专利名称：新型药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含CD44-透明质酸结合区的分子用于生产药物的用途。而且，本发明还涉及筛选与含CD44-透明质酸结合区的分子结合的物质的方法。
背景技术：
在包括导致失明的眼疾如黄斑变性、糖尿病视网膜病、视网膜低氧症，慢性炎症如类风湿关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、再狭窄以及癌症发生和转移在内的多种不同病理状态下通过血管生成而形成新血管是一个重要事件。另外，血管瘤是由于内皮细胞增殖失控而引起的。例如这些疾病中许多疾病属于慢性病而且目前缺少满意的药物，因此使得针对这些疾病的治疗和药物的研究变得至关重要。因此，一种血管生成阻断剂具有构成用于治疗这些常见血管(和/或内皮细胞)依赖性疾病的药物的潜力。
一种备受关注的针对这种疾病的药物的靶物质是CD44(Naot等，Adv Cancer Res 1997；71241-319)。CD44是胞外基质透明质酸(HA)的大分子糖胺聚糖的细胞表面受体[Aruffo等，Cell 1990；611303-13]。CD44在多种细胞功能和生理功能中起作用，所述功能包括对HA的粘附和迁移、HA降解和肿瘤转移。CD44受体在其胞外结构域的可变区显示出复杂的可变剪接模式[Screaton等，PNAS 1992；8912160-4]。CD44能够与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)结合，因而能够将AMP-9定位到细胞膜上，这在某种程度上也说明了CD44具有促进肿瘤细胞的侵袭和转移的活性[Yu，1999#3]。
公开CD44及其上述与疾病间的关系的专利参考文献有US-A-6025138，US-A-5902795，US-A-6150162，US-A-6001356，US-A-5990299和US-A-5951982。
WO 94/09811记载了CD44在治疗炎症或检测造血源的癌症转移中的用途。没有公开CD44用于抑制实体瘤生长或血管生成的用途。WO99/45942公开了HA-结合蛋白和含有CD44的肽在抑制癌症和血管发生-依赖性疾病中的用途。CD44被作为一系列HA-结合蛋白的一个实例而得到描述。在两个公开出版物中CD44的用途被限定到其与透明质酸的结合力。
Ahrens等(Oncogene 2001；20；3399-3408)公开了可溶性CD44通过阻断肿瘤细胞表面CD44与透明质酸的结合来抑制黑素瘤的生长。因此，该工作教导了直接影响黑素瘤细胞生长的CD44的透明质酸结合依赖机制。
Alpaugh等(Exp.Cell Res.261，150-158(2000))公开了肌上皮特异性CD44及其抗血管生成的特性。该研究涉及CD44的HA-结合特性。
Bajorath(PROTEINSStructure，Function，and Genetics 39103-111(2000))公开了CD44及其与HA的结合、细胞粘附性和CD44-信号传输。而且，公开了CD44诱变实验，该实验包括确定的非-HA-结合突变R41A和R78S及其对CD44与HA结合的影响。
因此，现有技术公开了CD44的潜在用途，用于说明任何影响都依赖于HA-CD44-相互作用。因此，所有与CD44-衍生肽有关的实用性都直接依赖于其与透明质酸的结合能力。
因为透明质酸在体内进行广泛的高表达，基于抑制胞外组分的治疗产生除肿瘤以外的副作用高风险。而且，由于体内的HA总含量很高，即使增加了副作用的风险，这种方案也需要高剂量的HA-阻断重组蛋白。
因此，为了提供避免上述副作用的新型药物靶物质，需要找到用于治疗肿瘤的新型药物以及CD44与肿瘤生长间相关性的新途径。
另外，还需要研制血管生成的新型抑制剂，这是因为这些抑制剂不但会成为潜在的癌症药物，而且还会成为上述一系列常见病的潜在药物。为了达到这一目的，重要的是阐明CD44与血管生成间的关系，具体地是CD44对脉管系统和各种新血管形成-依赖性疾病的直接潜在作用。
本发明的概述Kogerman等[Kogerman等，Oncogene 1997；151407-16]发现稳定表达人CD44标准同种型(hCD44)的小鼠纤维瘤细胞在大体积的皮下肿瘤中丧失了hCD44的表达力。当将得自这些原发肿瘤的hCD44阴性细胞皮下引入用于进行第二轮肿瘤生长的新小鼠体内时，产生肿瘤的潜伏期明显地比hCD44阳性肿瘤的潜伏期短。
所观察到的表达hCD44的肿瘤的较长潜伏期使得本发明人意识到hCD44超表达在皮下肿瘤生长过程中的抑制作用与肿瘤血管产生的抑制有关。血管生成的诱导对于实体瘤的生长和维持及其转移是必需的。在没有血管生成的条件下，肿瘤无法长大并且以微转移灶的形式保持休眠状态[Holmgren等，Nat Med 1995；1149-53]。本发明人在本发明中发现重组可溶性人CD44透明质酸结合区(CD44HABD)抑制小鸡血管的体内生成和内皮细胞的体外增殖，由此阻断人肿瘤在小鸡和小鼠体内的生长。本发明人记载了一种新型血管生成抑制剂，同时他们还发现重组细胞表面受体CD44抑制体内血管生成和肿瘤生长以及内皮细胞的体外增殖。而且，本发明人创建了也能够抑制血管生成的突变型CD44。CD44的这些突变体的优势在于它们不与HA结合，表明抑制血管生成的机制不依赖于与HA的结合。重要地是，突变CD44作为进行全身施用的药物的用途对血管的生成特异性更强，这是由于它在体内没有被HA结合，因此能以较低剂量进行施用并且引起不希望的副作用的风险也较小。
因此，本发明涉及含CD44-透明质酸结合区的非-HA-结合变体的分子及其类似物和包括特定突变体在内的重组变体用于生产治疗血管生成抑制相关病症的药物的用途。而且，本发明还涉及一种方法，该方法用于筛选与CD44-透明质酸结合区结合因而成为抑制血管生成和细胞增殖的潜在靶物质的分子。本发明进一步涉及一种用于实施该筛选方法的试剂盒以及由该方法选出的分子。并且本发明还涉及一种靶向内皮细胞的含CD44-透明质酸结合区的非-HA-结合变体的分子以及其类似物、重组和突变的变体。
因此，用于治疗血管生成相关病症如各种癌症的药物可以便捷地由本发明利用本发明人提出的新型机制来提供。而且，通过所述筛选方法还可以发现其它影响细胞增殖和/或血管生成的分子。
附图的简要描述
图1表示重组GST和GST-CD44蛋白的SDS PAGE。该凝胶经考马斯亮兰染色。分子量标记物显示于右侧。
图2表示重组CD44透明质酸结合区与透明质酸的结合。a，野生型CD44HABD，而不是与固定化的HA进行结合的R41A，R78SY79S或R41AR78SY79S突变体。b，CD44HABD抑制人主动脉内皮细胞向HA的迁移，而R41A HA-非结合突变体没有作用。A3，阻断与HA结合的CD44的单克隆抗体，也抑制内皮细胞的迁移。
图3表示重组人CD44透明质酸结合区阻断小鸡尿囊绒膜的体内血管生成。a，滤片和从其中血管生成受bFGF诱导的典型血管生成实验中得到的相关CAM。b-d，以血管分支点数；平均血管生成指数±SEM来评价血管的生成；*(P＜0.05)，结果显著。
图4表示重组CD44透明质酸结合区抑制黑色瘤(SMMU-1，M21)和肝细胞癌(HepG2)小鸡CAM中的生长。
图5表示重组CD44透明质酸结合区抑制CD44阴性黑素瘤的生长。a，经CD44HABD、CD44HABDR41AR78SY79S或作为对照的GST处理的裸鼠体内的皮下SMMU-1肿瘤的生长曲线，每组n＝8。b，第16天的肿瘤重量，其中黑线代表中值。c，如所示处理的小鼠在第16天时的典型照片。d，每一高分辨率视野(HPF)内肿瘤边界上的血管数目。*(P＜0.005)，**(0.05)结果显著。
