专利名称：活化或抑制类Toll受体9的试剂的制作方法
技术领域：
本发明是关于对引起与CpG基序相互作用的类Toll受体(TLR9)上的抗原决定簇的识别。
现有技术有机体的免疫包括其所有用于对抗外界环境试剂(例如微生物、食物、化学品、药物或花粉)的保护机制。在脊椎动物中，免疫可为先天性或获得性(适应性)两种。
先天性免疫由有机体出生时所带成分授予。这些成分包括物理屏障(例如皮肤和粘膜(mucosal membranes))、内在成分(例如发烧和咳嗽)、多种化学成分(例如干扰素、血清蛋白，如溶解酵素和聚胺)及细胞成分(如巨噬细胞、树突细胞和粒细胞)。
已显示特定细菌的DNA(而不是脊椎动物的DNA)可以活化有机体的先天免疫性(Tokunaga，T.等人，J.Natl.Cancer Institute72955-962(1984)；Messina，J.P.等人，J.Immunol 1471759-1764(1991))。先天免疫细胞(例如巨噬细胞和树突状细胞)严重影响T和B淋巴细胞的适应性免疫反应这一事实如今也变得清楚。先天免疫细胞在确定T-细胞是否彻底反应和诱导T-细胞反应主要是Th1还是Th2反应的抗原提呈方面具有重要作用(Aderem，A.等人，Nature406782-787(2000))。对任何抗原的免疫反应可为Th1和Th2两者之一，且每个都诱导不同的细胞激素、抗体和细胞反应。
在研究这种对细菌DNA的先天免疫反应中，我们已确认识别细菌DNA为“外来”和诱发对抗它的增强免疫反应可能源于DNA中未甲基化的“CG”二核苷酸序列(命名为“CpG”序列)段。未甲基化的CpG二核苷酸在所有细菌基因组以及病毒和无脊椎真核生物基因组中十分丰富(Bird，A.P.，Nuc.Acids Res.81499-1504(1980)；Burge，C，等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 891358-1362(1992))。在脊椎动物基因组中，CpG基序仅能以低频率发现，且所发现的脊椎动物CpG基序中约70％为甲基化Id。如果基频是随机的，那么如所期望的，仅约四分之一预测数目的CG序列存在于脊椎动物中(Bird，A.P.，Trendsin Genetics 3342-347(1987))。与细菌CG相反，人类CG序列最为频繁的是C在前或G在后。这些人类CG序列不是对免疫系统无效，就是甚至可能引起对免疫反应的抑制。(Krieg，A.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9512631-12636(1998))。
细菌CpG-DNA是有效的类Th1辅助剂，触发强偏Th1抗体反应，且伴随着抑制Th2反应(Davis，H.L.等人，J.Immunol.160870-876(1998))。CpG-DNA也是有效的单B-细胞分裂素，其能驱动超过95％的B-细胞进入活化状态(Krieg，A.M.等人，Nature 374546-549(1995))。这些先天免疫反应可通过合成的未甲基化含CpG的寡脱氧核糖核酸(CpG-ODN)来模拟。由细菌CpG序列或CpG-ODN活化的B-细胞表现出表面II级的主要组织相容性复合体(MHC)分子和伴同刺激分子B7-1及B7-2的增强表达(Krieg，A.M.，在Delivery Strategiesfor Antisense Oligonucleotide Therapeutics中，Ed.Akhtar，S.，CRC Press，Inc.，第177-190页；Davis，H.L.等人，J.Immunol.160870-876(1998))。这提出了由CG二核苷酸组成的CpG“基序”可直接增强B-细胞抗原表达功能的这一可能性。尽管CpG基序在T-细胞上的效果还不太清楚，但是由T-细胞受体激励的高度纯化T-细胞表现出对CpG的协同增殖反应，指示一通过其CpG可提升抗原-特效T-细胞反应的机制(Bendigs，S.等人，Eur.J.Immunol.291209-1218(1999))。
