专利名称：抽提,纯化脱氧核糖核酸,核糖核酸,蛋白质的新材料及方法
技术领域：
本发明公开了一种用于抽提，纯化脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，蛋白质的新材料，以及以该材料为基础的对脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)和蛋白质进行抽提，纯化的一系列方法。这种新的材料和方法能够被广泛地用于医学，法医学，生物学，植物和动物学中对脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)和蛋白质进行抽提及纯化。
脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)及蛋白质是构成生命的物质基础。改进抽提及纯化这些物质的方法一直是中外科学家的研究努力方向。目前现存的DNA抽提，纯化方法中，主要存在的问题是1)采用了一些对生命有害的有毒物质，如氯仿，酚等，由于对环境有严重污染，故只限于实验室研究。2)DNA得量及纯度都很低，并且伴有核糖核酸(RNA)和蛋白质的污染。3)材料费用昂贵，不利于广泛推广应用。
在目前现存的RNA抽提，纯化方法过程中，科学家们普遍感到困难的有四个方面1)抽提环境中广泛存在RNase酶，它们能迅速降解RNA；2)抽提RNA的得量少；3)混与其间的DNA和蛋白质污染很难去除；4)常常需要采用一些对生命有害的有毒物质。在目前现存的蛋白质抽提方法中所存在的主要问题是能否抽提纯化得到稳定，有活性的纯蛋白质。因为抽提，纯化蛋白质过程中不仅要除去DNA，RNA的污染，还要清除不需要的蛋白质。
为了克服以上所存在的问题，本文介绍一种新的应用于抽提，纯化脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，蛋白质的新材料及其系列相应的抽提，纯化方法。其新材料的制备及方法如下基本原料的制备本文用一种以中国江西景德镇为主要产地的高岭土(瓷土)或瓷石为原始材料，其主要化学成份(91％-95％)为Al2Si2O5(OH)4，次成份(5％-9％)为TiO2，Fe2O3，MnO，MgO，颜色为白色或灰色。瓷土或瓷石制成直径为1-25um的粉末，经紫外线照射24小时后，再经高温处理，干燥后为基本原料。该粉末原料用来1)制成离心柱，2)直接用于DNA，RNA和蛋白质的抽提纯化。脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，蛋白质的相应的抽提，纯化方法一.脱氧核糖核酸(DNA)的抽提，纯化方法基本原理在PH值为8.0-8.9高浓度盐的条件下，DNA与瓷粉末结合，在同样PH值的低浓度盐的条件下，DNA与瓷粉末分离。
DNA的来源动植物的细胞(107*-108)，捣碎的组织(30mg-50mg)，细菌(109-1010)，酵母菌(108-109)或血细胞(107*-108)。
溶液的配置A.1)50mM乙酸钠(Sodium acetate)，0.3mM乙二胺四乙酸(EDTA)，核糖核酸酶RNase A(100ug/ml)2)50mM Tris-HCl PH8.0，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，核糖核酸酶RNase A(100ug/ml).3)1％Trlton-X，1％十二烷基硫酸钠(1％SDS)，0.8mg/ml蛋白酶K(Proteinase K)，RNase A(100ug/ml).4)0.5M山梨醇(sorbitol)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，50mM Tris-HClPH8.0.2％巯基乙醇(mercaptoethanol)，1mg/ml溶细胞酶(lyticase)，RNase A(100ug/ml).5)50mM Tris-HCl PH8.0，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，核糖核酸酶RNase A(100ug/ml)，0.8mg/ml蛋白酶K(Proteinase K)6)0.5-1N NaOHB.300mM NaOH，0.5％SDSC.2.5M乙酸钾(potassium acetate)PH5.0D.150mM氯化钠，50mM Tris-HCl PH8.0，3mM乙二胺四乙酸(EDTA)，用100％乙醇以1∶4比率稀释。E.10mM Tri-HCl PH8.0，或水，或TE(10mM Tri-HCl PH8.0，1mM EDTA)