图6.CD44-HABD融合蛋白抑制在裸鼠体内人胰腺癌细胞的生长。经GST-CD44HABD(■)、GS-CD44HABDR41AR78SY79S(▲)或作为对照的GST(◆)处理的裸鼠体内的BxPC-3胰腺癌(a)肿瘤(n＝6-7)。b，实验结束时的BxPC-3肿瘤的平均重量。曲线中的数值和棒形图代表平均值±s.e.m。星号表示P＜0.05。
图7.重组CD44HABD特异性阻断内皮细胞循环。当用GST(■)、GST-CD44HABD 或GS-CD44HABDR41AR78SY79S 处理时的S期细胞比例。HUVEC，人血管内皮细胞；CPAE，牛肺动脉内皮细胞；NHDF，正常人皮肤成纤维细胞；MCF-7，人乳腺癌细胞。
图8表示CD44HABD缺失突变体对内皮细胞增殖的影响。CD44HABD缺失突变体得自3mut CD44HABD(突变位点以粗体表示，图8A)，按照实施例1中的记载生产和纯化重组蛋白。在含10％血清的培养基中采用所示蛋白(终浓度分别为15μg/ml和30μg/ml)将牛肺内皮细胞(CPAE)处理48小时。通过显微照相术(B)或通过MTT染色(Sigma)和分光光度法(C)分析细胞的增殖。
定义“透明质酸结合区”在下文当中被称作habd。
habd的“非-HA-结合变体”是指通过突变或其它任何方式而被修饰的变体，因此它至少失去了与HA结合的部分能力，但仍能够抑制血管生成和/或内皮细胞的增殖。
含CD44-habd分子的“类似物或重组变体”是指含有CD44-habd的分子，诸如融合蛋白，因而至少基本上具有CD44-habd的特性。
“血管生成和/或内皮细胞增殖抑制相关病症”是指这样的病症，该病症通过抑制血管生成和/或内皮细胞增殖而得到治疗或受到影响。
含CD44-habd分子的“结合配偶体”是指对CD44-habd或其突变体具有亲合力的分子。
“受体分子或部分受体分子”是指起着受体作用或是部分受体的分子。
全文当中的“修饰的变体”是指对正常野生型分子进行的任意修饰，诸如缺失、插入、取代、类似物、片段或其重组变体。
本发明的详细描述WO 94/09811记载了CD44在治疗炎症或检测癌转移中的用途。该作者指明CD44在炎症性病症中被上调以及CD44肽能够抑制T-细胞的活化。没有提供CD44抑制转移的相关数据和权利要求而且也没有要求保护CD44在抑制肿瘤生长或血管生成中的用途。WO 99/45942公开了HA-结合蛋白和含CD44的肽抑制癌症和血管生成-依赖性疾病的用途。该出版物利用metastatin，一种软骨连接蛋白的38kDa片段，以及由该片段产生的HA-结合肽来抑制B16小鼠黑素瘤和路易斯(Lewis)肺癌的肺转移。在有HA-结合肽存在的条件下，小鸡CAM上的B16黑素瘤的生长以及内皮细胞在HA上的迁移受到抑制。在上述两个出版物中，HA-结合肽的用途直接与它们结合透明质酸的能力有关。
CD44最初参与了通过依赖其与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的结合能力的机制来加快血管生成的过程(Yu和Stamenkovic，Genes Dev1999；1335-48；Yu和Stamenkovic，Genes Dev 2000；14163-76)。可溶性CD44(sCD44v6-10)在小鼠TA3乳癌细胞中的超表达抑制了MMP-9与肿瘤细胞表面的结合，由此阻断了肿瘤的生长和血管形成(Yu和Stamenkovic 2000)。MMP-9被证实在肿瘤的发生和肿瘤内主要参与了血管的生成(Vu等，Cell 1998；93411-22；Bergers等，Nat CellBiol 2000；2737-44；Coussens等，Cell 2000；103481-90)。由于体外小管生成(tubulogenesis)通过封闭TGFβ而受到抑制，所以CD44-MMP-9复合物还参与了潜伏状态的TGFβ的活化(Yu和Stamenkovic，2000)。
本发明人使用的CD44-HABD的突变体对MMP-9的亲合力差别很大，但不受其影响，对血管生成的抑制作用却非常相同，因而MMP-9结合力对于本发明中公开的血管生成抑制作用起至关重要作用的可能性不大。另外，本发明人描述了CD44直接抑制血管生成的机理。而且，本发明人证实了与前面提及的在被转化的肿瘤细胞表面破坏CD44与MMP-9结合的机理相比，CD44在正常内皮细胞内具有不同靶向物的机理。Gao等(Cancer Res1998；582350-2)指出大鼠Dunning AT3.1前列腺癌细胞的转移能力而非肿瘤形成不取决于与HA的结合，因为CD44标准同种型和R44A非HA-结合突变体的超表达都明显降低了转移性肺集落的形成，却没有减缓局部肿瘤的生长。这表明不同于HA的其它CD44结合配偶体一定参与了转移。已经记载了包括HGF、bFGF、纤连蛋白、骨桥蛋白、选择蛋白等在内的多种CD44结合蛋白。然而，这些蛋白中的几种蛋白的结合却依赖于CD44翻译后修饰和/或我们的重组融合蛋白中不存在的CD44的另外外显子的存在。而且，这些CD44-结合蛋白中的许多种大量存在于体内，从而使得与这些蛋白结合的CD44-衍生物很少被用作药物，这是由于存在着产生副作用的高风险。另外，上述蛋白中没有一种特定于靶向血管细胞，并且它们也不会阻断内皮细胞生长所特别需要的途径。因此该配体以及该途径一定是新的。本发明公开了一种用于鉴定CD44的结合配偶体以及与血管生成和内皮细胞生长受到抑制相关的途径的方法。
本发明的第一个方面涉及含CD44-透明质酸结合区的非-HA结合变体及其类似物、重组和突变变体的分子用于制备治疗血管生成和/或内皮细胞增殖抑制相关病症的药物的用途。
在一个实施方案中，CD44-HABD含有至少一个突变，因而赋予其非-HA-结合的性质。
在一个优选的实施方案中，所述突变选自F34A，F34Y，K38R，K38S，R41A，Y42F，Y42S，R46S，E48S，K54S，Q65S，K68S，R78K，R78S，Y79F，Y79S，N100A，N100R，N101S，Y105F，Y105S，S112R，Y114F，F119A，F119Y。优选地，所述突变选自R41A，R78S，Y79S中的一个或多个。而且，产生3至110个氨基酸长度的任何CD44片段的缺失突变都可能被用于本发明的目的。然而，本领域技术人员轻易就能意识到可以在CD44-HABD部分中引进针对野生型HA-结合CD44的任何突变，诸如一种或多种能够获得所需特性的缺失、取代或插入，所述突变使CD44-HABD或其片段至少部分成为非-HA结合性质的。
CD44-HABD是一种具有人的完整CD44分子中第21-132位氨基酸的蛋白，或者与人CD44的这个区域具有高度同源性。小鸡CD44-HABD是由本发明人分离出来的差别最大的HABD，其含有在氨基酸水平上与人HABD具有55％同源性的序列。因此高度序列同源性意味着至少约55％的氨基酸同源性，理想地是至少65％的同源性，以及最理想地是至少75％的同源性。
而且，本发明的分子涉及缺失型的或以其它任何方式得到的改变型或突变的CD44-HABD蛋白，其中所述的改变型基本具有与原始CD44-HABD蛋白或本文指定的CD44-HABD突变体相同的性质，所述性质是通过本文记载的任意一种方法测得的。