CpG-ODN强烈刺激NK细胞溶解酶活性和IFN-γ产量(Tokunaga，T等人，J.Natl.Cancer Institute 72955-962(1984)；Yamamoto S.，J.Immunol.1484072-4076(1992))。抗原表达细胞，例如单核细胞和树突状细胞，通过CpG-ODN而被活化，结果产生Th1细胞激素(Jakob，T等人，J.Immunol.1613042-3049(1998))，以及产生二级MHC分子和协同刺激B7-1和B7-2分子(Stacy，K.J.等人，J.Immunol.1572116-2122(1996)；Sparwasser，T.等人，Eur.J.Immunol.282045-2054(1998))。
因此，CpG-ODN是有效的各种抗原依赖和非抗原依赖免疫反应的诱导剂和激励剂，且可被用于研制对抗癌症和传染病的疫苗。由于CpG-ODN活化NK细胞，因此它们可有效用于增强抗肿瘤抗体的抗体依赖细胞毒性(ADCC)。CpG-ODN可将T细胞反应从Th2型反应转变为Th1型反应，这可导致过敏反应的下调整(down-modulating)(Kline，J.N.等人，J.Immunol.1602555-2559(1998)；Sur，S.等人，J.Immunol.1625575-5582(1999)；Shirota，H.等人，J.Immunol.1645575-5582(2000)；Jahn-Schmid，B.等人，J.Allergy Clin.Immunol.1041015-1023(1999)；Broide，D.H.等人，J.Clin.Immunol.21175-182(2001))。
有趣的是，CpG-DNA驱动的先天免疫反应可通过将CpG基序变为GC二核苷酸或通过甲基化胞核嘧啶而被消除。这种清楚的结构功能关系暗示了专用于未甲基化CpG基序的受体的存在。最近，在小鼠基因剔除研究中，已经展示了CpG功能完全依赖于最近发现的类Toll受体9(TLR9)(Hemmi，H.等人，Nature 408740-745(2000))。基于活体外研究，认为在于核内体中将CpG-DNA内在化之后CpG基序与TLR9相互作用(Wagner，H.，Immunity 14499-502(2001))。
TLR家族包括种系遗传保存的膜贯通蛋白质，其可引起先天免疫性且对于微生物识别是重要的。这些受体的细胞外区域包含多富亮氨酸重复(LRR)(multiple leucine-rich repeat)和具有与ILlR的细胞质域相同的羧基终端富半胱氨酸域。第一个TLR，即dToll，在果蝇中发现，且对于真菌感染的先天免疫反应具有重要作用(Anderson，K.V.，Curr.Opin.Immunol.1213-19(2000)；Means，T.K.，Life Sci.68241-258(2000))。随后在其它有机体中发现其它TLR成员。TLR2引起对肽聚糖(PGN)的免疫反应而TLR4引起对脂多糖(LPS)的免疫反应。人类TLR9(PDB入藏登记号AAF78037，识别序列号1)最近被克隆(Chuang，T-H等人，Eur.Cytokine Netw.11372-378(2000))。在TLR9上，未甲基化CpG的精确结合位置以前尚未被定义。
发明内容
本发明包括与TLR9上的肽片段(peptidic segment)结合并模拟CpG基序效应的分子。CpG模拟剂包括但不局限于抗体、小分子化合物、肽、肽模拟及核酸。此外，本发明包括含有与TLR9上的肽片段(peptidic segment)结合并模拟CpG基序效应的分子的组合物，其适合给予于需要治疗的病人，视情况可与(例如)赋形剂、稀释剂或载剂组合使用。
此外，本发明包括那些与TLR9的CXXC基序上的255Cys-Arg-Arg258Cys(如CRRC)或265Cys-Met-GIu268Cys(如CMEC)结合的分子。
本发明还包括使分子结合于TLR9并模拟CpG基序效应的方法。这些方法包括产生对TLR9的CpG抗原决定簇的单克隆抗体。
此外，本发明包括治疗由TLR-9所引起的疾病的方法，该方法包括给予CpG模拟剂，这些模拟剂包括但不局限于抗体、小分子化合物、肽、肽模拟及核酸。核酸包括寡核苷酸。这些分子可能用于治疗、预防或改善如肿瘤、癌症或病原传染病(如由病毒、真菌、细菌或寄生虫引起的病原传染病)等疾病。