操作过程A.取含质粒的单细菌为开始物，放入含6mlLB培养液的试管内经过37℃震荡培养12-16小时，离心后取沉淀物经生理盐水清洗后，再离心除去上清，取沉淀物加入250ul溶液A1充份混合后，再加入等量溶液B，混合置于常温下5分钟后再加入350ul溶液C，充份混合后立即离心14000rpm 15-30分钟后吸取上清液于清洁试管内，加入瓷土离心柱，离心12000rpm 3分钟后，除去液体，加入750ul溶液D后离心，完全去除液体后，将离心柱移入一新清洁试管内，加入37℃溶液E50ul离心12000rpm 2分钟后，离心所得的50ul离心液即为所需的脱氧核糖核酸(DNA)。B.取动物细胞为开始物，动物的细胞(107*-108)加入250ul溶液A2充份混合后，再加入等量溶液B，混合置于常温下，5分钟后再加入350ul溶液C，充份混合后立即离心14000rpm 15-30分钟后，吸取上清液于清洁试管内，加入瓷土离心柱，离心12000rpm 3分钟后，除去液体，加入750ul溶液D后离心，完全去除液体后，将离心柱移入一新清洁试管内，加入37℃溶液E 50ul离心12000rpm 2分钟后，离心所得的50ul离心液即为所需的DNA。C.取血液为开始物，血液细胞(107*-108)离心后取沉淀物加入250ul溶液A3充份混合后，置于37℃温度下2-4小时，加入等量溶液B，混合置于常温下，5分钟后再加入350ul溶液C，充份混合后立即离心14000rpm 15-30分钟后，吸取上清液于清洁试管内，加入瓷土离心柱，离心12000rpm 3分钟后，除去液体，加入750ul溶液D后离心，完全去除液体后，将离心柱移入一新清洁试管内，加入37℃溶液E 50ul离心12000rpm 2分钟后，离心所得的50ul离心液即为所需的DNA。D.取含质粒的酵母菌为开始物，酵母菌(108-109)加入250ul溶液A4充份混合后，置于37℃温度下2-4小时再加入等量溶液B，混合置于常温下5分钟后再加入350ul溶液C，充份混合后立即离心14000rpm 15-30分钟后，吸取上清液于清洁试管内，加入瓷土离心柱，离心12000rpm 3分钟后，除去液体，加入750ul溶液D后离心，完全去除液体后，将离心柱移入一新清洁试管内，加入37℃溶液E50ul离心12000rpm 2分钟后，离心所得的50ul离心液即为所需的DNA。E.取捣碎的组织为开始物，捣碎的组织(30mg-50mg)加入250ul溶液A5充份混合后，置于37℃温度下2-4小时，加入等量溶液B，混合置于常温下，5分钟后再加入350ul溶液C，充份混合后立即离心14000rpm 15-30分钟后，吸取上清液于清洁试管内，加入瓷土离心柱，离心12000rpm 3分钟后，除去液体，加入37℃溶液E 50ul离心12000rpm 2分钟后，离心所得的50ul离心液即为所需的DNA。F.取捣碎的植物叶为开始物，取捣碎的植物叶(30mg-50mg)加入500ul溶液A6充份混合后，加入350ul溶液C，充份混合后立即离心14000rpm 15-30分钟后，吸取上清液于清洁试管内，加入瓷土离心柱，离心12000rpm 3分钟后，除去液体，加入750ul溶液D后离心，完全去除液体后，将离心柱移入一新清洁试管内，加入37℃溶液E50ul离心12000rpm 2分钟后，离心所得的50ul离心液即为所需的DNA。二.核糖核酸(RNA)的抽提，纯化方法基本原理在一种高盐PH值为6.5-7.0并含有多种核糖核酸酶抑制剂及一定比例的乙醇的条件下，RNA与瓷粉末结合，在水溶液中，RNA与瓷粉末分离。
RNA的来源动植物的细胞(107*-108)，捣碎的组织(30mg-50mg)，细菌(109-1010)，酵母菌(108-109)或血液细胞(107*-108)。
溶液的配置A.4-5M硫氰酸胍(guanidine thiocyanate)或异硫氰酸胍(guanidineisothiocyanate)或氯化胍(guanidine chloride)，25mM柠檬酸钠(sodiumcitrate)，0.5％sarcosyl，0.1％二巯基乙醇(2-mercaptoethanol)，0.1％尿素，以上成份用0.1％焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate DEPC)水溶液配制。注二巯基乙醇(2-mercaptoethanol)需在使用前加入。B.50mM Tri-HCl PH6.5，3mM EDTA，2/3 100％乙醇，以上成份用0.1％焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate DEPC)水溶液配制。C.0.1％DEPC水溶液配制过程将1ml DEPC加入1000ml双蒸水中，在常温下搅拌24小时，再用高温消毒。