在一个优选的实施方案中，含CD44-透明质酸结合区的非-HA结合变体分子选自人CD44-HABD(SEQ ID NO2)，狗CD44-HABD(SEQ ID NO4)，小鸡CD44-HABD(SEQ ID NO6)，人CD44-HABD-R41A(SEQ ID NO8)，人CD44-HABD-R78SY79S(SEQ ID NO10)和CD44-HABD-R41AR78SY79S(SEQID NO12)，上述序列进一步含有至少一种修饰，从而使它们成为非-HA-结合性质的。其它变体也是可行的，诸如具有R41A，R78S或Y79S突变的CD44-HABD-R78S，CD44-HABD-Y79S以及GST-CD44-HABD-融合蛋白。
CD44-HABD-R41A，CD44-HABD-R78SY79S和CD44-HABD-R41AR78SY79S是CD44-HABD的突变变体的优选实例，其中最后四个字母/数字表示突变的位置和类型。
GST-CD44-HABD是GST-部分和CD44-HABD的融合蛋白。其它可能的融合蛋白可以选自IgG，IgM，IgA，His，HA，FLAG，c-myc，EGFP。GST是一种短链谷胱甘肽-S-转移酶，其被用作采用GST-结合柱对融合蛋白进行纯化目的以及检测目的的标记物。GST的天然存在形式为26kDa的蛋白质(Parker，M.W.等，J.Mol.Biol.213，221(1990)；J1，X.等，Biochemistry 31，10169(1992)；Maru，Y.等，J.Biol.Chem.271，15353(1996))。
因此，在另一个实施方案中，所述重组变体是具有GDT-部分和CD44-HABD部分的融合蛋白，其中所述CD44-HABD-部分是野生型或突变型。除GST以外的其它标记物也完全可以使用。
优选地，所述CD44-透明质酸结合区与SEQ ID NO2序列具有至少55％的同源性，更优选地至少65％的同源性，甚至更优选地至少75％的同源性。最优选地是所述CD44-透明质酸结合区是序列SEQ IDNO1的一种修饰变体(非-HA-结合基因产物)。
待治疗的病症或疾病可以是选自以下的任一种引起失明的眼疾或视力损伤如黄斑变性、糖尿病视网膜病和视网膜低氧症，慢性炎症如类风湿关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、再狭窄，以及癌生长和转移，以及所有类型的癌症和肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、脑癌、卵巢癌、睾丸癌、骨癌、上皮癌、内皮癌、胰腺癌、肾癌、肌肉癌、肾上腺癌、肠癌、内分泌腺癌、口腔癌、头癌和颈癌或其它实体组织源癌症或任何形式的白血病以及血管瘤。
本发明可以被用于人和兽的医疗中。例如，本发明可以被用于普通动物园中的小鼠、大鼠、小鸡、狗、马、猫、牛和所有长寿物种。优选地，本发明被用于人。
本发明的另一方面涉及含有GST-部分和CD44-HABD部分的重组分子。所述CD44-HABD部分可以例如进行了以下突变中的一种或多种突变F34A，F34Y，K38R，K38S，R41A，Y42F，Y42S，R46S，E48S，K54S，Q65S，K68S，R78K，R78S，Y79F，Y79S，N100A，N100R，N101S，Y105F，Y105S，S112R，Y114F，F119A，F119Y。优选地，所述突变选自R41A，R78S，Y79S中的一种或多种。然而，技术人员很容易就能意识到可以在CD44-HABD部分中引进针对野生型HA-结合CD44的任何突变，诸如一种或多种能够获得所需特性的缺失、取代或插入，所述突变使CD44-HABD或其片段至少部分成为非-HA结合性质的。
在一个优选的实施方案中，所述CD44-HABD-部分含有氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO23、SEQ ID NO26中的任一个氨基酸序列的CD44-HABD的非-HA结合变体，上述序列进一步含有至少一种修饰，从而使其成为非HA-结合性质的。
在最优选的实施方案中，CD44-HABD含有CD44的第23-132位氨基酸中的至少三个连续氨基酸。基本上，3-110个氨基酸大小的所有片段，例如23-25、24-26、25-27位氨基酸等，23-26、24-27位氨基酸等23-27位氨基酸等，23-28位氨基酸等都可能有效。因此，正如技术人员所能容易理解到的，只要具有所需的特性，连续氨基酸多达110个原始分子的氨基酸的所有组合都可以被用于本发明，其中所述特性通过本申请实施例部分的所述方法来检测。
在另一个实施方案中，所述CD44-HABD部分由与SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO11中的任意一个核苷酸序列具有至少55％的同源性、优选65％的同源性、更优选地75％的同源性的序列所编码，最优选地是由SEQ IDNO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11中的任意一个核苷酸序列所编码，其中所述核苷酸序列是一种修饰的形式(非-HA-结合基因产物或肽)。
另一方面，本发明涉及一种抑制血管生成和/或内皮细胞增殖的药物组合物，其特征在于含有至少一种含CD44-透明质酸结合区及其类似物、重组的或突变的变体的分子，混合或同时含有至少一种药用载体或赋形剂。
所述药物组合物通过对制药领域中的技术人员来说是已知的方式来制备。所述载体或赋形剂可以是固体的、半固体的或液体的材料，该材料能够作为活性成分的载体或介质。合适的载体或赋形剂在本技术领域中是已知的。所述药物组合物可以是适于经口或非肠道施用的并且可以以片剂、胶囊、栓剂、溶液、混悬液等形式来对患者进行施用。
所述药物组合物可以进行口服，例如与一种惰性稀释剂或可食用载体一起进行口服。它们可以被包封在明胶胶囊中或被压成片剂。本发明的用于经口治疗施用的化合物可以与赋形剂进行组合并被用作片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆剂、糯米纸囊剂、咀嚼剂等。这些制剂应当含有重量百分含量至少为4％的作为活性成分的本发明化合物，但是可以根据特定的剂型进行变化，而且可以适当地是4-70％单位重量比。所述组合物所含活性成分的量高至能够得到适于施用的单位剂量形式。
片剂、丸剂、胶囊、锭剂等还可含有至少一种下列辅剂结合剂如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶，赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如海藻酸、原胶(Primogel)、玉米淀粉等，润滑剂如硬脂酸镁或Sterotex，润滑剂(glidant)如胶体二氧化硅和甜味剂如蔗糖或糖精或风味剂如薄荷、水杨酸甲酯或桔子调味料。当单位剂量形式是胶囊时，除了上述物质外它还可含有液体载体如聚乙二醇或脂肪油。其它单位剂量形式可以含有改变单位剂量形式的物理形式的其它不同物质，例如包衣。因此，片剂或丸剂可以用糖、虫胶或其它肠衣物质来包衣。糖浆剂除了含有所述活性成分外还可含有蔗糖作为甜味剂和某些防腐剂、染料和风味剂。用于这些不同组合物制剂的物质应当是药学纯的并且在所用量是无毒性的。