本发明还包括适合向患过敏性疾病的病人给予的组合物，这些组合物包括与TLR9结合并模拟CpG功能的分子，视情况可与(例如)赋形剂、稀释剂或载剂组合使用。
本发明包括通过诱导Th-1型反应来调节免疫反应的方法，其包括给予结合于TLR9并模拟CpG功能的分子。这些分子也将寄主细胞反应由Th-2型向Th-1型转变。因此，给予本发明的结合于TLR9的分子可能避免由Th2引起的、诱导免疫的过敏性反应的风险，使得该方法可运用于免疫疗法和治疗哮喘中。本发明的分子可与特殊过敏源组合给予。
另外，本发明包括给予结合于TLR9并模拟CpG功能的分子，作为如小鼠或人类等哺乳动物中的人造辅助剂。本发明包括通过给予疫苗抗原或编码于DNA疫苗的抗原及与TLR9上的肽片段结合并模拟CpG基序效应的分子或组合物来对被试者接种疫苗的方法。
本发明还包括免疫原，该免疫原包含从含有CRRC和/或CMEC的TLR9衍生的合成肽、重组体蛋白质、或编码肽或重组体蛋白质的DNA，这些物质诱导了结合于TLR9的抗原决定簇、负责结合CpG(尤其在CRRC和/或CMEC)以及活化受体功能的抗体的产生。这些免疫原可被给予于被试者以便对癌症或过敏反应免疫。
本发明的另一实施例包括结合于TLR9并抑制或对抗受体功能的分子。本发明包括对抗CpG效应的分子。
本发明的另一实施例包括结合于TLR9以用于治疗的抗体或其片断的基因构建物。在引入合适的寄主的基础上，TLR9抗体基因构建物将引导能够结合于TLR9并模拟CpG功能或抑制TLR9受体功能两者之一的抗体(或其片断)的合成。欲表达之基因构建物也可编码该负责与CpG相互作用的TLR9的抗原决定簇。这些构建物包括用于全部抗体分子的基因及其修改或衍生形式，包括类似于Fab、单链Fv(scFv)及F(ab’)2的免疫球蛋白片断。基因构建物可通过常规基因治疗技术而被引入主体，这些技术包括裸露DNA、并入脂质体的DNA、接合脂质或脂质衍生物的DNA、或通过合适的质体或重组体病毒载体。
图1显示了人类类Toll受体9的cDNA序列。
图2显示了人类类Toll受体9的蛋白质序列。
具体实施例方式
据报道，未甲基化CpG与肽基序CXXC(两个半胱氨酸残基与两个氨基酸侧翼连接)结合(Voo，K.S.等人，Mol.Cell.Biol.202108-2121(2000))。基于该信息，我们检测了人类TLR9的氨基酸序列。我们鉴定了在255Cys-Arg-Arg-258Cys(如CRRC)及265Cys-Met-Glu-268Cys(如CMEC)上的两个CXXC基序。我们现在提出拥有这两种CXXC基序的肽片段(peptide segment)负责与TLR9的CpG相互作用，且因此对于由CpG引起的功能很重要。因此，本发明是关于对负责与CpG基序相互作用的TLR9上的抗原决定簇的鉴定。
本发明也包括对结合于TLR9的肽片段(peptidic segment)上并模拟CpG效应的分子的产生和利用。CpG模拟剂可以是但不局限于抗体、小分子化合物、肽、肽模拟及核酸。这些新型试剂可被用于人类以治疗癌症和传染性疾病，如那些由类似利什曼原虫、李司忒氏菌属、弗朗西斯菌属、血吸虫属、埃博拉病毒、炭疽热病毒以及疟疾等细胞内病菌引起的疾病。此外，这些分子可被用于治疗过敏性疾病，例如但不局限于过敏性鼻炎和哮喘。这些新型试剂可被或者单独使用，或者组合使用或当给予人类时用作联合剂(conjugate)。
模拟CpG功能的对抗TLR9的单克隆抗体可通过以含有从人类TLR9衍生的肽片段的合成肽或重组体蛋白质来使如啮齿动物等的动物获得免疫而制得，其中TLR9包括如，CRRC或CMEC或两者。或者，免疫原可以是编码从人类TLR9衍生的肽片段的DNA。本发明的抗体分子包括多克隆或单克隆的抗体、单链抗体，及其功能性片断。单克隆抗体包括嵌合抗体或人源化抗体、人类抗体或DelmmunisedTM抗体。这些抗体的片断包括Fv、Fab、F(ab’)2、保留母体抗体抗原结合功能的单链或双链Fv片断。该抗体可通过任何此项技术中已知之重组体方法制得且可被活体外或活体内制得。单链抗体(“ScFv”)及其构建物方法描述于美国专利第4,946,778号中。
产生抗体的技术如下单克隆抗体单克隆抗体可采用由Kohler等人首次提出(Nature，256495(1975))的杂交瘤方法制得，或可通过重组体DNA方法(美国专利第4,816,567号)制得。