操作过程取开始物(见RNA的来源)加入700ul溶液A后，用均化器使细胞完全裂解，然后在4℃条件下加入1/2体积的100％乙醇，混合后加入离心柱，以12000rpm离心20秒钟后，去除离心液，再加入700ul溶液A加入1/2体积的100％乙醇以12000rpm离心20秒钟，去除离心液后再加入750ul溶液B，以12000rpm离心20秒钟，重复二次，去除离心液后再以12000rpm离心30秒钟。将离心柱移入一新清洁试管内，加入溶液C 50ul以12000rpm离心1分钟后，离心所得的50ul离心液即为所需的RNA。二.蛋白质的抽提，纯化方法基本原理含Zn2+或Cu2或Ni2+的N，N，N′-三羧基乙二胺[N，N，N′-tris(carboxymethy)ethylenediamine(TED)]与瓷粉末结合形成大孔隙界面，含6X组胺(Histidine)的重组蛋白经此界面，蛋白质与上述金属离子结合，其他物质进大孔隙被筛除。因咪唑(imidazole)与6X组胺的结构相似，以高浓度咪唑可将其置换，重而达到纯化蛋白质的目的。
蛋白质的来源含6X组胺重组蛋白的细菌，动物细胞或酵母菌。
离心柱的制备按1∶1的重量比例将瓷粉末(直径为15-20um)和N，N，N′-三羧基乙二胺充分混合制成离心柱，用4倍体积的1M氯化钠，50mM EDTA溶液清洗一次，再用4倍与瓷粉体积的水清洗离心柱三次。然后用0.5克ZnCl2或CuCl2或NiSO4溶于100ml水中加入离心柱，充分和瓷粉混合后再用4倍体积的20mM Tris(PH8.0)，0.5M氯化钠清洗一次。
溶液的配置A.60mM NaH2PO4PH8.0，300mM NaCl，溶菌酶(lysozyme)0.8mg/mlB.60mM NaH2PO4PH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑C.60mM NaH2PO4PH8.0，300mM NaCl，250mM咪唑操作过程取100ml开始物(见蛋白质的来源)以5000rpm在4℃条件下离心5分钟，去除上清，将沉淀物加入2ml溶液A后，在4℃条件下充分混合2小时。在相同条件下用声波将细胞完全裂解后，以16000rpm在4℃条件下离心2小时取出上清，加入离心柱，再以12000rpm在4℃条件下离心2分钟。去除离心液，在离心柱上加入750ul溶液B，再以相同条件离心2分钟，去除离心液，将离心柱转入一新试管内加入750ul溶液C，4℃条件下放置半小时，再以相同条件离心2分钟，离心液即为所需的蛋白质。本发明与目前世界现有的同类技术比较有如下优点1.使用材料价格便宜，易于推广使用。2.操作安全，完全没有涉及如氯仿，酚等对人类及环境有害的毒性物质，可安全应用于对临床病例的诊断和治疗。3.所得物纯度高，稳定性和质量上都非常可靠。
实施该发明最好的方法就是技术培训。脱氧核糖核酸(DNA)的抽提及纯化的实施，只需按照说明书讲解的去做即可。核糖核酸(RNA)及蛋白质的抽提及纯化需要严格的外部环境及熟练的技术，但一般技术人员经过培训后就可以实施。下面是三个实施实例实例一细菌质粒DNA的抽提及纯化实施过程从6mlLB培养液中抽提及纯化15-20ug高复制的质粒DNA溶液的配置A.1)50mM乙酸钠(Sodium acetate)，0.3mM乙二胺四乙酸(EDTA)，核糖核酸酶RNase A(100ug/ml)。B.300mM NaOH，0.5％SDS。C.2.5M乙酸钾(potassium acetate)PH5.0。D.150mM氯化钠，50mM Tris-HCl PH8.0，3mM乙二胺四乙酸(EDTA)，用于100％乙醇以1∶4比率稀释。E.10mM Tri-HCl PH8.0，或水，或TE(10mM Tri-HCl PH8.0，1mM EDTA)。操作过程1.将离心所得的细菌细胞溶于250ul溶液A，并转移至1.5ml的离心试管充分混合至不能看见细胞碎片；2.加入250ul溶液B，充分混合；3.再加入350ul溶液C立即混合，并在常温下离心14000rpm 15分钟；4.将上清转移至瓷粉离心柱上，离心8000rpm 1分钟，除去离心液后加入0.75ml的溶液D，离心8000rpm 1分钟；5.除去离心液后再离心8000rpm 2分钟，将瓷粉离心柱转移至一新的离心试管，加入100ul 37℃溶液E，常温下放置5分钟，离心后所得100ul离心液即含有15-20ug纯的质粒DNA。实例二从培养的白血病细胞中抽提及纯化RNA溶液的配置A.4-5M硫氰酸胍(guanidine thiocyanate)或异硫氰酸胍(guanidineisothiocyanate)或氯化胍(guanidine chloride)，25mM柠檬酸钠(sodiumcitrate)，0.5％sarcosyl，0.1％二巯基乙醇(2-mercaptoethanol)，0.1％尿素，以上成份用0.1％焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate DEPC)水溶液配制。注二巯基乙醇(2-mercaptoethanol)需在使用前加入。B.50mM Tri-HCl PH6.5，3mM EDTA，2/3 100％乙醇，以上成份用0.1％焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate DEPC)水溶液配制。C.0.1％DEPC水溶液配制过程将1ml DEPC加入1000ml双蒸水中，在常温下搅拌24小时，再用高温消毒。