为了进行非肠道施用，本发明的化合物可被配制成溶液或混悬液。非肠道施用是指不通过消化道而通过某种其它途径进行注射的施用方式，如皮下、肌内、眼内、囊内、脊柱内、胸骨内、静脉内、鼻内、肺内、通过泌尿道、通过家畜的输乳管注射到器官如骨髓等中。骨髓还可以进行体外处理。这些制剂可含有至少为0.1％重量百分比的本发明活性化合物，而且还可以在约为0.1-50％(重量)的范围内变化。这种组合物所含活性成分的量高到能够达到适当的剂量。所述溶液或混悬液还可以含有至少一种下列辅剂无菌稀释剂如注射用水、盐水、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂，抗菌剂如苄醇或羟苯甲酸甲酯，抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂如乙二胺四乙酸，缓冲剂如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节涨度的物质如氯化钠或葡萄糖。非肠道制剂可以被装在安瓿、一次性注射器或多剂量的玻璃或塑料容器中。为了进行局部施用，本发明的化合物可被配制成溶液、混悬液或软膏的形式。这些制剂可含有至少为0.1％重量比的本发明活性化合物，而且还可以在约为0.1-50％重量比的范围内进行变化。这种组合物所含活性成分的量高到能够达到适当的剂量。采用对皮肤触摸、按压、按摩或加热、加温或红外线的方式来增强皮肤的渗透性从而有利于施用。Hirvonen等，NatBiotechnology 1996；141710-13记载了如何利用电场的驱动力来增强药物透过皮肤而进行传输。优选地，在微碱性pH条件下进行离子电渗疗法。
另一方面，本发明涉及一种治疗受试者癌症肿瘤或任何其它血管生成和/或内皮细胞增殖相关性疾病的方法，该方法包括施用药用剂量的含有CD44-透明质酸结合区及其类似物、重组或突变变体的分子。
受试者是指任何包括人在内的哺乳动物。人类受试者是优选的。
另一实施方案中，本发明可被用于治疗特征在于血管过度形成和/或内皮细胞增殖失控的疾病或病症。这些疾病或病症包括但不限于由糖尿病视网膜症或黄斑变性引起的成人失明或视力下降、牛皮癣和各种慢性炎症以及血管瘤。
CD44-HABD或其片段可以通过本技术领域中已知的任何重组表达或化学合成方法来获得。可以如实施例1所述，在细菌细胞中进行表达。其可被克隆到杆状病毒载体当中并在昆虫细胞中进行表达。其还可在哺乳动物细胞或任何其它表达系统中进行表达。可以将亲和标记物加到蛋白产物上，并且可以利用带有选择性标记物的亲和层析来纯化该蛋白。亲和标记物在本技术领域中是公知的，并且包括但不限于GST-标记物，His-标记物，S-标记物，T7-标记物，V5-标记物，E2-标记物，c-myc-标记物，HA-标记物，FLAG-标记物。该蛋白也可以在没有任何标记物的条件下进行表达，并且利用免疫亲和、离子交换或凝胶过滤层析或其组合方式来进行纯化。而且CD44-HABD、其片段或其类似物可以通过已知的化学合成法来获得，所述化学合成法包括但不限于固相肽合成。由所述的任何方法获得的CD44-HABD被包含在本发明中。
另一方面，本发明涉及筛选含CD44-透明质酸结合区的分子及其类似物、突变和重组变体的结合配偶体的方法，该方法包括以下步骤a)提供含CD44-透明质酸结合区或其片段的分子；b)使潜在结合配偶体与所述分子接触；和
c)测定所述分子对所述潜在结合配偶体的作用。
可行的筛选方法包括(I)a)将HABD、HABD类似物或其突变体与细胞、细胞裂解物、细胞碎片、组织、生物体、动物或生物体或动物的部分结构一起进行温育。
b)HABD结合配偶体的纯化和检测(例如通过亲和柱、凝胶电泳和利用抗体或蛋白染色或同位素的任何检测方法或其它检测HABD或与HABD连接的标记物任何方法c)通过凝胶电泳(例如2D电泳)定位、利用质谱、测序、抗体或其它鉴定手段来鉴定HABD结合配偶体。
d)测定HABD对被鉴定结合配偶体的作用或测定所述潜在结合配偶体的其它相互作用物质的体外或体内作用。
e)利用被鉴定的HABD-结合配偶体来设计细胞增殖和/或血管生成的新型抑制剂。
(II)a)以HABD作为遗传筛选DNA、cDNA、噬菌体、肽、蛋白、细胞或生物体文库的诱饵(bait)或以HABD、其类似物或突变体作为诱饵来筛选合成肽、蛋白、多糖、脂质、硫酸乙酰肝素或蛋白聚糖文库。
b)通过选择性标记来检测HABD结合配偶体。
c)通过测序、杂交、限制性分析、抗体或通过文库内的逐步排除法或通过其它鉴定手段来鉴定HABD结合配偶体。
d)测定HABD对被鉴定配偶体的作用或者测定所述潜在结合配偶体的其它相互相互作用物在体外或体内的作用。
e)利用被鉴定的HABD-结合配偶体来设计细胞增殖和/或血管生成的新型抑制剂。
而且，本发明的筛选方法可以被用于测定所述潜在结合配偶体的其它激活剂或功能阻断剂的作用。
而且，HABD-突变体或其片段还可被用于筛选。这可以提供一种更特异的寻找抗-血管生成分子的研究方法。
在一个实施方案中，所述潜在结合配偶体选自蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素、脂质、聚糖、糖苷和糖。
在另一个实施方案中，潜在结合配偶体是一种受体分子或受体分子的一部分或结合细胞表面受体分子的分子或定位在细胞表面但并非受体分子的分子。
在另一个实施方案中，所述潜在结合配偶体是胞外分子，并且定位在胞外基质、组织窦、淋巴或血管中。
另一方面，本发明涉及通过上述方法找到的含CD44-透明质酸结合区的分子的结合配偶体。该结合配偶体是促进或抑制血管生成的分子，因而成为研制新型血管生成抑制剂的潜在靶物质，该结合配偶体例如是通常产生原血管生成信号的细胞表面受体，包括可溶性血管生成因子的受体，如生长因子受体(例如VEGF-受体家族、FGF-受体家族、EGF-受体家族、PDGF-受体家族)，胞外基质受体(例如整合蛋白、多配体聚糖、蛋白聚糖)，细胞-细胞粘附受体(例如Cadherins、Ig-类超家族、选择蛋白)。该受体将原-血管生成信号转入内皮细胞或阻断或促进内皮细胞中的抗血管生成信号。该信号受体的激活通过与胞外配体结合或通过利用胞内信号事件而使受体的胞质区域定向活化作用来实现。或者，细胞表面上的受体起着将其配体转运和定位到胞内受体(例如核受体)上的载体的作用，两者都是潜在结合配偶体的实例，所述潜在结合配偶体可以通过要求保护的筛选方法来进行鉴定并且可以被用作抗-血管生成靶物质。
在另一方面，本发明涉及用于实施上述方法的试剂盒，该试剂盒在各个小瓶中装有含CD44-透明质酸结合区、其类似物或突变体或片段以及潜在结合配偶体或其片段的分子或遗传信息。
另一方面，本发明涉及含CD44-透明质酸结合区及其类似物、重组和突变的变体或其片段的分子用于靶向内皮细胞的用途。由于本发明的CD44-HABD-分子显示出了与内皮细胞结合的能力，所以其可被用于靶向这种细胞。
在一个实施方案中，所述分子进一步含有具有化疗和基因疗法性能的部分。因此，本发明的修饰的变体形式的CD44-HABD-分子可以被用作针对内皮细胞的抗肿瘤药物。正如本领域的技术人员所能理解的，本发明的CD44-HABD分子除抗肿瘤以外，还具有其它性能，诸如抗-内皮细胞增殖和/或迁移、原-细胞编程性死亡或破坏内皮细胞或其它血管细胞的基本功能。然而，具有抗肿瘤特性的部分是一个优选的实施方案。
“具有化疗特性”是指具有这种特性的分子具有抑制其靶向细胞的生长和/或杀死其靶向细胞的能力，该能力通过利用以下方法来测定细胞或组织的体外组织培养，体外酶活性如激酶、磷酸酶、糖基化作用、乙酰化作用、蛋白水解作用、接头连接或任何其它酶活性的筛选，质子转移、离子泵功能的体外或体内筛选和/或细胞生长、细胞编程性死亡、或其它细胞死亡方式、肿瘤发展、转移、侵袭、血管生成和/或组织体内稳态的体内或体外筛选。
具有化疗和/或基因疗法特性的部分可以例如选自对于本领域的技术人员来说已知的用于基因疗法、各种化疗的各种病毒、与habd、其突变体或片段偶联的裸DNA以及其它DNA-载体，包括但不限于脂质、肽和蛋白质。
