专利名称：在人正常神经胶质细胞与神经胶质细胞瘤中具有表达差异的基因necl2的制作方法
技术领域：
本发明为一个在人神经胶质细胞瘤与正常神经系统中具有明显表达差异的基因/蛋白，人的类nectin蛋白2的基因及其编码蛋白，(nectin like gene/protein，NECL2/NECL2)，涉及生物医学高技术中新基因、新蛋白的开发与应用领域。
免疫球蛋白超家族是神经系统发育及功能维持的决定性因素之一。这一家族的成员都一个或多个Ig结构域，为GPI锚定蛋白，或为单跨膜蛋白。这些免疫球蛋白超家族成员在神经形态发生的多个方面如在神经元前体的迁移，神经突起的成簇以及接触依赖的轴突导向等都有重要作用。免疫球蛋白超家族成员不仅结构多样，而且在与其他免疫球蛋白成员或其他蛋白家族成员相互作用时也表现出高度的复杂性。人的脊髓灰质炎病毒受体(Pvr)是免疫球蛋白超家族的一个成员，有一个NH2-信号序列，三个胞外Ig样结构域，一个穿膜区和一个胞质尾巴。Pvr的序列类似物nectin-1，nectin-2 and nectin-3，它们与Pvr有同样的结构域组成形式。Nectin-1 and Nectin-2蛋白的胞内区与1-afadin(一个肌动蛋白结合蛋白)相互作用，并通过1-afadin与细胞骨架相连。而我们实验室克隆到的NECL2，是免疫球蛋白超家族的一个新成员，与脊髓灰质炎病毒和nectin类似，都有三个Ig样结构域，一个穿膜区和一个胞质尾巴。其中胞质部分与红细胞膜蛋白Glycophorin C胞内区有55％的一致性。而且NECL2与本室以前克隆到的BL1同源性为56％，胞内区同源性达85％，属于一个新的免疫球蛋白家族。Northern杂交证实NECL2在多种组织中表达，在成人小脑、大脑皮层、丘脑、下丘脑、垂体、睾丸、甲状腺及胎盘高表达，在胎儿脑、肝脏与肺中表达较高。原杂和组化实验表明NECL2在正常人的胶质细胞不表达，而在胶质瘤病人的胶质细胞中有明显表达。利用IAsys验证了NECL2和蛋白4.1家族的体外相互作用。
发明目的克隆在在人神经胶质细胞瘤与正常神经系统中具有明显表达差异的基因NECL2，表达其编码蛋白，阐明NECL2蛋白在神经系统中与细胞骨架蛋白的相互关系，以及从分子水平上阐明其表达差异在神经胶质细胞瘤中机理，从而为干预肿瘤细胞的增殖提供可能的抑癌基因和新药筛选的靶分子。内容与要求本发明的内容是应用基因组信息学原理、聚合酶链式反应(PCR)、cDNA文库筛选、分子克隆、DNA序列测定技术克隆神经系统高度表达基因NECL2，并用Northern杂交及原位杂交技术进行了组织细胞与病理表达分析。
该基因/蛋白达到的技术指标为1.人NECL2全长cDNA为3512bp，其阅读框架为1326bp，编码442个氨基酸。
2.该基因所编码的蛋白N端与nectin家族中的其他成员有较高的同源性，并且有三个Ig结构域。C端与红细胞的Glophorin C有55％的一致性，与蛋白4.1家族的相互作用已得到Iasys验证。
3.将NECL2 cDNA全长连至黄色荧光蛋白载体中，转染BT325细胞，很明显NECL2定位在细胞膜上。
4.人NECL2基因在成人与胎儿神经系统中高度表达。NECL2广泛表达，除骨骼肌为3kb左右转录本外，在其余组织皆有1.8kb及4.5kb两个转录本，在脑中以4.5kb转录本为主。在小鼠中存在NECL2的同源基因，其表达谱要广泛的多。原位杂交显示其在大脑皮层，海马，齿状回，脑干的多种神经核团及脊髓前后角神经元细胞中高度表达；在正常胶质细胞中无明显信号。神经胶质细胞瘤的原位杂交及免疫组化显示胶质细胞瘤中有明显信号。
5.该基因及其编码蛋白与神经系统正常生理功能的维持及肿瘤发生等生命现象密切相关，可用于脑发育相关疾病，肿瘤发生的基因诊断和基因治疗，还可用于新药的设计与开发。
载有心、脑、肾、肺、肝、胎盘、骨骼肌、胰腺Multiple Tissue Northern(MTNTM)Blot购白Clontech公司。将阳性克隆用HindIII切下的436个bp作为探针。探针标记使用Promega标记试剂盒，室温标记α-32P-dCTP1小时。杂交液采用Clontech公司的ExtressHybTMHybridization Solution。按照Clontech公司杂交使用手册杂交过夜。杂交后用2×SSC，1％SDS及0.1×SSC，0.5％SDS洗膜。用双面增感屏，-70℃曝光。