操作过程1.取108-109培养的白血病细胞离心5000rpm5分钟后，沉淀中加入1ml生理盐水清洗后离心5000rpm 5分钟后，在沉淀中加入600ul溶液A，用均化器使细胞完全裂解；2.再加入600ul的100％乙醇到裂解的细胞中，充分混合但不要离心；3.将此混合液加入瓷粉离心柱上，4℃离心14000rpm 20秒，除去离心液；4.加入600ul溶液A，600ul100％乙醇的混合液清洗瓷粉离心柱，再4℃离心14000rpm 20秒，除去离心液；5.再加入500ul溶液B，4℃离心14000rpm 2分钟；6.将瓷粉离心柱转移至一新的1.5ml离心试管，加入100ul溶液C，4℃下放置5分钟，离心后所得100ul离心液即得100ul(含有30-50ug)纯化的细胞是总RNA。实例三重组蛋白在细菌中表达的分离及纯化离心柱的制备按1∶1的重量比例将瓷粉末(直径为15-20um)和N，N，N′-三羧基乙二胺充分混合制成离心柱，用4倍体积的1M氯化钠，50mM EDTA溶液清洗一次，再用4倍与瓷粉体积的水清洗离心柱三次。然后用0.5克ZnCl2或CuCl2或NiSO4溶于100ml水中加入离心柱，充分和瓷粉混合后再用4倍体积的20mM Tris(PH8.0)，0.5M氯化钠清洗一次。
溶液的配置A.60mM NaH2PO4PH8.0，300mM NaCl，溶菌酶(lysozyme)0.8mg/mlB.60mM NaH2PO4PH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑C.60mM NaH2PO4PH8.0，300mM NaCl，250mM咪唑操作过程取100ml含有6X组胺重组蛋白的细菌为开始物，以5000rpm在4℃条件下离心5分钟，去除上清，将沉淀物加入2ml溶液A后，在4℃条件下充分混合2小时。在相同条件下用声波将细胞完全裂解后，以16000rpm在4℃条件下离心2小时。取出上清，加入离心柱，再以12000rpm在4℃条件下离心2分钟。去除离心液，在离心柱上加入750ul溶液B，再以相同条件离心2分钟，去除离心液，将离心柱转入一新试管内加入750ul溶液C，4℃条件下放置半小时，再以相同条件离心2分钟，离心液即为所需的蛋白质。
权利要求
一种用于抽提，纯化脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，蛋白质的新材料，以及以该材料为基础的对脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)和蛋白质进行抽提，纯化的系列方法，其特征在于1.基本材料为瓷土或瓷石制成的粉末，其主要成份(91％-95％)为(Al2Si2O5)(OH)4，次要成份(5％-9％)为MgO2，TiO2，Fe2O3，MnO2；
2.DNA的抽提纯化方法为在PH值为8.0-8.9的高浓度盐的条件下，DNA与瓷粉末结合，在相同PH值的低浓度盐条件下，DNA与瓷粉末分离；
3.RNA的抽提纯化方法为在一种高盐PH值为6.5-7.0并含有多种核糖核酸酶抑制剂(硫氰酸胍或异硫氰酸胍或氯化胍，2-巯基乙醇，尿素，焦碳酸二乙酯)及50％比例乙醇的条件下，RNA与瓷粉末结合，在水溶液中，RNA与瓷粉末分离；
4.蛋白质的抽提纯化方法为含Zn2+或Cu2+或Ni2+的N，N，N’-三羧基乙二胺与瓷粉末结合形成大孔隙界面，含6X组胺的重组蛋白质与上述金属离子结合，其它物质经大孔隙被筛除。因咪唑与6X组胺的结构相似，以高浓度咪唑可将含6X组胺的重组蛋白质置换，从而达到纯化蛋白质的目的。
全文摘要
本发明公开了一种用于抽提,纯化脱氧核糖核酸(DNA),核糖核酸(RNA),蛋白质的新材料,以及以该材料为基础的对脱氧核糖核酸(DNA),核糖核酸(RNA)和蛋白质进行抽提,纯化的一系列方法。新材料为瓷土或瓷石,主要化学成份(91%－95%)为Al
文档编号C07H1/06GK1368505SQ0110529
公开日2002年9月11日 申请日期2001年2月6日 优先权日2001年2月6日
发明者耿东进 申请人:耿东进