例如Arap等(science，1998，279377-380)，Ellerby等(NatureMedicine，1999，5；91032-1038)和Trepel等(Human Gene Therapy，2000，111971-1981)分别公开了用于靶向内皮细胞的阿霉素分子(cytostatica)的偶联，细胞编程性死亡诱导肽的偶联和病毒的偶联。这些文件被引入本文作为参考。
病毒偶联是内皮-靶向分子如何被用于基因治疗的实例。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及含CD-44透明质酸结合区及其类似物、重组和突变变体或片段和具有化疗和/或基因治疗特性的部分的分子。
在另一个实施方案中，本发明涉及与具有上述化疗特性的部分相偶联而用于医药用途的本发明的分子。
本发明将通过下列实施例得到描述，而这些实施例只是说明目的的，无论如何不会限制本发明的保护范围。
实施例实施例1-以GST融合蛋白形式的野生型和突变型人CD44 HA结合区的构建和纯化人CD44标准同种型cDNA[Stamenkovic等，EMBO J 1991；10343-8]被用于PCR扩增具有21-132位氨基酸的透明质酸结合区，采用了寡核苷酸5′CGCGAATTCCAGATCGATTTGAATATG 3′(SEQ ID NO13)(含内部EcoR1切割位点)和5′CGCGAGCTCCTTCTAACATGTAGTCAG 3′(SEQ IDNO14)(含内部SacI切割点)。得到的PCR扩增产物被克隆到pGEX-KG载体[Guan和Dixon，Anal Biochem1991；192262-7]中。按照厂商提供的方案通过位点定向诱变进行CD44 HABD透明质酸非结合突变体的制备(Quickchange，Stratagene)。诱变寡配对体(oligo pairs)R41A(5′GAGAAAAATGGTGCCTACAGCATCTCTCGG-3′(SEQ ID NO15)，5′AGATGCTGTAGGCACCATTTTTCTCCACG-3′(SEQ ID NO16))和R78SY79S(5′GACCTGCAGCTCTGGGTTCATAG 3′(SEQ ID NO17)，5′ATGAACCCAGAGCTGCAGGTCTC 3′(SEQ ID NO18))被用于将R41A和R78S，Y79S突变分别引进野生型CD44 HABD当中。
利用得自Ambion的RNAqueous试剂盒(Austin TX)并按照出厂说明书来从每种组织中提纯小鸡CAM和狗肝RNA。利用特定于得自各个物种的CD44的第63-81位和第359-330位核苷酸的引物通过RT-PCR获得编码小鸡和狗CD44-HABD的cDNA。所述引物对如下所述用于小鸡的5′-CAGAGACACAATTCAATATA-3′(SEQ ID NO19)，5′-TTGGCTCACATGCTTTG-3′(SEQ ID NO20)和用于狗的5′-CGCAGATCGATTTGAACATA-3′(SEQ ID NO21)，5′-CCGATGTACAATCCTCTTC-3′(SEQ ID NO22)。将与SEQ ID NO 3(狗)和SEQ ID NO 5(小鸡)对应的cDNA克隆到细菌表达载体pET15b(Novagen)中，该表达载体在E.Coli中表达与His-标记物融合的蛋白。在OD600＝0.7的条件下于27℃下利用1mM IPTG来诱导大肠杆菌BL21(E.coli BL21)菌株中野生型和R41A，R78S，Y79S突变体GST-CD44 HABD的表达，并利用谷胱甘肽琼脂糖珠子(Sigma)按照厂商提供的方案进行纯化。通过考马斯亮兰染色SDS聚丙烯酰胺电泳分离的产物测得所得的蛋白基本上是纯的(图1)。利用HICAM树脂(Sigma)按照厂商提供的方案纯化小鸡和狗CD44 HABD。通过考马斯亮兰染色SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测得所得的蛋白基本上是纯的而不含污染物。
实施例2-重组的野生型而非突变的CD44HABD能够以剂量依赖方式与透明质酸(HA)结合并且能够抑制人主动脉内皮细胞(HAEC)向HA的趋触性(haptotaxis)用1mg ml-1高分子量的透明质酸(Sigma)的PBS在室温(RT)下过夜包被Maxisorp(Nunc)平板。用PBS冲洗各孔并用2％BSA在RT下封闭2小时。用PBS稀释的纯化蛋白被加到各孔中并在RT下温育1小时。用PBS-T冲洗三次后，将小鼠抗-GST抗体B-14(Santa CruzBiotechnology)在RT下温育1小时，进一步冲洗，并且在RT下与HRP-缀合的山羊抗小鼠的二抗(Dako)一起温育1小时。HA结合力通过利用OPD产色底物(Sigma)显色并在450nm下测吸光度。如图2A所示，野生型而非突变型CD44融合蛋白以浓度依赖方式与HA结合。
人主动脉、内皮细胞(HAEC)得自Clonetics并用添加了10％FCS，2μg ml-1小鼠EGF(Sigma)和50ug ml-1庆大霉素的EBM-2培养基(Clonetics)进行培养。在Transwell迁移室(孔径8mm；Costar)中进行细胞迁移分析。较低的隔室含有1μg ml-1高分子量的透明质酸(Sigma)。将CD44HABD、CD44HABDR41A或GST(10μg ml-1)加到较低隔室内。为了进行抗体抑制分析，将细胞与10μgml-1抗CD44mAb A3(Guo等，1993，1994)预先温育30分钟。主动脉内皮细胞被加到Transwell室的较高隔室当中并使其向膜下侧迁移2.5小时。利用0.5％的结晶紫对迁移细胞固定并染色。冲洗后，将膜干燥并用10％的乙酸乙酯洗脱结合染料。通过分光光度法在600nm下读取回收洗脱液的光密度。如图2B所示的结果表明野生型CD44HABD而不是各种非-HA-结合的R41A突变体抑制人主动脉内皮细胞向HA的迁移，而迁移还受到特异阻断CD44与HA结合的抗体的抑制(A3)。
实施例3-重组CD44融合蛋白阻断小鸡CAM中的非HA-结合依赖型的血管生成按照[Brooks等，J Clin Invest 1995；961815-22]中记载的方法制备10-天龄的小鸡胚胎。为了进行血管生成分析，将用100ngml-1VEGF(Sigma)、100ng ml-1TGFa(Sigma)或1μg ml-1bFGF(GibcoLifetech)浸泡的滤片放置在CAM上，接下来每天异位(ectopical)添加10μg的CD44HABD、CD44HABDR41AR78SY79S或GST和作为对照的PBS(每组n＝6)。72小时后，将滤片与周围的CAM组织分开并利用解剖显微镜进行血管生成的定量分析。血管生成通过所述滤片正下方的CAM区域内的血管分支点数来进行评估。
GST-CD44HABD和GST-CD44HABDR41AR78SY79S而非GST的处理彻底消除了VEGF、bFGF或TGFα(图3a-d)的血管生成作用，表明可溶性CD44HABD阻断了由三种不同血管生成因子诱导的血管生成。由于HA-非结合突变体在抑制血管生成的过程中效力相同，所以该抑制作用不依赖于HA的结合。
实施例4-重组的CD44 HABD蛋白阻断小鸡CAM上的不同肿瘤细胞系的生长SMMU-1人黑素瘤细胞最初分离自原发肿瘤并且是CD44-阴性的(Guo等，Cancer Res 1994；541561-5)。利用含10％胎牛血清和50mg ml-1ginomycin的RPMI1640培养HepG2人肝细胞癌。利用含10％胎牛血清和50μg ml-1庆大霉素的DMEM培养SMMU-1-细胞和M21细胞。通过胰蛋白酶消化从平板上将所述细胞分离下来并将一百万个细胞接种在10天龄的小鸡胚胎CAMS上。每两天利用10μg得自人或鸡的融合蛋白(在100μl的PBS中)或只利用载体对肿瘤进行处理。7天后切除肿瘤并测定湿重。如图4所示，所有测试的肿瘤细胞系的肿瘤生长得到明显抑制。