在杂交瘤方法中，一只小鼠或其它适当主体动物如上文所述被免疫以引出淋巴细胞，这些淋巴细胞产生或有可能产生特定结合于用于免疫的蛋白质的抗体。或者，淋巴细胞可能在活体外被免疫。然后通过使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice，第59-103页(Academic Press，1986))。
以此方式制得的杂交瘤细胞被植入合适的培养基(较佳含有一种或多种抑制未融合的母体骨髓瘤细胞生长或存活的物质)并在其中生长。例如，如果母体骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷(HAT载体)，这些物质阻止缺乏HGPRT细胞的生长。
较佳骨髓瘤细胞是有效融合、支持通过所选择的抗体产生细胞进行抗体的稳定高水平生产、并对于例如HAT载体等载体敏感的骨髓瘤细胞。在这些骨髓瘤中，细胞系是鼠科骨髓瘤系，例如那些可获自SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA的从MOPC-21和MPC-11鼠肿瘤衍生的系以及获自American Type CultureCollection，Rockville，Md.USA.的SP2/0或X63-Ag8-653细胞。人类骨髓瘤和鼠-人异质骨髓瘤细胞系也已为产生人类单克隆抗体而描述(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur等人，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。也可使用鼠骨髓瘤细胞系NSO(European Collection of Cell Cultures，Salisbury，Wiltshire UK)。
杂交瘤细胞生长于其中的培养基被化验以测定对抗该抗原的单克隆抗体的生产。由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合专一性可由免疫沉淀反应或由活体外化验(例如放射性免疫测定法(RIA或)或酶联免疫吸附测定法(ELISA))来决定。
在鉴别出产生具有需要专一性、亲和性、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过限制稀释过程而被亚克隆并通过标准方法(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))生长。用于该目的的合适的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640载体。此外，杂交瘤细胞可在活体内生长，例如腹水肿瘤在动物体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化过程(例如蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)来将通过亚克隆而分泌的单克隆抗体自培养基、腹水流体或血清适当分离。
使用常规过程(Innis M.等人在PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications.中，Academic，San Diego，CA(1990)，Sanger，F.S，等人Proc.Nat.Acad.Sci.745463-5467(1977))易于将编码单克隆抗体的DNA分离并排序。杂交瘤细胞用作该DNA源。一旦被分离，DNA可能被置于表达载体，该载体接着被转移入如E.coli细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞等宿主细胞，以便在重组体宿主细胞中得到单克隆抗体的合成。下文将详细描述抗体的重组体生产。
