猪生殖和呼吸综合症病毒(prrsv)重组禽痘病毒疫苗的制作方法

专利名称：猪生殖和呼吸综合症病毒(prrsv)重组禽痘病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组载体，例如病毒，痘病毒，以及制造和使用该载体的方法。发明进一步涉及重组禽痘病毒例如ALVAC，该病毒表达猪的生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)的基因产物；例如，重组载体例如病毒，如ALVAC重组体，含有并表达PRRSV开放阅读框3和5，或5和6，或4和5，或者它们的组合体，尤其是3和5和6，或者4和5和6。本发明也涉及免疫组合物或者疫苗，这些组合物或者疫苗诱导针对PRRSV基因产物的免疫反应。发明也进一步涉及这些组合物或者疫苗，这些组合物和疫苗提供抗PRRSV感染的保护性免疫。而且，本发明涉及制造及使用这些重组载体和组合物的方法。
本申请中参考了几篇出版刊物。这些文献的完全引用见说明书末尾权利要求书之前部分，和/或文献引用处。这些文献和本发明领域相关；而且，此次申请中引用或者参考的每篇文献(“此处引用文献”)此处引用文献所参考和引用的每篇文献在此引用作为参考。
背景技术：
猪的生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)属于称为动脉病毒(arteriviruses)的包膜的正链RNA病毒家族。该家族中的其它病毒为原型病毒，马动脉炎病毒(EAV)，乳酸脱氢酶病毒(LDV)和猿出血热病毒(SHFV)(deVries等人，1997综述)。同冠形病毒和动脉病毒显著的共有特征近来导致它们在新产生的序列中的定位，巢病毒(Nidoviales)(Pringle，1996；Cavanagh，1997；de Vries等人，1997)。动脉病毒组的四个成员，基因组结构，复制策略和蛋白的氨基酸序列类似，它们在体内和体外感染巨噬细胞的优先选择也相似(Conzelmann等人1993；Meulenberg等人，1993a)。
1987年在北美发现一种猪的新型病毒疾病(Hill，1990)而1990年在欧洲(Paton等人，1991)也发现了这种疾病。这种疾病，被不同地认为是猪的生殖和呼吸综合症(PRRS)，猪不育和呼吸综合症(SIRS)，猪的流行性流产和呼吸综合症(PEARS)和神秘猪疾病(mystery swine disease)，其主要特点在于母猪的生育失败及所有不同年龄的猪呼吸问题。病原体，目前认为是PRRS病毒，最初在荷兰分离得到，作为Lelystad病毒(Wensvoort等人，1991)。随后，在北美Benfield等人(1992)和Collins等人(1992)分离到一种相关的病毒(原型病毒株ATCC VR2332)。在感染的巨噬细胞中进行免疫过氧化物酶检验中，PRRSV欧洲分离物的特异性多价抗血清和北美分离物交叉反应，反之亦然(Wensvoort等人，1992)；然而，进一步的试验表明欧洲和北美分离物代表两种截然不同的基因型，这两个基因型独立进化于分离的大陆(Mardassi等人，1995；Meng等人，1995a和b；Murtaugh等人，1995；Nelsen等人，1999)。近乎同时在全球范围出现的由分别进化的病毒引起的猪疾病表明猪的饲养和管理的改变可能导致PRRS的出现(Nelsen等人，1999)。
在美国，目前估计40％到60％的畜群受到感染(Bautista等人，1993；Cho等人1993)，而在欧洲，认为在某些地区超过50％的畜群受到PRRSV感染(Albina，1997)。很难衡量该疾病造成的经济效应，该效应在不同的国家不同。在美国，已经记录每年每只猪的损失为500$(Done和Paton，1995)。尽管已经意识到不同的感染畜群不同病例临床效果变化很大而且感染临床症状不明显，生产率在可接受的参数内，但是主要的两组临床征象(Sign)和PRRS的发生相关。这两组为(1)生殖征象包括早产，晚期流产，小猪出生虚弱，死产数和干尸化数目增加(Done和Paton，1995)。(2)呼吸疾病征象在新生猪中也非常重要，主要特征为呼吸困难及咳嗽。尽管所有年龄的猪都有易感性，但是通常这些症状出现在3周龄的猪中。和生殖障碍相比，临床上明显的呼吸器官疾病在实验上很难重复(Zimmermann等人，1997)。
这些临床征象改变显著并受到以下因素的影响病毒株(Halbur等人，1995)，感染年龄和遗传易感性差异(Halbur等人，1992)，并发感染(Galina等人，1994)，猪的密度，猪的运动及其居住系统(Done等人，1996)和免疫状态包括可能正在增强的PRRS病毒特异性抗体(Yoon等人，1994)的低水平出现。
按照发病机制，由PRRSV诱导的最显著的改变为严重损坏肺泡巨噬细胞，该细胞大量受到损坏(Done和Paton综述，1995；Rossow，1998)。在肺和淋巴节大量单核细胞的凋亡诱导可以来解释PRRSV感染的猪的肺泡巨噬细胞，循环淋巴细胞和单核细胞数量惊人减少的原因(Sirinarumitr等人，1998；Sur等人1998)。结合循环淋巴细胞损坏和粘膜纤毛清除体系的损坏，这可能抑制免疫力并造成猪更易受到二次感染。PRRSV感染后细菌二次感染比率增加已被证实(Galina等人，1994；Done和Paton，1995；Nakamine等人，1998)。PRRSV感染的严重性可能由细菌或者支原体感染而加重(Thacker等人，1999)。此外人们已经发现大量的病毒感染是和PRRS相关的(Carlson，1992；Brun等人，1992；Halbur等人，1993；Done等人1996；Heinen等人，1998)。
有3种传播途径(1)鼻对鼻或者亲密接触(Done等人，1996)，(2)浮质(Le Potier等人，1995)，以及(3)通过尿液，粪便，精液传播。通过污染的精液受精途径传播方式已经得到很好的证明(Yeager等人，1993；Albina，1997)。de Vries等人(1997)对动脉病毒的基因组结构做过综述。基因组RNA为单链，有传染性，多聚腺苷酸化并且5′端带帽。PRRSB基因组很小，为15,088个碱基。EAV和LDV基因组稍小分别为12,700个碱基和14,200个碱基。可以得到EAV，LDV和PRRSV基因组完整的序列(Den Boon等人，1991；Godeny等人，1993；Meulenberg等人，1993a)。
基因组含有8个开放阅读框(ORF)按照以下顺序编码复制酶基因(ORF 1a和1b)，包膜蛋白(ORF 2和6)和核壳体蛋白(ORF7)(Meulenberg等1993a)。从6个亚基因组RNAs表达ORF2到7，前者在复制过程中合成(Meng等人，1994，1996)。这些亚基因组RNA形成一个3′共末端嵌套，由相同的引导区组成，来自病毒基因组5′末端(Meulenberg等人，1993b)。尽管RNAs结构上为多顺反子，但是翻译限制于唯一的5′端序列，在套组中下级更小的RNA中不存在该5′端序列。2个大重叠开放阅读框(ORF)，命名为ORF1a和ORF1b，占据了基因组的三分之二。第二个ORF，ORF1b仅仅在翻译阅读之后表达，翻译阅读通过假节结构介导的a-1移码(Brierley1995)。由这些ORF编码的多肽被病毒编码的蛋白酶蛋白水解切割产生参与RNA合成的蛋白。现有关于每个ORF编码的蛋白的特征的认识概要如下。美洲PRRSV分离物VR-2332和Lelystad病毒，LDV和EAV比较的ORF2到7的氨基酸同源性已经做过描述(Murtaugh，1995)。ORF2编码29-30kDa N-糖基化的结构蛋白(GP2或者GS)，显示1型膜内糖蛋白的特征(Meulenberg和Petersen-den Besten，1996使用Lelystad病毒的Ter Huurne病毒株)。将美洲VR-2332分离物和Lelystad病毒比较时，ORF2蛋白显示出63％的氨基酸同源性(Murtaugh等人，1995)。ORF3编码45-50kDa N-糖基化的小结构蛋白，命名为GP3(vanNieuwstadt等人1996)。这是最不保守的ORF，当比较VR-2332和Lelystad病毒时这两种病毒之间仅仅存在58％的氨基酸同一性(Murtaugh等人，1995)。近期数据表明GP3为非结构糖蛋白，是从感染细胞中以可溶形式释放的(Gonin等人，1998)。ORF4编码31-35kDa小的N-糖基化的膜蛋白，命名为GP4(van Nieuwstadt等人1996)。抗GP4单克隆抗体中和反应显示至少部分该蛋白应该位于病毒表面-单克隆抗体至少部分和欧洲分离物发生交叉反应(van Nieuwstadt等人，1996)。当VR-2332 ORF4蛋白和Lelystad病毒比较时显示68％氨基酸同一，并含有5个推定的跨膜结构域(Murtaugh等人，1995)。ORF5编码GP5或者GL，这是25kDA主要包膜糖蛋白(Meulenberg等人，1995)。尽管机制尚未确定，但是已经证明PRRS GP5蛋白为有效的凋亡诱导物(Suarez等人，1996)。当比较PRRS Lelystad病毒白和美国VR-2332分离物的ORF5蛋时，发现59％氨基酸具有同源性(Murtaugh等人，1995)。有人发现残基26和39之间的一个区域对应于高变区，该高变区涉及0-3个潜在的N-糖基化作用位点(Pirzadeh等人，1998b)。由于很难通过标准方法提高蛋白单克隆抗体抗性，该蛋白显示很弱的免疫原性(Pirzadeh和Dea，1997；Drew等人，1995)。然而，康复期的猪血清识别该蛋白(Nelson等人，1993；Meulenberg等人，1995)。PRRSV血清中和作用和对GP5主要包膜糖蛋白的抗体反应相关(Gonin等人，1999)。抗GP5的单克隆抗体具有中和活性，这通常仅仅对于亲代病毒(parent virus)具有特异性(Pirzadeh和Dea，1997；Weiland等人，1999)。ORF6编码18kDA III类非糖基化膜内在(M)蛋白(Meulenberg等人，1995)。PRRSV，LDV和EAV拓扑学研究显示在病毒中存在的ORF5(GL)蛋白和ORF6M蛋白通过二硫键共价连接为异二聚体(Mardassi等人，1996；de Vries等人，1995b；Faaberg等人，1995)。该二硫键可能存在于在PRRSV和EAV等效蛋白高度保守的两种蛋白的外部结构域中的半胱氨酸残基之间(Plagemann，1996，Meulenberg等人，1993a)。在LDV中已经证明，病毒中二硫键断裂导致病毒感染性丧失，可能表明了这两种蛋白的连接可以稳定病毒和宿主细胞受体相互作用的附着位点(Faaberg和Plagemann，1995)。比较Lelystad病毒和分离的VR-2332之间氨基酸同源性时ORF6蛋白为最保守蛋白，有78％同源(Mutaugh等人，1995)。近来的材料显示ORF6产物在细胞免疫中起很重要的作用(Bautista等人，1999)。