实施例5-重组CD44融合蛋白抑制裸鼠内肿瘤的生长1×106SMMU-1细胞被皮下注射到6-周龄雌性BALB/cABom裸鼠(M & B)的背部中。第二天在肿瘤附近给小鼠皮下注射了含在100μlPBS中的2.4mg的GST-CD44HABD，GST-CD44HABDR41AR78SY79S或GST/kg体重。每两天重复一次处理并且两周后杀死动物，剥离出肿瘤、进行测重并准备用于组织分析。与GST-处理的对照相比，采用CD44HABD或非-HA-结合突变体CD44HABDR41AR78SY79S对小鼠进行的皮下处理明显减缓了肿瘤的生长(图5a，c，所有时间点的P＜0.05)。在第16天杀死小鼠时，CD44HABD和CD44HABDR41AR78SY79S处理的小鼠的肿瘤重量比GST处理的小鼠平均减小了45％(分别是47％和43％)(图5b)。
为了进行免疫组化分析，从福尔马林固定和石蜡包埋的大小类似的SMMU-1肿瘤上切下4μm厚的组织切片。利用山羊抗小鼠PECAM-1(Santa Cruz Biotech)的一抗抗体进行组织切片上的血管染色，并且利用缀合了碱性磷酸酯酶的抗-山羊二抗测定一抗的结合，利用Vectastain试剂盒(Vector Laboratories)进行显色。通过对PECAM-1阳性血管染色而进行的免疫组织化学分析表明CD44HABD和CD44HABDR41AR78SY79处理的肿瘤在肿瘤边界形成的血管较少(图5d)。实施例6-CD44-HABD融合蛋白也抑制裸鼠体内的人胰腺癌的生长将1×106BxPC-3(ATCC，Manassas，Virginia)细胞皮下注入6-8周龄雌性BALB/cABom裸鼠(M & B，Ry，Denmark)的背部。当出现肿块时，开始在小鼠的肿瘤附近皮下注射20μg(BxPC-3)或50μg(SMMU-1)的GST-CD44HABD，GS-CD44HABDR41AR78SY79S或含在100μl PBS中的GST。所述处理每两天重复一次，并且当大多数对照肿瘤的直径达到25mm时杀死动物。肿瘤体积利用公式(宽度2×L长度)×0.52来计算。在实验结束时，剥离出肿瘤，分析重量并准备用于组织分析。BxPC-3细胞开始缓慢长出肿瘤。GST-处理的对照在第52天杀死小鼠时平均体重达到0.267±0.042g(图2d-g)。用GST-CD44HABD或GS-CD44HABDR41AR78SY79S处理小鼠后明显地抑制了BxPC-3肿瘤的生长，与对照相比，肿瘤的平均重量分别被降低了60％(0.108±0.028g)和70％(0.085±0.017g)(P＜0.05；n＝6)。
实施例7-重组CD44HABD特异性抑制内皮细胞的体外增殖并且阻断了内皮细胞周期为了进行细胞周期分析，在有30μg/ml GST-CD44HABD、GST-CD44HABDR41AAR78SY79S、GST或PBS存在的条件下将指数生长期的初级人血管内皮细胞(HUVEC)、牛肺动脉内皮(CPAE)细胞、初级人成纤维细胞(NHDF)、MCF-7或SMMU1细胞培养48小时。用30μg/ml溴脱氧尿苷(BrdU)将细胞刺激60分钟，回收细胞并用冰冷乙醇进行固定。用1∶50稀释的抗-BrdU mAb G3G4(Developmental Studies HybridomaBank，University of Iowa，Iowa)、接着用缀合了异硫氰酸荧光素-的山羊抗小鼠的抗体(Jackson Immunoresearch，West Grove，Pennsylvania)结合、同时用碘化丙锭染色来染色细胞上的BrdU。然后采用FACScan流式血细胞计数仪(Becton Dickinson，FranklinLakes，New Jersey)分析细胞周期的分布。
与对照处理细胞(25％；图7D)相比，接触了GST-CD44HABD或GST-CD44HABDR41AR78SY79S的人血管内皮细胞和牛肺动脉内皮细胞明显降低了S-期中的细胞量(分别为5％和6％)。而且，CD44HABD对初级人成纤维细胞(NHDF)或任何测试的肿瘤细胞的细胞周期都没有产生明显的作用，表明CD44HABD对细胞周期的抑制是内皮细胞特异性的。
实施例8-CD44HABD的中心结构域对于其抑制内皮细胞增殖的活性是重要的为了着手分析CD44HABD中对抑制内皮系增殖的重要区域，利用PCR制备了几种CD44的缺失突变体。三联突变体CD44HABD被用作模板。CD44HABD的特定寡聚核苷酸与用于PCR扩增的载体-特异性引物一起使用，并将产物进行连接以便分别得到产生CD44HABD的aa21-60、21-100或93-132的载体。wt和3mut CD44HABD以及缺失突变体21-100、21-60和93-130的序列如图8所示，所述序列被列为SEQID No.23(21-100)，SEQ ID No.24(21-60)和SEQ ID No.25(93-132)。与内皮细胞增殖有关的CD44HABD中心区域的序列被表示为SEQ ID No.26。所有重组蛋白产生于细菌体内并按照实施例1记载的方法进行纯化。
在含10％血清的培养基中采用所示蛋白(终浓度分别为15μg/ml和30μg/ml)将指数生长期的牛肺内皮细胞(CPAE)处理48小时。细胞增殖通过显微照相术(图8B)或通过MTT染色(Sigma)和分光光度法(图8C)来测定。如图8C所示，CD44HABD aa 21-100而非21-60或93-130。因此，抑制内皮细胞增殖的重要序列含有例如定位在CD44HABD的aa61-100区域的序列(SEQ ID No.26)。然而，也不能排除侧翼序列在完整CD44 HABD中的贡献。
序列表<110>Strmblad，StaffanPll，TaaviKogerman，Priit<120>新药<130>cd44habd<150>SE0102823-2<151>2001-08-24<150>US 60/314,971<151>2001-08-24<160>26<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>336<212>DNA<213>人类(homo sapiens)<400>1cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 60cgctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg120cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg180ttcatagaag ggcatgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac240aacacagggg tgtacatcct cacatacaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat300gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtc 336<210>2<211>112<212>PRT<213>人类<400>2Gln Ile Asp Leu Asn Met Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys35 40 45Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly Phe Ile Glu Gly50 55 60His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn65 70 75 80
