能产生外消旋作用。当使用甲酰基保护基时尤其如此，例如thehandbooks Houben-Weyl，Band 15/1(1974)，第166页以及在ThePeptides，Academic Press 1979，第1卷，第279页中介绍的那样。因此，人们不将甲酰基保护基团用于富含对映异构体的氨基酸偶合。目前，申请人发现，当按照本发明用甲酰基作保护基团进行偶合时，不发生外消旋或只有很低程度的外消旋。此外，申请人发现，假如发生外消旋作用，根据本发明的偶合产物尤其适合通过结晶富集需要的非对映形。
本发明方法的另一优势是在所述方法中可以使用廉价活化剂。
本发明方法中使用的N-甲酰基-L-亮氨酸可以用已知方法制备，举例来说使L-亮氨酸与甲酸以及例如一种酸酐接触制备。优选使用醋酸酐。
L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的制备举例来说能够由L-叔亮氨酸如下制备L-叔亮氨酸和光气转换成L-叔亮氨酸-N-羧基酐，再用N-甲胺将它转换成L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺。
在本发明方法中使用一种活化剂和一种碱活化N-甲酰基-L-亮氨酸，活化剂优选具有空间位阻的酰基氯或氯甲酸烷酯。这种活化步骤为众所周知的方法并且在肽偶合中经常应用。因此，选用的碱优选为所述活化步骤中使用的、外消旋程度低的已知碱。作为碱优选使用N-甲基吗啉。
进行活化的温度不是非常重要，实践中通常为-30℃至+30℃，优选-20℃至+10℃。
如果需要，在溶剂中进行活化，优选在反应混合物中呈惰性的溶剂。酯性溶剂实例有酯类，尤其是醋酸乙酯、醋酸异丙酯和醋酸异丁酯；醚类，尤其是四氢呋喃(THF)、甲基-叔-丁基醚(MTBE)以及二氧杂环己烷；腈类，尤其是乙腈。
在一个实施方案中，首先进行活化，然后进行偶合步骤。对于偶合，使活化的N-甲酰基-L-亮氨酸与L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺接触。优选使用L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺溶液。
原则上，偶合反应温度与活化作用温度保持一致。优选偶合温度与活化温度大致相同。L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的合适溶剂的实例有醇类，尤其是甲醇、乙醇以及异丙醇；酯类，尤其是醋酸乙酯、醋酸异丙酯以及醋酸异丁酯；醚类，尤其是THF、MTBE和二氧杂环己烷。
另一方面，也可以采用一步法进行活化以及偶合反应，其中N-甲酰基-亮氨酸、L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺以及所述碱溶解于上述的合适溶剂中，并将所述活化剂加入该溶液。
然后，合成的N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺可以用通常的已知方法去甲酰化，例如在酸性环境中。去甲酰化可以例如在水性环境、水/醇混合物或两相体系中进行。
进行去甲酰的温度例如为20℃-110℃，优选40℃-80℃。如果需要，例如通过结晶可以纯化合成的N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺或L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺。令人惊奇的发现是，肽偶合发生外消旋的情况下，结晶可增加保护或未保护的二肽中的N端氨基酸的对映体过量。
可用于结晶的合适溶剂的实例有烃类，尤其是庚烷和己烷；酯类，尤其是醋酸异丙酯、醋酸异丁酯和醋酸乙酯；醚类，尤其是MTBE；醇类，尤其是甲醇、乙醇、异丙醇以及丁醇；或者它们的混合物。合适的溶剂混合物实例为庚烷和醋酸异丙酯的混合物。
进行结晶的温度并不特别重要，主要取决于所选溶剂的物理参数，尤其是沸点。实践中，通常在20℃-100℃之间进行结晶。
根据肽偶合的具体实施方案，例如通过萃取或结晶分离获得的中间产物N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺可能是有利的。
获得的L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺可用于例如制备药物，例如WO-A-96/11209和WO-A-97/12902介绍的N-(α-任选取代的巯基羧基)-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺。举例来说，α-任选取代的巯基羧基是式R1S-C(R2)-C(O)-的基团，其中R1是氢或R3CO，其中R3是C1-4烷基、(C1-4烷基)芳基、(C1-6烷基)杂芳基、C3-6环烷基、(C3-6环烷基)C1-4烷基、C2-6链烯基、(C2-6链烯基)芳基、芳基或杂芳基；R2是H或C1-4烷基-C(O)-A-或C1-4烷基-NH-C(O)-A基团，其中A是 p和q分别独立为0或1R4＝H或C1-6烷基(各R4彼此独立)Y和Z各自独立为H或(C0-4烷基)R5，其中R5是NHR4、N(R4)2(R4彼此独立)、COOR4、CONHR4、NHCO2R4、NHSO2R4或NHCOR4以及W是O、S(O)m，m＝0、1或2，或者为NR6R6＝H、C1-4烷基、COR7、CO2R7、CONHR7或SO2R7R7＝H、C1-4烷基、芳基、杂芳基、(C1-4烷基)芳基或(C1-4烷基)杂芳基R和S分别独立为CH或N。
这些化合物可以用已知方法制备，例如活化取代或非取代的α-巯基羧酸，然后使用经典肽偶合方法将它与据本发明获得的二肽L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺偶合，见WO-A-96/11209和WO-A-97/12902介绍。
现在以实施例为基础阐明本发明，当然本发明并不仅限于此。
实施例I由N-甲酰基-L-亮氨酸和L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺制备N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺在-18℃的氮环境中，将氯甲酸异丁基酯(6.5g，48mmol)加入N-甲酰基-L-亮氨酸(8.0g，50mmol)的四氢呋喃(125ml)溶液中。然后将N-甲基吗啉(4.8g，48mmol)滴加入溶液，控制滴加速度使溶液温度保持＜-15℃。形成沉淀物。
持续搅拌15min后，加入L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺(6.5g，45mmol)的四氢呋喃(50ml)溶液，加入时保持溶液温度＜-15℃。随后在-18℃下持续搅拌1小时。
使反应混合物加热到0℃并在此温度下加入水(100g)。然后在真空下蒸馏除去THF。加入醋酸异丙酯(75ml)，然后用盐酸将反应混合物的pH值调至1.5。分层后，分别用50和35ml的醋酸异丙酯萃取水溶液相两次。然后用50和25ml的饱和碳酸氢钠溶液洗涤收集的有机相，最后用25ml水洗涤。然后在真空下蒸发有机相。
以良好产率获得了N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，对映体过量(L-亮氨酸部分)为99％(HPLC)。