ORF7编码15kDa非糖基化碱性蛋白-在同其它核壳体蛋白序列相似性基础上认为它是核壳体蛋白(N)。Lelystad病毒的ORF7蛋白在Lelystad病毒和美洲分离物VR-2332之间具有65％的氨基酸同一性(Murtaugh等人，1995)。由于Western杂交检测时最先出现N蛋白抗体且最持久，所以N蛋白显示为最具免疫原性的PRRSV蛋白(Nelson等人，1994，Yoon等人，1995)。
近来在马动脉病毒(EAV)基因组中发现动脉病毒中保守的新的开放阅读框架(Snijder等人，1999)。该EAV ORF命名为2a，并编码称为“E”的8kDa的基本结构蛋白。在PRRSV中，已经命名同源ORF为2b，ORF2编码GP2(见上)被重新命名为ORF2a(Snijder等人，1999)。
尚未清楚针对PRRSV的保护性免疫反应由什么组成。在感染的猪中，面对循环抗体病毒血症能够持续多周，而免疫发展的机制已知甚微。然而，在PRRSV持续存在的畜群中，母猪不会遭受再次的生殖丧失，表明的确有某种保护性免疫已形成(Done等人，1996；Rossow等人，1998)。中和抗体会迅速减少，快到最初感染后6个月(Ohlinger等人，1992)这就可能显示活性免疫性的短期持续。PRRSV能够在带有中和抗体的猪中复制并传播，表明血清中和抗体并非免疫反应所必需的基本部分(Ohlinger 1995)。将猪暴露于地方性动物病的PRRSV中可以提供对同源PRRSV诱导的生殖丧失的保护，但是对异源PRRSV的保护程度和持续时间是不同的并依赖于接种和攻击暴露(challenge-exposure)所有病毒株的抗原相关性(Lager等人，1999)。在感染的猪中发现抗PRRSV细胞免疫性(Rossow，1998)。近来通过免疫重组病毒表达结构多肽(ORFs2-7；见下)来分析T细胞对PRRSV结构多肽的增殖反应。对ORF6产物观察到更强烈的反应(Bautista等人，1999)。
灭活的及活性减毒的病毒疫苗都是可用的。Plana Duran(1997)描述过灭活的油为佐剂的疫苗诱导70％的保护性。在美国，Gorcyca等人(1995)描述过活性减毒疫苗，该种病疫苗以单一肌内注射用药。尽管该疫苗产生可察觉的病毒血症，但是在怀孕晚期的母猪中是安全的，并不会传播给易感性的接触的猪。现场试验显示在感染地方性PRRSV的幼猪中使用疫苗具有显著的疗效(Done等人，1996)。然而，其它研究表明活性减毒的疫苗在孕期用药猪缺乏安全性或有效性(Dewey等人，1999a；Mengeling等人，1999b)。而且，在一些猪群中，疫苗株可能持续并变异到不太减毒的形式(Mengeling等人，1999a)。近来的研究显示，目前在美国猪群中循环的一些PRRSV病毒株要比以往遇到的毒性更大。在免疫的畜群中的临床PRRS表现说明需要产生新的疫苗(Mengenling等人，1998)。另外一项最新的研究表明欧洲血清型PRRSV疫苗保护免受欧洲血清型进攻，然而美国血清型疫苗则不能(van Woensel等人1998a和b)。总之，需要无论从安全性还是有效性水平都需要新的改善的疫苗。
Wensvoort，美国专利号5,620,691或WO92/21375涉及“Leylatad试剂”作为“神秘猪疾病”引发剂；并提供该药剂的保藏(I-1102，保藏日1991年，6月5日，地点Pasteur研究所，法国巴黎)，以及确定它的开放阅读框架。尽管Wensvoort提及该药剂或其部分可以包含于载体系统例如痘苗病毒，疱疹病毒，假狂犬病毒，或者腺病毒，然而，Wensvoort没有如本发明指导或者建议如何构建含有并表达PRRSV免疫原或者目的表位的重组载体系统，而且对于含有并表达PRRSV ORF或者特定的ORF组合和/或本发明重组体的重组禽痘病毒没有特别的指导或者建议。
Plana Duran等人(1997)涉及杆状病毒表达系统中西班牙PRRSV分离物ORF2至7的表达。ORF3至7在怀孕的猪中测试了免疫原性。仅用表达N蛋白的ORF7进行免疫接种得到了显著的抗体反应(免疫过氧化物酶单层分析)。用ORF7免疫无法对攻击提供保护，然而ORF3和5，单独或者结合使用能够达到50-70％免受生殖丧失保护(PlanaDuran等人1997)。来自用ORFs3和5免疫的母猪的断奶小猪也证明攻击后没有抗PRRSV抗体，表明病毒没有复制。
Pirzadeh和Dea(1998)用表达ORF5的质粒DNA免疫猪，观察到中和抗体的诱导，淋巴细胞增殖和对PRRSV攻击的保护。类似的，Kwang等人(1999)评估编码ORF4-7的质粒DNA在猪中的免疫原性。抗PRRS病毒的DNA免疫分别在71％和86％的免疫的猪中导致体液和细胞介导的免疫反应。结果显示PRRS病毒的中和表位存在于由ORF4和ORF5编码的病毒包膜糖蛋白中。
Cochran，美国专利号6,033,904或WO96/22363涉及重组猪痘病毒并提及PRRSV ORF7；但是，Cohcran无法如本发明中指导并建议含有并表达PRRSV免疫原或者目的表位的重组载体体系，并对于含有并表达PRRSV ORF或特定的ORF组合和/或本发明重组体的重组禽痘病毒没有特别的指导或者建议。
Cochran，WO00/03030涉及重组浣熊痘病毒并提及PRRSV，但是，Cohcran无法如本发明中指导并建议含有并表达PRRSV免疫原或者目的表位的重组载体，并对于含有并表达PRRSV ORF或特定的ORF组合和/或本发明重组体的重组禽痘病毒没有特别的指导或者建议。
人们已经成功地使用牛痘病毒来免疫天花，在1980年世界范围内根除天花达到高潮。天花铲除后，痘病毒渐显新的重要性，即作为表达外源基因的遗传工程载体(Panicali和Paoletti，1982；Paoletti等人1984)。编码异源免疫原的基因已经在牛痘中表达，通常导致抗相应的病原体攻击的保护性免疫(综述Tartaglia等人，1990)。高度减毒的免疫毒株，命名为MVA，也用来作为基于痘病毒的疫苗载体。MVA的使用在美国专利5,185,146中作过描述。
两种另外的疫苗载体系统涉及天然的受宿主限制的痘病毒，禽痘病毒的使用。鸡痘病毒(FPV；Taylor等人，1988a，b)和金丝雀痘病毒(CPV；Taylor等人，1991和1992)已经改造用来表达外源基因产品。鸡痘病毒(FPV)为痘病毒科禽痘病毒属原型病毒。该病毒导致经济上重要的家禽疾病，该病自20世纪20年代使用活性减毒疫苗以来受到很好的控制。禽痘病毒的复制限制于禽类(Matthews，1982)而且在任何非禽类包括人类中都没有禽痘病毒导致生产感染的文献报道。这种宿主限制提供了防止病毒传送到其它物种的安全障碍，因此禽痘病毒基础的疫苗载体在兽医和人类中的应用是具有吸引力的提议。
FPV已经有利地用来作为载体表达来自家禽病原体的免疫原。恶性禽流感病毒的红血球凝聚素蛋白在FPV重组体中表达(Taylor等人，1988c)。重组体接种鸡和火鸡之后，诱导免疫反应，保护防止同源或者异源恶性流感病毒的攻击(Taylor等人，1988c)。人们也已经研制了表达Newcastle疾病病毒表面糖蛋白的FPV重组体(Taylor等人，1990；Edbauer等人，1990)。
通过遗传修饰野生型病毒株制备其它减毒痘病毒载体。通过删除牛痘Copenhagen病毒株的特异的毒性基因和宿主范围基因得到(Tartaglia等人，1992)NYVAC载体，已经证明该载体作可用重组载体在引起针对所表达的外源免疫原的保护性免疫反应。
另外一种改造的痘病毒载体为ALVAC，来自金丝雀痘病毒。ALVAC不能在非禽宿主中生产性复制，认为这种特性改善它的分布安全性(Taylor等人，1991和1992)。ALVAC和NYVAC都是BSL-1载体。
发展亚单元PRRSV疫苗的一种途径为使用活病毒载体表达相关的PRRSV ORF。重组痘病毒能够通过在本领域中已知的两步构建，类似于构建人工痘病毒重组体的方法，例如美国专利号4,769,330；4,722,848；4,603,112；5,110,587；5,174,993；5,494,807；5,942,235，和5,505,941中描述的牛痘病毒和禽痘病毒重组体，这些公开内容在此处引用作为参考。应当理解以下，PRRSV重组痘病毒，和由此得到的组合物和产品，特别是ALCAC基础上的PRRSV重组体和由之所得的组合物及产品，尤其是表达ORF2，3，4，5，6，或者7或者PRRSV的ORF的任意组合的重组体，以及由此得到的组合物和产品将对该技术当前状态是非常合乎需要的改进。
发明目的和概述本发明的目的为以下任意一种或者全部为治疗和预防由PRRSV引起的感染提供重组病毒，组合物和治疗方法以及制造这些病毒的方法。
本发明提供重组载体，例如重组病毒，如重组痘病毒，含有并表达至少一种外源核酸分子；而且，该至少一种的外源核酸分子包括编码来自PRRSV的目的免疫原或抗原表位的核酸分子或者可以是PRRSV的ORF或其部分。本发明进一步提供免疫学的(或者免疫原性的)，或者疫苗组合物，其包含病毒或该病毒的表达产物。本发明进一步提供诱导抗PRRSV免疫学的(或者免疫原性的)或者保护性反应的方法，以及预防或治疗PRRSV或其导致的疾病状态的方法，包括施用病毒或者病毒表达产物，或者含病毒的组合物，或者含该病毒表达产物的组合物。本发明包括病毒表达产物以及由表达产物或者体内表达产生的抗体和该产品和抗体的用途，例如在诊断应用中的用途。在此处公开内容中的术语“包含”意为“包括”或者意为美国专利法律中通常给出的术语“包含”。
通过以下详述公开并包括这些及其它实施方案或者使其显而易见。