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<213>红原鸡(gallus gallus)<400>5cagagacaca attcaatata acttgcagat atggaggagt gtttcatgtg gagaaaaatg 60gtcgctacag tctcacacga gctgaagcaa ttgagctctg tagagctctc aatagtacct120tggcaacact ggagcaattt gaaagagctc atgcacttgg atttgaaacg tgcaggtatg180gttttatagt ggggcatatt gttatcccac gaatcaatcc atatcatctt tgtgcagcaa240atcatacagg catttacaaa ctttcagcaa atacaactgg ccggtatgat gcatattgtt300acaatgcaac agaaacgagg agcaaagcat gtgagccaa 339<210>6<211>113<212>PRT<213>红原鸡<400>6Glu Thr Gln Phe Asn Ile Thr Cys Arg Tyr Gly Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Leu Thr Arg Ala Glu Ala Ile Glu Leu20 25 30Cys Arg Ala Leu Asn Ser Thr Leu Ala Thr Leu Val Gln Phe Glu Arg35 40 45Ala His Ala Leu Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly Phe Ile Val Gly50 55 60His Ile Val Ile Pro Arg Ile Asn Pro Tyr His Leu Cys Ala Ala Asn65 70 75 80His Thr Gly Ile Tyr Lys Leu Ser Ala Asn Thr Thr Gly Arg Tyr Asp85 90 95Ala Tyr Cys Tyr Asn Ala Thr Glu Thr Arg Ser Lys Ala Cys Glu Pro100 105 110Ile<210>7<211>336<212>DNA<213>人类<400>7cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 60gcctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg120cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg180
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<400>10Gln Ile Asp Leu Asn Met Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys35 40 45Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Ser Ser Gly Phe Ile Glu Gly50 55 60His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn65 70 75 80Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser Gln Tyr Asp Thr85 90 95Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp Cys Thr Ser Val100 105 110<210>11<211>336<212>DNA<213>人类<400>11cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 60gcctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg120cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg cagctctggg180ttcatagaag ggcatgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac240aacacagggg tgtacatcct cacatacaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat300gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtc 336<210>12<211>112<212>PRT<213>人类<400>12Gln Ile Asp Leu Asn Met Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Ala Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys
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<220>
<223>RT-PCR-引物<400>22ccgatgtaca atcctcttc 19<210>23<211>80<212>PRT<213>人工<220>
<223>缺失突变体<400>23Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys35 40 45Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Ser Ser Gly Phe Ile Glu Gly50 55 60His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn65 70 75 80<210>24<211>40<212>PRT<213>人工<220>
<223>缺失突变体<400>24Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Ala Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu35 40<210>25<211>38<212>PRT<213>人工<220>
<223>缺失突变体
<400>25Ser Ile Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Tyr Asn1 5 10 15Thr Ser Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu20 25 30Glu Asp Cys Thr Ser Val35<210>26<211>40<212>PRT<213>人工<220>