在另一实施例中，可将抗体或抗体片断从使用McCafferty等人在Nature 348552-554(1990)中所描述的技术所产生的抗体噬菌体库中分离。Clackson等人在Nature 352624-628(1991)和Marks等人在J.Mol.Biol.222581-597(1991)中分别描述了使用噬菌体库分离鼠科动物和人类的抗体。后续出版物描述了通过链滑动产生高亲和性(nM范围)人类抗体(Marks等人，Bio/Technology 10779-783(1992))，以及将组合感染和体内重组作为构建物非常大的噬菌体库的策略(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.212265-2266(1993))。因此，这些技术为用于单克隆抗体分离的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的替代技术。
DNA也可被修改，例如，通过以人类重链或轻链常量域的编码序列来替代相应的鼠科动物序列(美国专利第4,816,567号；Morrison，等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 816851(1984))，或通过共价连接于非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列的免疫球蛋白编码序列。
通常，该非免疫球蛋白多肽被用来替代抗体的常量域，或者其被用来替代抗体的一抗原复合位的可变域，以产生一种嵌合二价抗体，该嵌合二价抗体包含一个对一种抗原具有专一性的抗原复合位和另一个对不同抗原具有专一性的抗原复合位。
另一可供选择的方法是使用电融合而不是化学融合以形成杂交瘤。这种技术很完善。代替融合，还可使用(例如)Epstein Barr病毒或一种转换基因，来转换B-细胞以使其不死。(参看例如，「预定特性的持续增生人类细胞系合成抗体」(″Continuously ProliferatingHuman Cell Lines Synthesizing Antibody of PredeterminedSpecificity″)Zurawaki，V.R.等人，在「单克隆抗体」(MonoclonalAntibodies)中，Kennett R.H.等人编辑，Plenum Press，N.Y.1980，第19-33页。)产生特定的抗-TLR9单克隆抗体的杂交瘤可通过使用TLR9衍生抗原的ELISA以及通过使用细胞表达人类TLR9的细胞结合化验来鉴定。对抗体的该专一性活性(不是竞争性(agonistic)(模拟CpG)就是对抗性(抑制CpG))将通过检验它们对细胞表面分子表达的影响以及对在B-细胞、T-细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及树突状细胞的主要培养基中的Th1-型细胞激素之生产的影响来测试。功能上有趣的抗体将在动物模型(例如那些对于敏感症和哮喘、肿瘤、细胞内病原疾病和疫苗)中被进一步测试。
人源化和人类抗体人源化抗体具有从非人类源中引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基经常被称作“引入”残基，其通常来自“引入”可变域。可遵循Winter及合作者(Jones等人，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyen，等人，Science，2391534-1536(1988))的方法，通过以多种啮齿动物CDR或CDR序列来替代人类抗体的相应序列，来基本上执行人源化。相应地，这些具有充分少于一个完整人类可变域的“人源化”抗体由来自非人类物种的相应序列而替代。实际上，人源化抗体通常是以下人类抗体，其中一些CDR残基以及有可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位置的残基取代。
将被用于产生人源化抗体的人类可变域(轻和重两者)的选择对于减少抗原性非常重要。根据所谓的“最佳适合”方法，根据已知的人类可变域序列的整个库对啮齿动物抗体的可变域的序列进行筛选(screen)。最接近啮齿动物序列的人类序列接着被接受以用作人源化抗体的人类构架(FR)(Sims等人，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一方法使用从轻链或重链的特定亚群的所有人类抗体的一致序列衍生的特定构架。相同构架可用于多种不同人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等人，J.Immunol.，1512623(1993))。