附图的简述通过参考附图更好的了解可以本发明，这些附图此处引用作为参考

图1(SEQ ID NO1)显示ALVAC DNA的3.7千碱基对的片段的核苷酸序列，含有C6开放阅读框。
图2显示pJP115供体质粒的图谱。
图3(SEQ ID NO10)显示来自pJP115供体质粒从限制性位点KpnI(位点653)到SacI(位点3214)的2.6千碱基对的片段的核苷酸序列。
图4显示pJP119供体质粒图谱。
图5(SEQ ID NO14)显示来自pJP119供体质粒从限制性位点KpnI(位点653)到SacI(位点3262)的2.6千碱基对片段的核苷酸序列。
图6显示pJP103供体质粒图谱。
图7(SEQ ID NO19)显示来自pJP103供体质粒从限制性位点KpnI(位点653)到SacI(位点3016)的2.4千碱基对片段的核苷酸序列。
图8显示pJP110供体质粒图谱。
图9(SEQ ID NO26)显示来自pJP110供体质粒从限制性位点KpnI(位点653)到SacI(位点3064)的2.4千碱基对片段的核苷酸序列。
图10显示pJP100供体质粒图谱。
图11(SEQ ID NO31)显示来自pJP100供体质粒从限制性位点KpnI(位点653)到SacI(位点2986)的2.3千碱基对片段的核苷酸序列。
图12显示pJP113供体质粒图谱。
图13(SEQ ID NO32)显示来自pJP113供体质粒从限制性位点KpnI(位点653)到SacI(位点3732)的3.1千碱基对片段的核苷酸序列。
图14显示pJP101供体质粒图谱。
图15(SEQ ID NO37)显示来自pJP101供体质粒从限制性位点KpnI(位点653)到SacI(位点2851)的2.2千碱基对片段的核苷酸序列。
发明详述在一方面，本发明提供免疫或者疫苗组合物或者治疗组合物用来在用该组合物接种的宿主动物内诱导免疫学或保护性反应。组合物包括载体或者稀释剂或者赋形剂和/或佐剂，和重组载体，例如重组病毒。该重组病毒可以是改进的重组病毒；例如，重组病毒在此已经灭活(例如破坏或者删除)编码病毒的遗传功能。改进的重组病毒可以已经灭活其中病毒编码病毒的非基本的遗传功能；例如这样，重组病毒毒性减弱而安全性增加。在根据本发明的组合物中使用的病毒以痘病毒为有利，例如牛痘病毒或者优选禽痘病毒，例如鸡痘病毒或者更加优选金丝雀痘病毒；更加有利的为ALVAC病毒。有利之处在于重组载体或者重组病毒在哺乳动物中表达而不复制。重组载体或者改进的重组病毒可包括，例如，在病毒基因组内部，例如在病毒基因组的非必需部位，编码免疫原的蛋白的异种DNA序列，例如，来自PRRSV ORF，如，PRRSV ORF2，3，4，5，6，或7或者它们的任意组合，优选PRRSV ORF3和5，或者5和6，或者4和5，或者它们的组合，特别是3和5和6，或者4和5和6(其中免疫原的蛋白可为目的抗原表位，例如来自由PRRSV ORF2，3，4，5，6或者7中任何一种或者几种表达的蛋白的目的表位，例如来自PRRSV ORF3和5，或者5和6，或者4和5，或者它们的组合，特别是3和5和6，或者4和5和6的目的表位)。
重组载体或者重组病毒含有并表达PRRSV ORF3和5，或者5和6，或者4和5，或者它们的组合，特别是3和5和6，或者4和5和6是有利的。在另一方面，本发明提供由重组载体或者重组病毒体外表达这些ORF。表达产物能够被分离并应用于诊断或者治疗或者免疫学或者免疫原性或者疫苗组合物，例如，和合适的载体，赋形剂，稀释剂和/或佐剂混合。在另外一方面，本发明有利地提供ORF的体内表达和组合物，后者包含含有并表达这些ORF的重组载体或者重组病毒。这些组合物含有重组载体或者重组病毒以及合适的载体，赋形剂，稀释剂和/或佐剂。本发明进一步提供获得治疗，免疫原性，免疫学和/或保护性反应的方法，包括施用这样含有并表达这些ORF的重组载体或者重组病毒和/或含有这样的重组载体或重组病毒的组合物和/或这些ORF体外表达产物和/或含有这些表达产物的组合物。
然而在另一方面，本发明提供免疫原性组合物，该组合物含有重组载体如重组病毒，例如，改进的重组病毒重组病毒失活(例如破坏或者删除)病毒编码的遗传功能，例如非基本的病毒编码的遗传功能失活，这样重组病毒毒性减弱而安全性增加。改进的重组病毒包括，在病毒基因组内，例如在病毒基因组的非必需部位，编码免疫原性的蛋白的异种DNA序列(例如来自PRRSV ORF，例如，PRRSV ORF2，3，4，5，6或者7，优选，PRRSV ORF3和5，或者5和6，或者4和5，或者它们的组合，特别是3和5和6，或者4和5和6。)当给宿主用药时，其中组合物能够诱导特异针对免疫原性蛋白的免疫反应(例如，此处免疫原蛋白可以是目的表位，例如PRRSV ORF2，3，4，5，6或者7，优选PRRSV ORFs3和5，或者5和6，或者4和5，或者它们的组合，特别是3和5和6，或者4和5和6中一种或多种表达的蛋白的目的表位)。
更进一方面，本发明提供重组载体例如重组病毒。举例来说，本发明提供改进的重组病毒；例如，通过失活(例如破坏或者删除)病毒编码的遗传功能改进重组体表达，例如改进的重组病毒使其中病毒编码的非基本的遗传功能失活，这样，重组病毒毒性减弱；而且，其中改进的重组病毒进一步在病毒基因组中，例如病毒基因组非必需区域含有来自异源的DNA。该DNA能够编码PRRSV目的表位或者PRRSV基因或其部分如PRRSV ORF2，ORF3，ORF4，ORF5，ORF6和ORF7的任一或全部，例如，PRRSV ORF2和3，或3和4，或3和5或3和5和6，或4和5和6，或3和4和5和6和/或这些ORF中一个或者几个或ORF的组合所表达的目的表位。尤其是，遗传功能的失活可以通过删除编码毒性因子的开放阅读框或者使用天然宿主限制病毒和/或使用减弱的及天然宿主限制的病毒。根据本发明使用的病毒有利为痘病毒，例如牛痘病毒或者优选禽痘病毒，如鸡痘病毒或者更优选的金丝雀痘病毒。有利地，对于牛痘，开放阅读框选自J2R，B13R+B14R，A26L，A56R，C7L-K1L，14L，或者它们的组合(Goebel等人报道的术语，1990)；有利地，它们的组合包括J2R，B13R+B14R，A26L，A56R，C7L-K1L和14L。在该方面，开放阅读框包括胸腺嘧啶激酶基因，出血性区域(hemorrhagic region)，A型包含体区域(A type inclusion body region)，红血球凝聚素基因，宿主范围基因区域或者大亚基，核糖核苷酸还原酶；或者它们的组合。合适的改进的牛痘病毒Copenhagen毒株确定为NYVAC(Tartaglia等人，1992)，或者从中已经删除了J2R，B13R+B14R，A26L，A56R，C7L-K1L和14L或者胸腺嘧啶激酶基因，出血性区域，和大亚基，核糖核苷酸还原酶的牛痘病毒(对于NYVAC相关见美国专利号5,364,773，5,494,807和5,762,938和NYVAC相关，而且在本发明实施中应用的载体具有NYVAC的那些以外的另外的删除或者灭活)。
优选，痘病毒载体为ALVAC或者，减毒的金丝雀病毒，例如，通过鸡胚成纤维细胞连续传200代(Rentschler疫苗株)，主病毒种从此经过在琼脂中4次连续的噬斑纯化，由此单噬斑经过5次附加的传代扩增(对于ALVAC和TROVAC见美国专利号5,756,103和5,766,599(减毒的禽痘病毒在用于发明的实践)；对于载体，例如增加表达的载体和/或用于猪宿主的载体(例如，用于猪宿主的载体包括猪疱疹病毒，包括Aujeszky′s疾病病毒，腺病毒包括猪腺病毒，痘病毒包括牛痘病毒，禽痘病毒，金丝雀痘病毒，浣熊痘病毒和猪痘病毒；对于猪痘病毒见美国专利号6,033,904，5,869,312和5,382,425)，也能在本发明实施中使用，以及关于所用的术语和教导此处例如重组病毒和表达产物的“免疫原性组合物”，“免疫学组合物”，“疫苗”和“目的表位”，给药的剂量和路径，制剂，佐剂，以及用途见美国专利号6,004,777和5,999,091和美国申请系列号60/151,564，60/138,352和60/138,478，分别提出于，1999年8月31日，6月10日和6月10日(附有每份申请))重组载体或者重组病毒在宿主中表达而不复制是合乎需要的。
至于目的表位，参考Kendrew的分子生物学百科全书(THEENCYCLOPEDIA OF MOLECULAR BIOLOGY)(Blackwell科学有限公司，1995)和Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆，实验室手册，第二版本，冷泉港实验室印刷，1982。目的表位为免疫原或其免疫学的活性片段的免疫学相关区域，例如，来自病原体或者兽医或者人类目的的毒素，例如PRRSV。本领域的技术人员能够确定表位或者肽或多肽的免疫决定区域以及由此从有关氨基酸和肽或者多肽对应的DNA序列的知识，以及从特殊氨基酸的性质(例如尺寸，电荷等等)密码子字典，不须经过不必要的实验而得到的编码DNA。DNA序列优选编码产生抗体反应或者T细胞反应最低限度的肽区域。确定T和B细胞表位的一个方法涉及表位作图。目的蛋白以短重叠肽合成(PEPSCAN)。然后测试单个肽结合由天然蛋白诱导的抗体的能力或者诱导T细胞或者B细胞活化的能力。Janis Kuby，免疫学Immunology，(1992)第79-80页。
用于确定目的表位的另外一种方法为选择蛋白的亲水区域。亲水残基通常在蛋白的表面，因此通常蛋白的这些区域可接近抗体。JanisKuby，免疫学Immunology，(1992)第81页。仍有另外一种的用来选择能够产生T细胞反应的目的表位方法为从蛋白序列确定潜在的HLA锚定结合基元，该基元为已知容易结合MHC分子的肽序列。