<223>缺失突变体<400>26Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr1 5 10 15Cys Ser Ser Gly Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His20 25 30Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn35 40
权利要求
1.含CD44-透明质酸结合区(CD44-HABD)的非-HA-结合变体的分子及其类似物、重组的和突变的变体或其片段用于生产治疗与血管生成和/或内皮细胞增殖抑制相关病症的药物的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中CD44-HABD含有至少一个突变，从而使其成为非-HA-结合的。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述突变选自F34A、F34Y、K38R、K38S、R41A、Y42F、Y42S、R46S、E48S、K54S、Q65S、K68S、R78K、R78S、Y79F、Y79S、N100A、N100R、N101S、Y105F、Y105S、S112R、Y114F、F119A和F119Y，优选地选自R41A、R78S和Y79S。
4.如权利要求1-3中所述的用途，其中CD44-透明质酸结合区与序列SEQ ID NO2具有至少55％、更优选地至少65％、最优选地至少75％的同源性。
5.如权利要求1-4中所述的用途，其中所述重组变体是含有CD44-HABD部分和GST-部分的融合蛋白，其中CD44-HABD-部分为非-HA-结合形式。
6.上述权利要求中任一项所述的用途，其中含CD44-透明质酸结合区的非-HA-结合变体的分子选自人CD44-HABD(SEQ ID NO2)，狗CD44-HABD(SEQ ID NO4)，小鸡CD44-HABD(SEQ ID NO6)，人CD44-HABD-R41A(SEQ ID NO8)，人CD44-HABD-R78SY79S(SEQ IDNO10)，CD44-HABD-R41AR78SY79S(SEQ ID NO12)，CD44-HABD(21-100)(SEQ ID NO23)和CD44-HABD(61-100)(SEQ IDNO26)，上述序列进一步含有至少一个修饰，从而使它们成为非-HA-结合性质的。
7.上述权利要求中任一项所述的用途，其中所述分子源自人、狗、小鸡、灵长目动物、大鼠或小鼠。
8.上述权利要求中任一项所述的用途，其中待治疗的病症选自引起失明的眼疾或视力损伤如黄斑变性、糖尿病视网膜病和视网膜低氧症，慢性炎症如类风湿关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、再狭窄，以及癌生长和转移，以及所有类型的癌症和肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、脑癌、卵巢癌、睾丸癌、骨癌、上皮癌、内皮癌、胰腺癌、肾癌、肌肉癌、肾上腺癌、肠癌、内分泌腺癌、口腔癌、头癌和颈癌或其它实体组织源癌症或任何形式的白血病以及血管瘤。
9.含CD44-透明质酸结合区的变体的分子及其类似物、重组的和突变的变体或其片段用于靶向内皮细胞的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述分子还含有具有化疗和/或基因治疗特性的部分。
11.含有CD44-HABD部分、GST-部分和/或具有化疗特性的部分的重组分子，其中所述CD44-HABD部分进行了选自以下突变中的至少一种突变F34A，F34Y，K38R，K38S，R41A，Y42F，Y42S，R46S，E48S，K54S，Q65S，K68S，R78K，R78S，Y79F，Y79S，N100A，N100R，N101S，Y105F，Y105S，S112R，Y114F，F119A，F119Y，优选地选自R41A、R78S和Y79S。
12.如权利要求11所述的重组分子，其中CD44-HABD部分被定义为SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO23、SEQ ID NO26中的任一个氨基酸序列的修饰的变体。
13.如权利要求11或12所述的重组分子，其中CD44-HABD部分由与SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11中的任意一个核苷酸序列具有至少55％的同源性、优选65％的同源性、更优选地75％的同源性的序列所编码，最优选地是由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11中的任意一个核苷酸序列所编码，其中所述核苷酸序列是一种修饰的形式。
14.如权利要求11-13中任一项所述的重组分子，用于医药用途。
15.含有至少一种权利要求1-14中任一项所述分子的药物组合物，混合或结合至少一种药用载体或赋形剂。
16.用于治疗受试者的肿瘤或其它相关疾病的方法，包括施用药学剂量的权利要求1-14中任一项所述的分子。
17.筛选权利要求1-14中任一项所述分子的结合配偶体的方法，该方法包括以下步骤a)提供含CD44-透明质酸结合区的分子；b)使潜在结合配偶体与所述分子接触；和c)测定所述分子对所述潜在结合配偶体的作用。
18.如权利要求17所述的方法，其中潜在结合配偶体选自蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素、脂质、聚糖、糖苷和糖。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中潜在结合配偶体是受体分子、受体分子的一部分、与细胞表面受体分子结合的分子或定位在细胞表面而不是受体分子的分子。
20.如权利要求1-14中任一项所述分子的结合配偶体，是由权利要求17-19中任一项所述方法发现的。
21.用于实施权利要求17-19中任一项所述方法的试剂盒，该试剂盒包含独立小瓶中的权利要求1-14中任一项所述的分子和权利要求20的潜在结合配偶体。
全文摘要
CD44，透明质酸的受体，在细胞生理学、细胞迁移和肿瘤转移方面具有复杂的功能。本发明人已经发现人CD44受体在小鼠纤维肉瘤细胞中过表达抑制小鼠体内的皮下肿瘤生长[Kogerman等，Oncogene 1997；151407－16；Kogerman等，Clin Exp Metastasis 1998；1683－93]。其中表明CD44对肿瘤生长的抑制作用是由于阻断血管的生成而引起的。而且，本发明人还发现了可溶性重组CD44透明质酸结合区(CD44HABD)抑制小鸡和小鼠体内的血管生成，因而抑制人的各种来源的肿瘤生长。CD44－HABD的抗血管生成作用不依赖于与透明质酸(HA)的结合，这是由于CD44HABD的非－HA－结合的突变体仍然保留了抗血管生成特性。本发明公开了建立在靶向血管细胞表面受体基础上的可溶性CD44重组蛋白作为新型血管生成抑制剂。还公开了一种利用重组CD44蛋白及其类似物阻断血管生成和人体肿瘤治疗的方法。本发明的另一个实施方案提供了一种利用CD44重组蛋白及其类似物筛选新型药物靶物的方法。
文档编号C07K19/00GK1561223SQ02819275
公开日2005年1月5日 申请日期2002年8月26日 优先权日2001年8月24日
发明者斯塔凡·斯特伦布拉德, 普里特·科格曼, 塔维·帕尔 申请人:斯塔凡·斯特伦布拉德, 普里特·科格曼, 塔维·帕尔