小鼠NECL2表达广泛。多组织Northern杂交显示小鼠NECL2在心、脑、肺、肝、骨骼肌与睾丸皆有表达，睾丸表达量较高，而脾与肾表达量低。除骨骼肌为3kb左右转录本外，在其余组织皆有1.8kb及4.5kb两个转录本，在脑中以4.5kb转录本为主，这与Hirokigomyo等对人NECL2的Northern杂交结果相符。
载有脑组织分区及其他非脑组织的RNA Master BlotTM购自Clontech公司。阳性克隆用NocI切下的近500bp作为杂交探针，用上述方法标记探针。杂交液采用Clontech公司的ExtressHybTM Hybridization Solution。65℃预杂交30min，后加入标记的变性探针及用于封闭的30ugC0t-1 DNA、150ug ssDNA及50ul 20×SSC，65℃杂交6小时。杂交后用2×SSC，1％SDS及0.1×SSC，0.5％SDS洗膜。用双面增感屏，-70℃曝光。3.人胶质瘤及正常白质切片原位杂交选用人NECL23’非编码区的片段作为探针区域，PCR扩增后连接到T-easy载体中，分别用Sal1/T7、Ncol/Sp6酶切，作为原位杂交正反义探针模板。使用Promega的DIG标记RNA探针试剂盒，作体外转录，并引入DIG-C，从而合成地高辛标记的RNA杂交探针。同时用多聚甲醛灌流固定小鼠，取人脑及脊髓组织进行切片，以制备好的正反义探针按照原位杂交手册行漂染杂交。4.利用融合黄色荧光蛋白进行细胞定位将此基因从核酸1-1335位(包括翻译起始位点及前面的Kozak序列)融合到黄色荧光蛋白的N端，转染BT325细胞，进行细胞定位。设计上下游引物并分别引入KpnI、XhoI的酶切位点，上游ccgctcgagaccatggcgagtgtagtg，下游ggtaccgtgatgaagtactctttctt，将PCR获得的片段连于pEYFP-Nl载体中，构建能够表达融合蛋白的重组质粒。利用脂质体将重组质粒转染BT325细胞，48小时后获得高效的瞬时表达。在荧光显微镜下观察定位结果。5.蛋白的原核表达、纯化及动物免疫与多克隆抗体的获得设计引物，上游gaagatctgggcgctattttgccagacat，下游cgcgtcgacagcaaatcccaagccttccc，以扩增NECL2蛋白C端。按正确读码框架插入pGEX-4T-1的原核表达载体中。将上述重组克隆转化感受态宿主细胞BL21，1mMIPTG诱导表达，SDS-PAGE检测目的蛋白。
大量表达的融合蛋白GST-NECL2用GST亲和系统初步纯化，得到纯化蛋白。以纯化后的目的蛋白免疫饲养的新西兰纯种大白兔(方法见分子克隆)。经过一次基础免疫和两次加强免疫后，每次免疫后一周收集的抗血清并经ELISA检测抗体滴度。待达到所要求滴度，则颈动脉放血，收集抗血清，分装-70℃保存。6.组织蛋白的提取与Western杂交按照分子克隆的方法提取小鼠不同组织的蛋白。将所提取的蛋白质定量后进行12％SDS-PAGE电泳。电泳完毕，以Bio-Rad公司的Mini-Cell电转系统在含2.9‰甘氨酸，5.8‰Tris，0.37‰SDS和20％甲醇的电转液中进行转膜。将电转后的硝酸纤维膜放入含5％脱脂奶粉，1％封闭用羊血清，0.1％Tween20的TBS封闭缓冲液中，室温缓慢振荡2hr以封闭非特异性结合位点。一抗以1∶8000稀释于封闭液中，4℃振荡孵育过夜。20ml TBS洗3次，每次10分钟；将膜置于封闭缓冲液中振荡30分钟。1∶1000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG室温振荡孵育2小时。TBS缓冲液洗3次，每次10分钟。置于染色缓冲液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl PH9.5)5分钟。将膜置于含BCIP/NBT的染色液中(同组织原位杂交)，于室温下轻轻摇晃，使蛋白条带逐渐显色。7.免疫组织化学取材后-20℃40-50um冰冻切片。在0.3％Triton-X-100的1×PBS中4℃预处理3-4天后，用封闭液(含1％BSA、1％羊血清、0.3％Triton-X-100的1×PBS)室温震荡封闭2小时。然后以适当比例的封闭液稀释一抗，4℃孵育过夜。用含有0.3％Triton-X-100的1×PBS漂洗3次后，1∶1000生物素标记的二抗在含1％BSA，1％羊血清，0.3％Triton-X-100的1×PBS中室温震荡2.5小时。