更重要的是，将抗体人源化以使其具有对抗原高亲和力的保持力和其它良好的生物性能。为了达到这个目的，根据一较佳方法，通过使用母体和人源化序列的三维模型而进行的对母体序列和多种概念性人源化产品的分析过程，来制备人源化抗体。通常可获得三维免疫球蛋白模型且其为熟习此项技术者所熟悉。可利用描述和显示所选中的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。对这些显示的观察允许对残基在该候选免疫球蛋白序列的功能化中的可能作用的分析，也就是，对影响该候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基的分析。通过这条途径，FR残基可被从受者和重要序列中选择并组合，以便获得需要的抗体特性(例如对目标抗原或多个目标抗原的增强的亲和力)。一般而言，在对抗原结合性的影响中，直接且最主要涉及到CDR残基。
或者，熟练的研究员可产生基因转移动物(例如小鼠)，该基因转移动物在免疫化的基础上有能力于缺乏内生免疫球蛋白生产时产生人类抗体的全部组成部分。该基因转移小鼠可获自Abgenix Inc.，Fremont，California和Medarex，Inc.，Annandale，New Jersey购得。据描述，嵌合和种系(germ-line)突变小鼠抗体的重链结合区域(JH)基因的纯合性缺失导致对内生抗体生产的完全抑制。在这种种系突变小鼠中的人类种系免疫球蛋白基因阵列转移将导致抗原激发下人类抗体的产生。见例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.733(1993)；和Duchosal等人Nature 355258(1992)。人类抗体也可从噬菌体显示库中衍生(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Vaughan，等人，Nature Biotech14309(1996))。
DelmmunisedTM抗体DelmmunisedTM抗体是其中潜在的T细胞抗原决定簇已被除去的抗原，如国际专利申请案PCT/GB98/01473所述。因此，我们希望在将这些抗体用于活体内时将人体免疫原性(immunogenicity)去除或充分减少。
此外，例如，抗体可通过共价结合于聚合物而被化学修改以增加其循环半寿期。较佳聚合物和将其附于肽的方法描述于美国专利第4,766,106号、第4,179,337号、第4,495,285号和第4,609,546号，其全文均以引用的方式并入本文中。较佳聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下可溶于水且具有较佳的在1000至40000之间、更佳在2000至20000之间、最佳的3000至12000之间的平均分子量。
其它分子可通过常规方法将适合用于本发明的其它分子从化合物库中分离或筛选(screen)出来。一种用于产生和筛选一化合物库的自动系统被描述于美国专利第5,901,069号和第5,463,564号中。一个更受关注的方法包括结合位的三维模型化，并接着制作一适合该模型的分子家族。接着对这些分子进行筛选，以选出具有最佳结合特性的分子。
基因构建物本发明的基因构建物可被并入病毒基因组并随后被封装入合适的病毒粒子中，该病毒粒子允许通过病毒感染进行高效基因传递。通常用于基因疗法的例示性病毒载体包括逆转录酶病毒载体、腺病毒载体及腺病毒相关病毒(AAV)载体。适合用于基因疗法的新近研制的病毒载体包括缓慢病毒(基于HIV-1或HIV-2的载体)及α-病毒载体(基于Sindbis病毒和Semliki Forest病毒)。可通过将抄录单元亚克隆入含有病毒封装所必须的序列的适当盒式载体(cassette vecto)而将基因构建物并入逆转录酶病毒、缓慢病毒或AAV载体的病毒基因组中。在将所得构建物的DNA转染入产生病毒组份的合适的封装细胞系中时，重组体病毒基因组可被适当地封装入有活力的病毒粒子。