实施例II由N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺制备L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺11.7g(41mmol)的N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺(见实施例I)悬浮于1M HCl(100ml)中并加热到40℃。在此温度下搅拌18小时后(所有的原料都溶解入溶液中)，冷却到室温，然后用50ml的醋酸异丙酯萃取。
分层后，用50％的氢氧化钠溶液将水相的pH值调至10。用醋酸异丙酯(75ml)萃取两次。收集的有机相在真空下蒸发。
将残留物悬浮于庚烷(75ml)中并加热到65℃。然后加入恰好使所有原料溶解的醋酸异丙酯量。通过冷却到室温结晶并过滤后，用庚烷(25ml)洗涤结晶物两次然后干燥。以良好产率获得了L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，纯度＝＞98％(HPLC)对映体过量(L-亮氨酸部分)＝99％(HPLC)。
实施例III由N-甲酰基-L-亮氨酸和L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺制备N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺在-15℃的氮环境中，氯甲酸异丁基酯(12.3g，90mmol)配入到N-甲酰基-L-亮氨酸(15.9g，100mmol)的醋酸异丙酯(85ml)悬浮液中。然后将N-甲基吗啉(9.1g，90mmol)的醋酸异丙酯(25ml)溶液滴加入悬浮液，滴加速度使温度保持在＜-10℃。
在持续搅拌90分钟后，形成的悬浮液加入到冷却的L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺(13.0g，90mmol)的甲醇(65ml)溶液中，加入时溶液温度保持＜-10℃。随后在-10℃持续搅拌30分钟。
将反应混合物加热到室温并在此温度下搅拌2小时。在反应混合物中加入水(100ml)，然后用37％盐酸水溶液将pH值调至1.0。分层后，水溶液相用75ml的醋酸异丙酯洗涤两次。收集的有机相用100和50ml的饱和碳酸钠溶液分别洗涤。
在真空下蒸发有机相。获得N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的对映体过量(L-亮氨酸部分)为98％(HPLC)。
实施例IV由N-甲酰基-L-亮氨酸和L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺制备N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺按照实施例III所述制备，但是温度变为0-5℃。获得N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的对映体过量(L-亮氨酸部分)为86％(HPLC)。
实施例V由N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺制备L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺按照实施例II所述处理实施例IV获得的物质。获得L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的对映体过量(L-亮氨酸部分)为95％(HPLC)。
权利要求
1.一种制备下式1的二肽的方法， 其中G为保护基，N保护性L-亮氨酸在活化剂存在下与L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺偶合，该方法的特征在于甲酰基用作保护基。
2.根据权利要求1的方法，其中L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的对映体过量大于98％。
3.根据权利要求1或2的方法，其中N-甲酰基-L-亮氨酸的对映体过量大于98％。
4.根据权利要求1-3任意一项的方法，其中获得的N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺接着进行一次或多次结晶。
5.根据权利要求1-4任意一项的方法，其中随后将获得的二肽去甲酰化。
6.根据权利要求5的方法，其中随后将获得的L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺进行一次或多次结晶。
7.根据权利要求5或6的方法，其中随后将所述L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺与取代或未取代的α-巯基羧酸偶合形成相应的N-α-任选取代的巯基羧基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺。
8.N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺。
9.N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，该二肽中的N端氨基酸的对映体过量大于80％。
10.N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，该二肽中的N端氨基酸的对映体过量大于98％。
11.根据权利要求9或10的N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，其非对映体过量大于80％。
12.根据权利要求11的N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，其非对映体过量大于98％。
13.根据权利要求8-12任意一项的N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺在制备药物中的用途。
全文摘要
制备N－甲酰基－L－亮氨酰－L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺的方法,其中N－甲酰基－L－亮氨酸与L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺在一种活化剂存在下偶合。优选使用对映体过量大于98%的L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺和对映体过量大于98%的N－甲酰基－L－亮氨酸。如果需要,将获得的二肽接着去甲酰化并将合成的N－甲酰基－L－亮氨酰－L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺或L－亮氨酰－L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺进一步进行一次或多次结晶。本发明也涉及N－甲酰基－L－亮氨酰－L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺及其在制备药物中的用途。
文档编号C07K1/06GK1382155SQ00814737
公开日2002年11月27日 申请日期2000年9月8日 优先权日1999年10月27日
发明者W·H·J·贝斯藤, Q·B·布罗克斯特曼, M·J·M·普劳姆 申请人:Dsm有限公司