再漂洗3次，然后1∶1000生物素-亲和素-辣根过氧化物酶(预先混合半小时)在含1％BSA，0.3％Triton-X-100的1×PBS中室温震荡2小时。漂洗后就可以利用辣根过氧化物酶的酶促反应DAB-镍显色(显色液配制46ml50mmol/L Tris-HCl，1ml 1％DAB，3ml 6.88％硫酸镍铵，7.5μl 30％H2O2)。8.利用IAsys技术检测与NECL2相互作用的分子IAsys分析系统利用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)现象，使用生物传感器实时监测生物大分子对传感片上固定配体的吸附。利用其灵敏度高、实时监测的特性，将纯化的NECL2融合蛋白包被在传感片上，分别检测4.1R、4.1N、4.1B、4.1G的30KDaDomainGST融合蛋白与其相互作用情况，并检测昆明小鼠和SD大鼠脑提取液中有无与其结合的蛋白分子及量的多少。9.NECL2全长cDNA和氨基酸序列1GAC ATG GCG AGT GTA GTG CTG CCG AGC GGA TCC CAG TGT GCG GCG GCA GCG GCG GCG GCG 601 M A S V V L P S G S Q C A A A A A A A 1961 GCG CCT CCC GGG CTC CGG CTC CGG CTT CTG CTG TTG CTC TTC TCC GCC GCG GCA CTG ATC 12020A P P G L R L R L L L L L F S A A A L I 39121 CCC ACA GGT GAT GGG CAG AAT CTG TTT ACG AAA GAC GTG ACA GTG ATC GAG GGA GAG GTT 18040P T G D G Q N L F T K D V T V I E G E V 59181 GCG ACC ATC AGT TGC CAA GTC AAT AAG AGT GAC GAC TCT GTG ATT CAG CTA CTG AAT CCC 24060A T I S C Q V N K S D D S V I Q L L N P 79241 AAC AGG CAG ACC ATT TAT TTC AGG GAC TTC AGG CCT TTG AAG GAC AGC AGG TTT CAG TTG 30080N R Q T I Y F R D F R P L K D S R F Q L 99301 CTG AAT TTT TCT AGC AGT GAA CTC AAA GTA TCA TTG ACA AAC GTC TCA ATT TCT GAT GAA 360100 L N 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1.本发明涉及一神经系统高度表达的基因NECL2，其特征在于互补脱氧核苷酸(cDNA)全长3512bp，含一个1326bp的完整开放阅读框，编码442个氨基酸，分子量为48.5kDa的蛋白质。
2.根据权利1要求所述之神经系统高度表达的基因NECL2，其特征在于在成人小脑、大脑皮层、丘脑、下丘脑、垂体、睾丸、甲状腺及胎盘高表达，在胎儿脑、肝脏与肺中表达较高。
3.根据权利1、2要求所述之神经系统高度表达的基因NECL2，具特征在于所编码蛋白1-44氨基酸为典型的信号肽，中部具有三个免疫球蛋白结构域(分别位于氨基酸残基57-147，159-222，260-315)，375-396氨基酸为穿膜区。
4.根据权利1、2、3所述之人神经系统高度表达基因NECL2，其特征在于该基因及其所编码的蛋白在神经胶质细胞瘤与正常神经胶质细胞中的表达具有明显差异。
全文摘要
本发明涉及一个在人神经系统中高度表达的基因(NECL2)，包括互补脱氧核苷酸(cDNA)序列和编码蛋白质的氨基酸序列。该基因编码的蛋白质定位于细胞的细胞质膜上，在正常神经细胞元中高度表达，在正常神经胶质细胞与神经胶质细胞瘤中的表达具有明显差异。在维持神经系统的生理功能及某些神经系统疾病的发生过程中可能具有重要的作用。
文档编号C07K14/435GK1408867SQ0114144
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月25日 优先权日2001年9月25日
发明者袁建刚, 强伯勤, 彭小忠, 胡晓燕 申请人:中国医学科学院基础医学研究所