推定为目的表位的肽，要产生T细胞反应，应该出现在MHC复合体中。该肽的优选含有适当的锚定基元用来结合MHC分子，而且应以足够高度的亲和性结合来产生免疫反应。确定蛋白是否为可以刺激T细胞反应的目的表位的指导包括肽长度-肽应该至少8或者9个氨基酸长以适合MHC I类复合体，且至少13-25个氨基酸长以适合II类MHC复合体。这是肽结合到MHC复合体的最小的长度。由于细胞可能剪切表达的肽，优选的肽应该长于这个长度。该肽应该含有确切的锚定基元，可以使之以足够高的专一性结合不同I类或者II类分子来产生免疫反应(见Bocchia，M等人，白血球癌基因融合蛋白肽专一结合HLAI类分子，Blood852680-2684；Englehard，VH，I型和II型MHC分子相关的肽结构。Ann.Rev.Immunol.12181(1994))。通过目的蛋白序列和公开的MHC分子相关的肽结构比较而不需要不适当的实验就可以完成。进一步，技术人员能够通过将该蛋白序列与蛋白数据库里列出的蛋白序比较来列确定目的表位。更进一步，另外一种方法是简单的产生或者表达目的蛋白的部分，产生目的蛋白那些部分的单克隆抗体，然后确定这些抗体是否体外抑制病原体生长。技术人员能够使用本公开内容和本领域中的其它指导来产生并表达目的蛋白的部分来分析抗体是否体外抗体抑制其生长。
关于“免疫原性组合物”，“免疫组合物”和“疫苗”，含有载体(或者其表达产物)的免疫组合物引起局部或者系统的免疫反应。该反应可能但不必定为保护性的。含有本发明重组体或者载体(或者其表达产物)等的免疫原性组合物同样引起局部或者系统的免疫反应，该反应可能但不必定为保护性的。疫苗组合物引起局部或者系统保护反应。因此，术语“免疫组合物”和“免疫原性组合物”包括“疫苗组合物”(前两者术语可能为保护性组合物)。本发明包含免疫，免疫原性或者疫苗组合物。
关于剂量，用药路径，制剂，佐剂，重组病毒和其表达产物的用途，本发明组合物可以用于肠胃外或者粘膜给药，优选真皮内，皮下，或者肌内途径。在使用粘膜给药时，可能使用口，眼或者鼻途径。本发明另外一方面涉及本发明重组体或者载体的表达产物，例如病毒，例如，重组痘病毒，及其用途，例如形成用于治疗，预防，诊断或者测试的免疫或者疫苗组合物；以及，涉及来自重组体或者发明的病毒例如痘病毒的DNA，用于构建DNA探针和PCR引物。
在一个方面，本发明提供重组载体，例如病毒，如其中含有来自PRRSV的DNA序列的重组痘病毒，例如，在病毒(如痘病毒)基因组中，有利的非必需区域中，例如痘病毒基因组。痘病毒可能是例如以NYVAC或者NYVAC为基础的牛痘病毒；而且，痘病毒有利地为禽痘病毒，例如鸡痘病毒，特别是减毒的鸡痘病毒，例如，TROVAC，或者金丝雀痘病毒，优选减毒的金丝雀痘病毒，例如ALVACA。
根据本发明，重组载体，例如病毒如痘病毒，表达外源的PRRSV基因或者核酸分子的基因产物。PRRSV的特异ORF(s)或者编码来自特异的PRRSV ORF(s)表位的特异的核酸分子被插入到重组载体例如病毒，如痘病毒载体，得到的载体，例如重组的病毒，如痘病毒，用来感染动物或者体外表达产物用于对动物给药。动物中PRRSV基因产物表达导致动物对PRRSV的免疫反应。这样，重组载体，例如病毒，如本发明的重组痘病毒可用于免疫学组合物或者疫苗来提供诱导免疫反应的方法。
重组载体例如重组病毒如重组痘病毒-PRRSV或其表达产物的给药步骤，以及本发明的组合物如免疫或者疫苗组合物或者治疗组合物(例如含有重组载体或者重组病毒例如痘病毒或其表达产物的组合物)的给药步骤，可以由经胃肠外途径(真皮内，肌肉内或者皮下)。该给药启动系统免疫反应，或者体液或者细胞介导的反应。
载体或者PRRSV重组病毒，例如PRRSV痘病毒，或其表达产物，或者含有表达产物和/或载体或者病毒的组合物，能够对任何年龄和性别的猪给药；例如，引起抗PRRSV的免疫反应，例如因此预防PRRSV和/或其它和PRRSV相关的病理后遗症。有利地，载体或者重组PRRSV病毒，例如PRRSV痘病毒，或其表达产物，或者含有该表达产物和/或载体或病毒的组合物，对小猪或者幼猪给药，包括新生和/或者对怀孕的母猪给药来在孕期给予主动免疫和/或通过母体抗体给予新生猪被动免疫。在优选实施方案中，本发明给母猪(如大母猪，小母猪)，用包含PRRSV免疫原或者来自该免疫原的目的表位的组合物进行接种，免疫原例如来自PRRSV ORF2，ORF3，ORF4，ORF5，ORF6和/或ORF7，例如来自PRRSV ORF3和5，或者5和6，或者4和5，或者它们的组合，特别是3和5和6，或者4和5和6和/或由以上这些ORF或者ORF组合中的一种或者多种表达的目的表位，和/或用表达该免疫原或目的表位的载体进行接种，可以在饲养之前接种；和/或服饲之前接种；和/或怀孕期间、和/或围产期或产期之前接种；和/或一生中重复接种；有利地，在服饲之前要接至少一次种。此后在怀孕时再次接种也是很有利的，例如在怀孕中期(大约6-8周)和/或怀孕晚期(大约怀孕11-13周)时。这样，有利的治疗为在服饲之前接种而在怀孕期加强。其后，可以在每次服饲之前和/或者在怀孕中期(大约6-8周)和/或怀孕晚期(大约怀孕11-13周)再次接种。优选地，可以仅在怀孕期间再次接种。另外优选的实施方案中，小猪例如来自已经接种母猪(例如在此讨论地接种)的小猪，在出生后最初几周进行接种，例如，在出生后1和/或2和/或3和/或4和/或5周接种。更加优选，小猪在出生后第一周或者3周之内(例如在断奶时)进行首次接种。更加有利地，这些小猪在2-4周之后(初次接种后)加强免疫。这样，本发明的组合物可对后代，以及母猪(例如大母猪，小母猪)给药和/或它们可作为本发明方法的实施对象。可以按照此处描述的剂量进行接种。关于痘病毒或者病毒组合物的给药以及母体免疫，参考美国专利号5,338,683。
本发明重组载体或者PRRSV病毒(例如痘病毒-PRRSV重组体)的免疫或者疫苗组合物或者治疗组合物可以根据制药或兽医领域技术人员熟知的标准技术进行准备。这些组合物以一定剂量给药，使用的方法为兽医领域技术人员所熟知，并考虑到年龄，性别，体重，给药路径等为因素。这些组合物能够单独给药，或者同例如“其它”免疫学组合物，或者减毒，灭活的，重组疫苗或者治疗组合物共给药或者相继地给药，从而提供本发明组合物以及它们的应用方法多价或者“鸡尾酒”或者联合。组合物可以含有PRRSV成分(例如表达PRRSV免疫原或者目的表位和/或PRRSV免疫原或目的表位的重组载体例如质粒或者病毒或者的痘病毒)和一或者多种非相关的猪病原体疫苗(例如目的表位，免疫原和/或重组载体或者病毒例如重组病毒，例如表达该表位或者免疫原的重组痘病毒)的组合，后者例如一或者多种来自一或多种猪细菌和/或病毒病原体的免疫原或者目的表位，例如来自猪circovirus，猪细小病毒，猪流感病毒，假狂犬病毒，大肠杆菌(E.coli)，猪红斑丹毒丝病毒，猪肺炎支原体菌苗，多杀巴斯德菌，支气管败血性博代菌，放线杆菌肺炎，猪霍乱病毒等等。此外，给药的成分和方式(相继给药或者共给药)以及给药剂量的确定要考虑到这些因素如年龄，性别，重量，和给药途径。在这点上，参考美国专利号5,843,456，此处引用作为参考，并参考狂犬病组合物和组合物及其使用的联合；请参阅此处引用的其它文献和引用文献或者此处引用文献所参考的，文献包括美国专利申请编号60/151,564；以及US-A-6,217,883。
本发明组合物的实例包括用于粘膜给药的液体制剂，例如经口，鼻，眼等等，给药例如悬浮液和用于肠胃外，皮下，真皮内，肌肉内(如可注射给药)的制剂，例如无菌悬浮液或者乳液。该组合物中，重组痘病毒或者免疫原可以用合适的载体，稀释剂，或者赋形剂例如无菌水，生理盐水等混合。组合物可以冻干或者冷冻。组合物可以含有辅助物质如潮湿剂或者乳化剂，pH缓冲剂，佐剂，防腐剂等等，这依赖于所需的给药路径和制剂。组合物含有至少一种以下佐剂；丙烯酸或者甲基丙烯酸聚合体和马来酐酸与烯衍生物的共聚体。
优选的佐剂化合物为交联的丙烯酸或者甲基丙烯酸聚合体，特别是用糖或者多元醇的聚烯乙醚进行交联。这些化合物已知为术语卡波姆(Carbomer)(Phameuropa第8卷，2，1996年6月)。本领域技术人员也参考美国专利号2,909,462(此处引用作为参考)，其中描述了多羟基化合物交联的丙烯聚合物，该多羟基化合物含有至少3个羟基，优选不超过8个，至少3个羟基的氢原子被含有至少2个碳原子的不饱和脂肪基取代。优选的基团含2-4个碳原子，例如乙烯基，丙烯基，和其它烯键式不饱和基。这些不饱和的基团可以本身含有其它取代基，例如甲基。以Carbopol(BF Goodrich，俄亥俄，美国)名称出售的产品尤其适合。它们和丙烯基蔗糖或者丙烯基季戊四醇交联。它们之中可能提及Carbopol9740，934P和971P。马来酐和烯衍生物的共聚物中，马来酐和乙烯的共聚物EMA，线性或者交联的，如和二乙醚交联，都是优选的。参考J.Fields等人，自然(Nature)，186778-780，4，1960年6月，此处引用作为参考。从它们的结构看，丙烯酸或者甲基丙烯酸的聚合物以及EMA的共聚物优选以下通式为基本单元 其中-R1和R2，可以是相同的或者不同的，代表H或者CH3-x＝0或1，优选的x＝1-y＝1或2，x+y＝2对于共聚体EMA，x＝0且y＝2。对于卡波姆，x＝y＝1。
聚合物在水中的分解得到酸溶液，再中和优选到生理pH，来得到其中将含有疫苗的佐剂溶液。聚合物的羧基将部分处于COO-形式。优选的，根据本发明佐剂溶液，尤其是卡波姆溶液，在无菌水中，优选在氯化钠溶液中制备，获得酸性pH的溶液。储存液的稀释通过将储存液(或其相当部分)添加到指定量(用于获得要求的最终浓度)的NaCl溶液，优选的生理盐水(NaCl9g/l)，并都立即分部优选用NaoH同时或随后中和(pH7.3到7.4)。该生理pH的溶液将用于混合疫苗，后者可以特别冻干、液态或冷冻形式保存。
聚合物在最终的疫苗组合物中的浓度将为0.01％到2％w/v，更具体为0.06到1％w/v，优选0.1到0.6％w/v。
本发明的组合物也可配制成水包油或油包水的水乳浊液，如V.Ganne等人，Vaccine 1994，12，1190-1196。
标准文本，如“雷明顿制药科学，Remington′s PharmaceuticalScience”，第17版，1985，在此作为参考文献，可以考虑用于制备适合的制剂，不需非适当的实验。
本发明考虑到适于多种给药途径的组合物形式。而且，给药的有效剂量和途径由已知因素如年龄、性别、体重和其他已知而不需非适当的实验的筛选步骤决定。每种活性药剂的剂量可同此处所引文献(或文献所引文献)和/或对亚单位免疫原性、免疫或疫苗组合物从1或几到几百或几千微克，如1微克到1毫克范围变化。
可以适合量施用重组载体而得到对应所述和/或所引文献所述剂量的体内表达。例如，可以实验确定病毒悬液的剂量范围。本发明的病毒载体或重组体可以约至少103pfu，较优选约104pfu到约1010pfu，例如，约105pfu到约109pfu，例如，约106pfu到约108pfu每剂，例如每剂2ml，的量对猪用药或感染或转染细胞。而且，如果由大于一种重组体表达大于一种基因产品，那么每种重组体都以这样的量给药；或者，联合每种重组体的总量构成这样的量来给药。本发明所用重组载体组合物中，剂量可为在此所述或所引文献所述或为所引文献所引文献所述。例如，重组载体组合物中每种DNA适合的的量可为1微克到2毫克，优选50微克到1毫克。技术人员可以考虑此处所引关于DNA载体的文献(或文献所引文献)来确定重组DNA载体组合物的适合剂量，而不需非适当的实验。
然而，该组合物的剂量，其中成分的浓度和组合物用药时间(该组合物引发适合的免疫反应)可通过如血清的抗体滴定来确定，例如通过ELISA和/或血清中和实验和/或通过在猪中疫苗接种攻击评价。根据技术人员的知识，和本公开和所引文献，这些确定不需非适当的实验。而且，连续给药的时间可类似根据本公开内容的确定方法和本领域知识，不需非适当的实验而确定。可从PRRSV，或从PRRSV基因或其部分的体外重组表达获得目的PRRSV免疫原或表位。制备和/或应用载体表达和表达产物和其衍射产物(如抗体)的应用可同此处公开的所引文献和文献所引文献中的方法。适合的剂量也可基于下述实施例。
本发明在特殊方面针对其中，特别是在其基因组的非必须区含来自PRRSV的DNA序列的重组痘病毒。该重组痘病毒表达外源的PRRSV基因的基因产物。具体为，编码PRRSV蛋白的ORF2，ORF3，ORF4，ORF5，0RF6，和ORF7基因被分离，鉴定并插入到ALVAC(金丝雀痘病毒载体)重组体中。有利的，该金丝雀痘病毒载体含有并表达PRRSV开放阅读筐3和5，或5和6，或4和5，或其组合特别是3和5和6，或4和5和6。所用分子生物学技术为Sambrook等所述。(1989)。进一步通过下述实施例描述本发明，这些实施例用于说明，而不应理解为对本发明的限制。
实施例细胞系和病毒株PRRSV毒株是P120-117B/13/Macro/1/27-01-93，1991年在德国从被感染的小猪的不同的器官中分离获得。同样见ATCC VR-2332；美国专利号5,476,778；美国专利号5,620,691；WO 92/21375；I-1102，于1991年6月5日保藏在法国巴黎的巴斯德研究所；Meulenberg J等人，病毒学(Virology)，19262-72(1993)；Mardassi H等人，Arch.Virol.，1401405-1418(1995)；Den Boon等人，1991；Godeny等人，1993；Meulenberg等人，1993a；WO 98/03658；PCT/RF97/01313；法国申请号96 09338；美国申请序列号09/232,468；Murtaugh，1995；以及在此引用的其它文献。
亲本金丝雀痘病毒(Rentschler毒株)是金丝雀的疫苗株。这种疫苗株来自野生型的分离物并且在鸡胚成纤维细胞中连续200多代培养将其毒性减弱。主病毒种经过在琼脂中4次连续的噬斑纯化，并且单噬斑克隆通过5次附加的传代进行扩增，此后将该贮备病毒(Stockvirus)用作亲代病毒进行体外重组实验。经噬斑纯化的金丝雀痘病毒分离物命名为ALVAC，ALVAC于1996年11月14日依照布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC编号VR-2547；同样见在此引用的其它文献。
痘病毒重组体的产生包括4个不同的步骤(1)插入质粒的构建，插入质粒包含痘病毒基因组中插入位点的两侧序列(“臂”)和位于两侧臂之间的多克隆位点(MCS)(例如，见实施例1)；(2)供体质粒的构建，包括在插入质粒的多克隆位点插入外源基因的表达框(例如，见实施例2和实施例3)；(3)在细胞培养物中，供体质粒的臂部和亲代痘病毒基因组之间发生体外重组，将外源基因的表达框插入痘病毒基因组中适当的位点，并通过噬斑纯化重组病毒(例如，见例10)。实施例1在C6位点构建金丝雀痘病毒插入质粒图1(SEQ ID NO1)是3.7kb的金丝雀痘病毒DNA片段序列。分析此序列发现一个开放阅读框，将其命名为C6L，它起始在377位终止在2254位。下文描述了C6插入质粒的构建，通过缺失C6开放阅读框并用侧翼含有转录和翻译终止信号的多克隆位点将其替换。用寡核苷酸引物C6A1(SEQ ID NO2)和C6B1(SEQ ID NO3)从金丝雀痘基因组DNA中扩增出380bp的PCR片段.用寡核苷酸引物C6C1(SEQID NO4)和C6D1(SEQ ID NO5)从金丝雀痘基因组DNA中扩增出1155bp的PCR片段.为了使380bp和1155bp的片段融合，将其同时用作为模板，用寡核苷酸引物C6A1(SEQ ID NO2)和C6D1(SEQ IDNO5)扩增出1613bp的PCR片段.将此片段用SacI和KpnI酶切，并连接入经SacI和KpnI酶切的pBluescriptSK+中。得到的质粒，pC6L通过DNA测序分析确证。此质粒由370bp的C6上游(“C6左侧臂”)金丝雀痘病毒DNA序列(“C6左侧臂”)，牛痘早期终止信号，处于6个阅读框的翻译终止密码，包含SmaI，PstI，XhoI和EcoRI酶切位点的多克隆位点，牛痘早期终止信号，处于6个阅读框的翻译终止密码和1156bp的下游金丝雀痘病毒DNA序列(“C6右侧臂”)。
质粒pJP099来自pC6L，它是通过将含有结合外源基因的牛痘H6启动子的序列框连入pC6L的SmaI和EcoRI酶切位点形成的。质粒pJP099在H6启动子的3′端含有单一的EcoRV酶切位点和单一的NruI酶切位点，在外源基因的终止密码和C6左侧臂之间含有单一的SalI和PspAI酶切位点。因此，来自质粒pJP099的～4.5kb的EcoRV/SalI或者EcoRV/PspAI酶切片段包含质粒序列(pBluescriptSK+；Stratagene，拉霍亚市，加利福尼亚州，美国)，2个C6臂，以及从H6启动子的5′端到EcoRV酶切位点。质粒pJP105来自pJP099，包含不同的插入pC6L的外源基因。来自质粒pJP105的～4.5kb的EcoRV/SalI酶切片段与上述pJP099的酶切片段相同。引物序列引物C6A1(SEQ ID NO2)ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT引物C6B1(SEQ ID NO3)GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA引物C6C1(SEQ ID NO4)CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA引物C6D1(SEQ ID NO5)GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG实施例2PRRSV的制备和病毒RNA的提取使用DMEM培养基添加5％的胎牛血清在MA104细胞中扩增PRRSV毒株P120-117B/13/Macro/1/27-01-93.37℃培养4天之后收集被感染的细胞。反复冻融3次后离心去除细胞碎片。按照微量总RNA分离试剂盒(Clontech Laboratories，股份有限公司，帕洛阿尔托市，加利福尼亚州，美国；目录号K1044-1；用于开放阅读框4至7)，或者高纯度RNA提取试剂盒(Boehringer Mannheim股份有限公司，Roche分子生化试剂，曼海姆，德国；ref1828665；用于开放阅读框2和3)从病毒上清液中提取总RNA。得到的RNA沉淀悬浮于20微升经DEPC处理的水中。实施例3PRRSV开放阅读框2的ALVAC供体质粒的构建按照第一链cDNA合成试剂盒(Perkin Elmer，Roche分子系统股份有限公司，Branchburg，新泽西州，美国；目录号N808-0017)第一条cDNA链的合成反应体系的终体积为20微升，其中包括1微升病毒RNA(见实施例2)和19微升RT-PCR MasterMix。MasterMix中包括MgCl2(5mM)，PCR缓冲液II(1×)，dNTPs(1mM)，RNA酶抑制剂(1单位)，鼠科白血病病毒逆转录酶(2.5单位)，和用作引物(序列标识号6)的寡核苷酸PB613(0.75μM)。反应混合液连续在42℃保温15分钟，99℃保温5分钟，4℃保温5分钟。随后用100微升终体积对单链cDNA进行PCR扩增，扩增体系由20微升RT-PCR反应液和80微升含有寡核苷酸引物PB612(SEQ ID NO7)和PB613(SEQ IDNO6)的PCR混合物(10微升10×反应缓冲液，25mM每种的dNTP，2.5单位的克隆Pfu DNA聚合酶(ref#600154；Stratagene，拉霍亚市，加利福尼亚州，美国))。进行35个扩增循环(95℃保温45秒；56℃保温45秒和72℃保温1分钟)。1534bp的PCR片段包括PRRSV开放阅读框2和开放阅读框3的编码序列，经过Geneclean(GENECLEAN试剂盒；BIO101，Vista，加利福尼亚州，美国)纯化，并克隆入pCRII质粒(Invitrogen，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州，美国)，结果质粒命名为pPB356。
开放阅读框2和3的共有序列来自pPB356三个克隆的插入序列。开放阅读框2的共有核苷酸序列有5个位置(在750bp中99％的同源性)不同于参考序列(PRRSV Lelstad毒株，Genebank编号M96262)，其中2个位置的氨基酸序列发生改变(29号氨基酸pPB356为丝氨酸，Lelystad为脯氨酸；122号氨基酸pPB356为Val结氨酸，Lelystad为丙氨酸)。开放阅读框3的共有核苷酸序列有6个位置(在798bp中99％的同源性)不同于参考序列(PRRSV Lelstad毒株，Genebank编号M96262)，其中4个位置的氨基酸序列发生改变(15号氨基酸pPB356为val结氨酸，Lelystad为苯丙氨酸；93号氨基酸pPB356为脯氨酸，Lelystad为丝氨酸；102号氨基酸pPB356为精氨酸，Lelystad为赖氨酸；150号氨基酸pPB356为谷氨酰胺，Lelystad为组氨酸)。pPB356.6A克隆含有开放阅读框2和开放阅读框3的共有氨基酸序列。
通过PCR方法获得PRRSV开放阅读框2；在pPB356.6A质粒上使用引物JP800(SEQ ID NO8；包括H6启动子的3′端(从EcoRV位点开始)和PRRSV开放阅读框2的5′端)和JP801(SEQ ID NO9；包括PRRSV开放阅读框2的3′端和SalI克隆位点)产生约770bp的片段，命名为PCRJ1315.将PCRJ1315用EcoRV和SalI进行酶切，克隆入约4.5kb的来自pJP105的EcoRV/SalI酶切片段(见实施例1)。结果质粒通过DNA序列分析确证并命名为pJP115(见图2中的质粒图谱和图3中的序列(SEQ ID NO10))。供体质粒pJP115(用NotI线性化)用于体外重组(IVR)分析来产生ALVAC重组体vCP1642(见实施例10)。引物序列引物PB613(SEQ ID NO6)(下游orf3)TAG AAA AGG CAC GCA GAA AGC引物PB612(SEQ ID NO7)(上游orf2)CAG GTA GAG CTA GGT AAA CCC引物JP800(SEQ ID NO8)CAT CAT CAT GAT ATC CGT TAA GTT TGT ATC GTA ATG CAA TGG GGTCAC TGT GG引物JP801(SEQ ID NO9)TAC TAC TAC GTC GAC TCA GCT CGA ATG ATG TGT TGC实施例4PRRSV开放阅读框3的ALVAC供体质粒的构建来自pPB356.6A克隆(见实例3)的PRRSV开放阅读框3序列在334-340位含有T5NT，目前认为它是痘病毒的早期转录终止信号，因此，需要进行深默突变。通过PCR方法获得PRRSV开放阅读框3；在pPB356.6A质粒上使用引物JP804(SEQ ID NO11；包括H6启动子的3′端(从EcoRV位点开始)和PRRSV开放阅读框3的5′端)和JP805(SEQID NO12；包括PRRSV开放阅读框3的3′端和SalI克隆位点)产生约820bp的片段，命名为PCRJ1317A.将PCRJ1317A用EcoRV和SalI进行酶切，克隆入约4.5kb的来自pJP105的EcoRV/SalI酶切片段(见实例1)。将结果质粒的两个克隆命名为8S20和8S19，对开放阅读框3进行DNA序列分析。在克隆8S19和8S20中，T5NT信号的5′端之前和3′端之后为正确开放阅读框3的序列。
为了突变T5NT，在8S19质粒上使用引物JP804(SEQ ID NO11)和JP821(SEQ ID NO13；包括从BspEI位点的下游开始并且一直通过T5NT改变的序列)产生PCRJ1319片段。将PCRJ1319用EcoRV和BspEI进行酶切，连接入经EcoRV/BspEI酶切的8S20.结果质粒命名为pJP119并通过序列分析确证(见图4中的质粒图谱和图5中的序列(SEQID NO14))。供体质粒pJP119(用NotI线性化)用于体外重组(IVR)分析来产生ALVAC重组体vCP1643(见实例10)。引物序列引物JP804(SEQ ID NO11)CAT CAT CAT GAT ATC CGT TAA GTT TGT ATC GTA ATG GCT CAT CAGTGT GCA CG引物JP805(SEQ ID NO12)TAC TAC TAC GTC GAC TTA TCG TGA TGT ACT GGG GAG引物JP821(SEQ ID NO13)TAT CCC GAA CAA CTC CGG ATG GAA TTG GGC CGC GTA GGA AAAGGA CAA GAA AGC CAG CCA AGC实例5PRRSV开放阅读框4的ALVAC供体质粒的构建按照第一链cDNA合成试剂盒(Perkin Elmer，Roche分子系统股份有限公司，Branchburg，新泽西州，美国；目录号N808-0017)第一条cDNA链的合成反应体系的终体积为20微升，其中包括1微升病毒RNA(见实例2)和19微升RT-PCR MasterMix。MasterMix中包括MgCl2(5mM)，PCR缓冲液II(1×)，dNTPs(1mM)，RNA酶抑制剂(1单位)，鼠科白血病病毒逆转录酶(2.5单位)，和用作引物的寡核苷酸PB472(0.75μM)(序列标识号15)。反应混合液连续在42℃保温15分钟，99℃保温5分钟，4℃保温5分钟。随后用100微升终体积对单链cDNA进行PCR扩增，扩增体系由20微升RT-PCR反应液和80微升含有寡核苷酸引物PB471(SEQ ID NO16)和PB472(SEQ ID NO15)的PCR MasterMix(2mM MgCl2，1×PCR缓冲液II，和2.5单位的Ampli TaqDNA聚合酶)。开始在95℃保温2分钟之后，进行35个扩增循环(96℃保温45秒；56℃保温45秒和72℃保温1.5分钟)。包含PRRSV开放阅读框4编码序列的PCR片段经过Geneclean(GENECLEAN试剂盒；BIO101，Vista，加利福尼亚州，美国)纯化之后，用SalI和BamHI酶切产生595bp的SalI-BamHI酶切片段。将此酶切片段克隆入经SalI和BamHI酶切的pVR1012载体(VICAL股份有限公司，圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)，获得质粒pPB272。对存在于3个独立克隆的开放阅读框4进行全程测序分析并建立共有序列而且与参考序列(PRRSV Lelstad毒株，Genebank编号M96262)比较。发现4个碱基对突变(在552bp的开放阅读框4序列中，99％的同源性)，但是仅有一处碱基对突变引起了氨基酸的变化(8号氨基酸在Lelystad和pPB272分别为苯丙氨酸和亮氨酸)。
为了将PRRSV开放阅读框4插入ALVAC C6插入质粒pJP099(见实例1)，在pPB272质粒上使用引物JP762(SEQ ID NO17；包括H6启动子的3′端(从EcoRV位点开始)和PRRSV开放阅读框4的5′端)和JP763(SEQ ID NO18；包括PRRSV开放阅读框4的3′端和SalI克隆位点)产生PCRJ1306片段。将PCRJ1306用EcoRV和SalI进行酶切产生约570bp的片段，将其克隆入约4.5kb的来自pJP099的EcoRV/SalI酶切片段。结果质粒命名为pJP103，并通过序列分析确证含有与pPB272中的开放阅读框4相同的推定的氨基酸序列(见图6中的图谱和图7中的序列(SEQ ID NO19))。供体质粒pJP103(用NotI线性化)用于体外重组(IVR)分析来产生ALVAC重组体vCP1618(见实例10)。引物序列引物PB471(SEQ ID NO16)TTG TCG ACG GCA ATT GGT TCC ATT TGG AAT G引物PB472(SEQ ID NO15)TTG GAT CCC CAA TTT GTG AGA ACA TCT C引物JP762(SEQ ID NO17)CAT CAT CAT GAT ATC CGT TAA GTT TGT ATC GTA ATG GCT GCG GCCACT CTT TTC引物JP763(SEQ ID NO18)TAC TAC TAC GTC GAC TCA TAT TGC CAA GAG AAT GGC实例6PRRSV开放阅读框5的ALVAC供体质粒的构建按照第一链cDNA合成试剂盒(Perkin Elmer，Roche分子系统股份有限公司，Branchburg，新泽西州，美国；目录号N808-0017)第一条cDNA链的合成反应体系的终体积为20微升，其中包括1微升病毒RNA(见实例2)和19微升RT-PCR MasterMix。MasterMix中包括MgCl2(5mM)，PCR缓冲液II(1×)，dNTPs(1mM)，RNA酶抑制剂(1单位)，鼠科白血病病毒逆转录酶(2.5单位)，和用作引物的寡核苷酸PB43(0.75μM)(序列标识号20)。反应混合液连续在42℃保温15分钟，99℃保温5分钟，4℃保温5分钟。随后用100微升终体积对单链cDNA进行PCR扩增，扩增体系由20微升RT-PCR反应液和80微升含有寡核苷酸引物PB462(SEQ ID NO21)和PB43(SEQ ID NO20)的PCR MasterMix(2mM MgCl2，1×PCR缓冲液II，和2.5单位的Ampli Taq DNA聚合酶)。开始在95℃保温2分钟之后，进行35个扩增循环(96℃保温45秒；56℃保温45秒和72℃保温2分钟)。包含PRRSV开放阅读框5的编码序列的PCR片段经过Geneclean(GENECLEAN试剂盒；BIO101，Vista，加利福尼亚州，美国)纯化之后，用SalI和BamHI酶切产生642bp的SalI-BamHI酶切片段。将此酶切片段克隆入经SalI和BamHI酶切的pVR1012载体(VICAL股份有限公司，圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)，获得质粒pPB273。将此PCR片段克隆入pCRII质粒(Invitrogen，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州，美国)，产生质粒为pPB267。将质粒pPB273用SalI和ClaI酶切产生487bp的SalI-ClaI片段(片段A)。将质粒pPB267用ClaI和BamHI酶切产生161bp的ClaI-BamHI片段(片段B)。将片段A和B连接入经SalI和BamHI酶切的pVR1012载体(VICAL股份有限公司，圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)，获得含有PRRSV开放阅读框5的质粒pPB270。对存在于3个单克隆的开放阅读框5进行全程测序分析并确定共有序列且与参考序列(PRRSV Lelstad毒株，Genebank编号M96262)比较发现100％的同源性。
对PRRSV开放阅读框5的序列分析表明在其59-65和264-270处含有两个T5NT，目前认为它是痘病毒的早期转录终止信号。为了对在开放阅读框5内编码的这两处T5NT进行沉默突变，我们使用下面的策略。为了突变T5NT(59-65)，在质粒pPB270上使用引物JP764(SEQID NO22；引物764包含H6启动子的3′端和包括目的T5NT变化的PRRSV开放阅读框5的5′端前71个碱基)和JP776(SEQ ID NO23；引物JP776包括PRRSV开放阅读框5的3′端序列和PspAI克隆位点)产生约627bp的PCRJ1307片段，并将其克隆入pCR2.1质粒(Invitrogen，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州，美国)。将结果质粒命名为pJP106。从质粒pJP106分离出约627bp包含PRRSV开放阅读框5的EcoRV和PspAI酶切片段，并将其克隆入来自质粒pJP099(见实例1)的约4.5kb的EcoRV/PspAI酶切片段，构建出的新质粒命名为pJP108。为了突变T5NT(264-270)，在质粒pJP108上使用引物JP766(SEQ ID NO24；引物766包含H6启动子的20个碱基)和JP767(SEQ ID NO25；引物JP767含有包括目的T5NT变化的PRRS开放阅读框5的序列)产生约345bp的PCRJ1314片段。将PCRJ1314用EcoRV和SnaBI进行酶切并将其克隆入约4.9kb的来自pJP108的EcoRV/SnaBI酶切片段。结果质粒命名为pJP110，并通过序列分析确证含有带预期的T5NT突变的(在开放阅读框的63和267位T变为C)开放阅读框5，这些突变并不影响基因的氨基酸序列(见图8中的图谱和图9中的序列(SEQ ID NO26))。供体质粒pJP110(用NotI线性化)用于体外重组(IVR)分析来产生ALVAC重组体vCP1619(见实例10)。引物序列引物PB43(SEQ ID NO20)ATA GGA TCC TTG CAA AAA TCG TCT AGG CC引物PB462(SEQ ID NO21)TTG TCG ACG CCA TTC TCT TGG CAA TAT GAG ATG引物JP764(SEQ ID NO22)ATC ATG ATA TCC GTT AAG TTT GTA TCG TAA TGA GAT GTT CTC ACAAAT TGG GGC GTT TCT TGA CTC CGC ACT CTT GCT TCT GGT GGC TTTTCT TGC TGT G引物JP766(SEQ ID NO24)ATT-TCA-TTA-TCG-CGA-TAT-CC引物JP767(SEQ ID NO25)GCT-GCA-GAG-TAC-GTA-CCG-CCC-GCC-AAC-AAA-TCC-TGC-AGT-GGA-TAC-AGC-GCC-GAG-ACC-GAG-CGC-GTC-AAA-GAA-ATG-GCT-TG引物JP776(SEQ ID NO23)TAC-TAC-TAC-CCC-GGG-CTA-GGC-CTC-CCA-TTG-CTC-AGC实例7PRRSV开放阅读框6的ALVAC供体质粒的构建按照第一链cDNA合成试剂盒(Perkin Elmer，Roche分子系统股份有限公司，Branchburg，新泽西州，美国；目录号N808-0017)第一条cDNA链的合成反应体系的终体积为20微升，其中包括1微升病毒RNA(见实例2)和19微升RT-PCR MasterMix。MasterMix中包括MgCl2(5mM)，PCR缓冲液II(1×)，dNTPs(1mM)，RNA酶抑制剂(1单位)，鼠科白血病病毒逆转录酶(2.5单位)，和用作引物的寡核苷酸PB465(0.75μM)(序列标识号27)。反应混合液连续在42℃保温15分钟，99℃保温5分钟，4℃保温5分钟。随后用100微升终体积对单链cDNA进行PCR扩增，扩增体系由20微升RT-PCR反应液和80微升含有寡核苷酸引物PB464(SEQ ID NO28)和PB465(SEQ ID NO27)的PCR MasterMix(2mM MgCl2，1×PCR缓冲液II，和2.5单位的Ampli TaqDNA聚合酶)。开始在95℃保温2分钟之后，进行35个扩增循环(96℃保温45秒；56℃保温45秒和72℃保温1.5分钟)。包含PRRSV开放阅读框6编码序列的PCR片段经过Geneclean(GENECLEAN试剂盒；BIO101，Vista，加利福尼亚州，美国)纯化之后，用SalI和BamHI酶切产生572bp的SalI-BamHI酶切片段。将此酶切片段克隆入经SalI和BamHI酶切的pVR1012载体(VICAL股份有限公司，圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)，获得质粒pPB268。pPB268的一个克隆中的开放阅读框6序列与参考序列(PRRSV Lelstad毒株，Genebank编号M96262)的比较，发现100％的同源性。
为了将PRRS开放阅读框6插入ALVAC C6插入质粒pJP099(见实例1)，在pPB268质粒上使用引物JP768(SEQ ID NO29；包括H6启动子的3′端(从EcoRV位点开始)和PRRS开放阅读框6的5′端)和JP769(SEQ ID NO30；包括PRRS开放阅读框6的3′端和SalI克隆位点)产生PCRJ1302片段。将PCRJ1302用EcoRV和SalI消化产生约550bp的片段中，将其克隆入约4.5kb的来自pJP099的EcoRV/SalI酶切片段。结果质粒通过序列分析确证并命名为pJP100。序列分析发现同质粒pPB268有1个碱基的变化在51位由C变为T，这没有引起氨基酸的改变(见图10中的pJP100质粒图谱和图11中的序列(SEQID NO31))。供体质粒pJP100(用NotI线性化)可以使用实例10中描述的方法用于体外重组(IVR)分析来产生ALVAC重组体。引物序列引物PB464(SEQ ID NO28)TTG TCG ACG AGG ACT TCG GCT GAG CAA TG引物PB465(SEQ ID NO27)TTG GAT CCT TTT CTT TTT CTT CTG GCT CTG G引物JP768(SEQ ID NO29)
CAT CAT CAT GAT ATC CGT TAA GTT TGT ATC GTA ATG GGA GGC CTAGAC GAT TTT TG引物JP769(SEQ ID NO30)TAC TAC TAC GTC GAC TTA CCG GCC ATA CTT GAC GAG实例8PRRSV开放阅读框5和6的ALVAC双供体质粒的构建为了使开放阅读框5以头对头的方向(2个启动子的5′端连接在一起，并且两个开放阅读框方向相反；见图12)插入开放阅读框6的供体质粒，将来自pJP110(见实例6)的约742bp的SmaI/DpnI酶切片段克隆入经SmaI酶切的pJP100(见实例7)中。结果质粒通过限制酶切分析确证含有预期方向插入的PRRS开放阅读框5和6，并将其命名为pJP113(见图12中的图谱和图13中的序列(SEQ ID NO32))。供体质粒pJP113(用NotI线性化)用于体外重组(IVR)分析来产生ALVAC重组体vCP1626(见实例10)。实例9PRRSV开放阅读框7的ALVAC供体质粒的构建按照第一链cDNA合成试剂盒(Perkin Elmer，Roche分子系统股份有限公司，Branchburg，新泽西州，美国；目录号N808-0017)第一条cDNA链的合成反应体系的终体积为20微升，其中包括1微升病毒RNA(见实例2)和19微升RT-PCR MasterMix。MasterMix中包括MgCl2(5mM)，PCR缓冲液II(1×)，dNTPs(1mM)，RNA酶抑制剂(1单位)，鼠科白血病病毒逆转录酶(2.5单位)，和用作引物的寡核苷酸PB461(0.75μM)(序列标识号33)。反应混合液连续在42℃保温15分钟，99℃保温5分钟，4℃保温5分钟。随后用100微升终体积对单链cDNA进行PCR扩增，扩增体系由20微升RT-PCR反应液和80微升含有寡核苷酸引物PB460(SEQ ID NO34)和PB461(SEQ ID NO33)的PCR MasterMix(2mM MgCl2，1×PCR缓冲液II，和2.5单位的Ampli TaqDNA聚合酶)。开始在95℃保温2分钟之后，进行35个扩增循环(96℃保温45秒；56℃保温45秒和72℃保温1.5分钟)。包含PRRSV开放阅读框7的编码序列的PCR片段经过Geneclean(GENECLEAN试剂盒；BIO101，Vista，加利福尼亚州，美国)纯化之后，用SalI和BamHI消化产生411bp的SalI-BamHI酶切片段。将此酶切片段克隆入经SalI和BamHI酶切的pVR1012载体(VICAL股份有限公司，圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)，获得质粒pPB269。其中pPB269的一个克隆中开放阅读框6序列与参考序列(PRRSV Lelstad毒株，Genebank编号M96262)有100％的同源性。
为了将PRRSV开放阅读框7插入ALVAC C6插入质粒pJP099(见实例1)，在pPB269质粒上使用引物JP770(SEQ ID NO35；包括H6启动子的3′端(从EcoRV位点开始)和PRRSV开放阅读框7的5′端)和JP771(SEQ ID NO36；包括PRRSV开放阅读框7的3′端和SalI克隆位点)产生PCRJ1303片段。将PCRJ1303用EcoRV和SalI进行酶切产生约415bp的片段，将其克隆入约4.5kb的来自pJP099的EcoRV/SalI酶切片段。结果质粒通过序列分析确证并命名为pJP101(见图14中的图谱和图15中的序列(SEQ ID NO37))。供体质粒pJP101(用NotI线性化)可以使用实例10中描述的方法用于体外重组(IVR)分析来产生ALVAC重组体。引物序列引物PB460(SEQ ID NO34)TTG TCG ACA TGG CCG GTA AAA ACC AGA GCC引物PB461(SEQ ID NO33)TTG GAT CCA TTC ACC TGA CTG TCA AAT TAA C引物JP770(SEQ ID NO35)CAT CAT CAT GAT ATC CGT TAA GTT TGT ATC GTA ATG GCC GGT AAAAAC CAG AGC引物JP771(SEQ ID NO36)TAC TAC TAC GTC GAC TTA ACT TGC ACC CTG ACT GGC实例10ALVAC-PRRSV重组体的产生质粒pJP115(开放阅读框2；见实例3)，pJP119(开放阅读框3；见实例4)，pJP103(开放阅读框4；见实例5)，pJP110(开放阅读框5；见实例6)，pJP113(开放阅读框5和6；见实例8)用NotI线性化并用先前描述的(Panicali和Paoletti，1982年；Piccini等人，1987年)磷酸钙沉淀法将其转染入感染ALVAC的原代鸡胚成纤维细胞(CEF cell)。根据特异性PRRSV放射性标记探针杂交分析选择阳性噬斑，并且经过连续4轮噬斑纯化直到获得纯的群体。
然后对来自每次体外重组分析(IVR)的单个典型的噬斑进行扩增，并且得到的ALVAC重组体分别命名为vCP1642(开放阅读框2)，vCP1643(开放阅读框3)，vCP1618(开放阅读框4)，vCP1619(开放阅读框5)，和vCP1626(开放阅读框5和开放阅读框6)。表1表明供体质粒，ALVAC重组体和表达的PRRS阅读框的名称。所有这些重组体均来自ALVAC载体和供体质粒之间的重组事件，并且它们均包含插入ALVAC的C6位点的PRRSV开放阅读框。使用限制酶切分析和用不同探针进行Southern印迹确定所有重组体的基因组结构。表1产生的ALVAC-PRRSV重组体列表
使用实例7和9中分别描述的供体质粒pJP100和pJP101可以同样的方式产生仅仅表达PRRSV开放阅读框6和PRRSV开放阅读框7的ALVAC重组体。实例11用CarbopolTM974P制备重组的金丝雀痘病毒为了制备疫苗，重组金丝雀痘病毒(实例10)可与卡波姆溶液混合。根据本发明用于猪疫苗接种的卡波姆成分是由BF Goodrich公司制造的CarbopolTM974P(分子量3,000,000)。首先用每升含有1克氯化钠的蒸馏水准备1.5％的CarbopolTM974P贮存液。然后将此贮存液用于在生理盐水中制备每毫升4毫克的CarbopolTM974P。通过一步或者连续的几步，使CarbopolTM974P贮存液与所需体积的生理盐水混合，每步均用1N(或者更浓的)的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值使最终pH值为7.3-7.4。
最终的CarbopolTM974P溶液可以直接用于重构冻干的重组病毒或者稀释较浓的病毒贮存液。例如为了得到每2毫升含有10e8pfu剂量的最终病毒悬浮，可以将0.1毫升每毫升10e8pfu的病毒贮存液稀释入1.9毫升上述每毫升含有4毫克CarbopolTM974P的即用溶液中。根据所需的最终pfu/ml的滴定量，使用相同的计算方法制备重组病毒的混合液。同理，可以制备每毫升含有2毫克CARBOPOLTM974P的即用溶液。实例12妊娠母猪模型中的疫苗接种和痛毒攻击分别使用单独的ALVAC/PRRSV重组体或者ALVAC/PRRSV重组体的混合物对8个月的普通小母猪接种。将重组病毒贮存液用无菌生理盐水(0.9％氯化钠)稀释制备接种用病毒悬液。合适的病毒悬液的浓度约为每剂量10e6，10e7，10e8pfu。也可以与实例11中描述的CarbopolTM974P溶液混合重组病毒悬液制备接种用溶液。
单独的重组病毒或者重组病毒的混合物可以包含于疫苗中。例如，疫苗可以包含由生理盐水稀释的vCP1642，vCP1643，vCP1618，vCP1619，vCP1626，或者由用生理盐水稀释的vCP1643+vCP1619，vCP1643+vCP1626，vCP1618+vCP1626，vCP1619+vCP1618混合物组成。如上(实例11)所述，同样的单一重组病毒或者重组病毒的混合物可以与CarbopolTM974P溶液混合。
全部疫苗均以2毫升剂量肌肉注射。第一次接种记为0天，大约在第一次注射后21天，进行加强(boost)。一组对照母猪不进行接种(标记为未接种和未受病毒攻击组)。
然后，用标准的疫苗对这些小母猪进行接种，并喂以适当的激素，观察其发情征兆，并且大约在第37天用来自无PRRSV公猪的精液进行受精。
然后将怀孕的母猪(通过超声确定)放养在铺有稻草的大围栏中。用标准饲料喂养并且不限制水的摄入。大约第127天(约怀孕90天)，通过鼻内给药对所有组的母猪用1毫升的PRRSV P120 117B攻击毒株的悬液(悬液的病毒滴定量约为10e7，5CCID50)攻击。用一注射器以喷雾的方式将攻击病毒给药到每个鼻孔中。
在攻击之后按如下标准监视全部动物-攻击前一天和攻击次日的直肠温度-幼猪在出生时，出生后约7天，14天和21天时的体重-反常行为实验过程中收集所有母猪的血样用于提取病毒和抗体滴定。同时也收集初乳(在母猪分娩时的)和乳汁样品。实验过程中收集所有幼猪的血样用于提取病毒和抗体滴定。对每只死亡的或者安乐死的动物进行死后检查。所发明的重组体引发了免疫学反应。实例13幼猪模型中的疫苗接种和病毒攻击来自无PRRSV地区饲养农场的8-10周龄的普通幼猪，体重范围在25-27公斤，根据它们的体重随机分组。接种组有6只幼猪并且一个对照组有9只幼猪。使用单独的ALVAC/PRRSV重组体或者ALVAC/PRRSV重组体的混合物对它们接种。在无菌生理盐水(0.9％氯化钠)中稀释重组病毒贮存液制备接种用病毒悬液。合适的病毒悬液浓度约为每剂量10e6，10e7，10e8pfu。也可以用实例11中描述的CarbopolTM974P溶液混合重组病毒悬液制备免疫接种用溶液。
单独的重组病毒或者重组病毒的混合物可以包含于疫苗。例如，接种用溶液可以由用生理盐水稀释的vCP1642，vCP1643，vCP1618，vCP1619，vCP1626组成，或者由用生理盐水稀释的vCP1643+vCP1619，vCP1643+vCP1626，vCP1618+vCP1626，vCP1619+vCP1618组成。如上(实例11)所述，同样的单一重组病毒或者重组病毒的混合物可以与CarbopolTM974P溶液混合。
在0天通过肌肉注射对幼猪接种2毫升单剂量的疫苗，大约在第一次注射后21天，用2ml单剂量的同种疫苗进行加强。
大约第35天，对所有组的幼猪，包括非接种组鼻内施用1.5毫升的滴度约为每毫升10e7，5CCID50的PRRSV攻击毒株(P120 117B毒株)的悬液。用注射器以喷雾的方式将攻击病毒给药到每个鼻孔中。
在攻击之后，监测所有幼猪的临床症状(腹泻，食欲减退，忧郁/虚弱，呕吐，咳嗽/喷嚏，结膜炎)以及直肠温度和体重。称量在注射前天和注射之后第21天，第35天(攻击当天)，和第56天(实验结束当日，幼猪安乐死)的所有幼猪的体重。
收集血样用于病毒提取和抗体滴定。
安乐死之后，验尸并取所有幼猪的肺样提取病毒。所发明的重组体引发了免疫学反应。
***在对本发明的详细的优选的实施方案做过描述之后，我们应该了解了附加的权利要求所定义的本发明并不限于以上说明书阐明的特殊细节，只要不偏离本发明的本质和范围，其中很多显著的改变是可能发生的。
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权利要求
1.重组禽痘病毒，其包含与猪生殖和呼吸综合症病毒的基因组RNA互补的DNA。
2.权利要求1的重组禽痘病毒，其为鸡痘病毒。
3.权利要求1的重组禽痘病毒，其为金丝雀痘病毒。
4.权利要求1的重组禽痘病毒，其为ALVAC。
5.根据权利要求1-4中任意一项的重组禽痘病毒，其中与来自猪生殖和呼吸综合症病毒的基因组RNA互补的DNA编码并表达为PRRSV糖蛋白，膜蛋白或者壳体蛋白。
6.权利要求5的重组禽痘病毒，其中它包括与来自猪生殖和呼吸综合症病毒对应于开放阅读框5(ORF5)的基因组RNA互补的DNA。
7.权利要求5的重组禽痘病毒，其中它包括与来自猪生殖和呼吸综合症病毒对应于开放阅读框5(ORF5)和3(ORF3)的基因组RNA互补的DNA。
8.权利要求5的重组禽痘病毒，其中它包括与来自猪生殖和呼吸综合症病毒对应于开放阅读框5(ORF5)和6(ORF6)的基因组RNA互补的DNA。
9.权利要求5的重组禽痘病毒，其中它包括与来自猪生殖和呼吸综合症病毒对应于开放阅读框5(ORF5)和3(ORF3)和6(ORF6)的基因组RNA互补的DNA。
10.权利要求7或者8的重组禽痘病毒，其中ORF5和ORF6或者ORF3为头对头方向。
11.权利要求4的重组禽痘病毒，其为vCP1618，vCP1619，vCP1626，或者vCP1643。
12.用于在以其接种的宿主中诱导免疫反应的免疫组合物，该免疫组合物包含载体以及至少一种权利要求1-11中任意一项的重组病毒。
13.抗PRRS疫苗，其包括载体以及至少一种权利要求1-11中任意一项的重组病毒。
14.权利要求13的疫苗，其进一步包括佐剂。
15.权利要求14的疫苗，其中佐剂为丙烯酸或者甲基丙烯酸聚合物或者马来酸酐和烯衍生物的共聚物。
16.权利要求15的疫苗，其中佐剂为卡波姆，优选Carpobol。
17.权利要求15的疫苗，其中佐剂为EMA。
18.猪疫苗组合物，其包括根据权利要求13-17中任意一项的疫苗，以及至少一种其它疫苗，该疫苗抗至少一种其它的猪病原体。
全文摘要
本发明描述重组载体，如病毒；例如，痘病毒，如禽痘病毒，其含有来自猪生殖和呼吸综合症病毒的外源DNA。本发明还描述含有重组痘病毒的免疫组合物，其用于在施用该组合物的宿主动物中诱导免疫反应。本发明还描述通过对需要治疗的或易受猪生殖和呼吸综合症病毒感染的动物施用本发明的组合物来治疗或防止由猪生殖和呼吸综合症病毒引起的疾病的方法。
文档编号C07K14/08GK1443076SQ01813156
公开日2003年9月17日 申请日期2001年5月18日 优先权日2000年5月24日
发明者J－C·F·奥冬尼特, M·J·M·巴伯罗特, J·M·派里茨, P·G·N·鲍社 申请人:梅瑞尔公司