为将基因构建物并入腺病毒基因组，通常需要一个额外步骤。由于腺病毒基因组长度为大约36Kbp，因此通过限制核酸内切酶消化力和结扎不便将抗体基因直接插入基因组。代替的方法是，基因被插入一盒式载体(cassette vecto)，例如pAvCvSv(Kobayashi K等人(1996)J.Biol.Chem.226852-60)。该载体具有pBR322骨干且含有腺病毒类型5(Ad5)5’逆转终端重复(ITR)，Ad5本原的复制、Ad5壳体化信号、Ela强化因子、多克隆位、以及作为同源重组体片断的来自核苷位置3328至6246的Ad5序列。接着将所得质体连同含有大量在某些病毒区域(例如E1核E3基因)具有缺失的腺病毒基因组一起共转染入适当的宿主细胞系，例如293细胞(Graham FL，等人，J.Gen.Virol.3659-72(1977))。在两DNA之间交迭区域的同源重组体将允许藏有抗-TLR9基因的重组体病毒基因组的产生。该重组体基因组随后将被封装入293宿主细胞中的有活力的传染性病毒粒子。可采用相似方法来将基因并入α-病毒或其它具有大基因组之病毒的基因组，以产生重组体病毒。
这些基因构建物可被制备为质体，该质体可被直接或作为裸露DNA两种方式中的一种而传递至宿主细胞或组织，或作为DNA并入脂质体、与适当的脂质组份接合、或并入病毒载体。较佳将其注射以用于给予。基因构建物将被期待用于引导结合于TLR9或其抗体片断的分子的合成，这些分子将逐渐进入血流以与TLR9相互作用。可通过肌肉内路线、静脉内路线或皮下路线将重组体病毒构建物给予于具有过敏性疾病的个体。可通过动物实验以外推法来确定剂量或在人类临床试验中确定剂量。
在另一实施例中，细胞被转染以表达特定针对、结合于、或抑制TLR9受体的内抗体(intrabody)。此处所用的“内抗体”是一种抗体，该抗体在细胞内被表达并具有活性。内抗体通常不是分泌而是被引导至细胞内表达目标。内抗体通常结合于细胞内的目标且因此将目标俘获于细胞内代谢区(例如，ER)。熟习此项技术者熟知内抗体(参看如Chen等人，Hum.Gene Therap.71515-1525(1996)；MarascoImmunotech. 1119(1995)；及Maciejewski等人Nature Med.1667-673(1995))。理论上，内抗体的高亲和性和选择性结合性质可用于以多种机制来调整细胞的生理和新陈代谢。例如，内抗体的结合可被用于阻塞或稳定大分子相互作用、通过闭塞一活性位来调整酶功能、视需要可隔绝基质或将酶调节至活性或非活性构象。内抗体也可用于从其通常细胞代谢区转移蛋白质，例如，通过闭塞细胞质内的转录因子，或通过去往细胞表面的蛋白质ER中的保持力。在这点上，内抗体与本发明结合，可有效地引发模拟CpG的信号转导。
额外的药物赋形剂可被用于控制本发明的分子的活性持续时间。这些赋形剂可被圈闭于通过凝聚技术或通过胶状药物发送体系(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒子及纳米胶囊)中或大乳剂中的界面聚合(羟甲基纤维素或明胶微胶囊)而制得的微胶囊中。制备脂质体发送系统的方法描述于Gabizon等人，Cancer Research424734(1982)；Cafiso，Biochem Biophys Acta 649129(1981)；及Szoka，Ann Rev Biophys Eng 9467(1980)。其它药物发送体系为此项技术中已知且被描述于，例如，Poznansky等人，在Drug DeliverySystems(R.L.Juliano编辑，Oxford，N.Y.1980)，第253-315页；M.L.Poznansky，Pharm Revs 36277(1984)。
液体药物组合物可被冻干以阻止退化并保持无菌。一般熟悉此项技术者了解冻干液体组合物的方法。仅在使用前，该组合物可通过无菌稀释剂(例如林格氏溶液、蒸馏水或无菌盐水)来复原，该无菌稀释剂可能包括额外的成分。在复原时，可将该组合物给予于患者。
本发明的分子可通过多种路线中的任何一种被给予，且以所指示的或用于所探寻目的的治疗有效的浓度而被给予。为实现这个目的，可使用多种此项技术中已知的可接受的赋形剂来调配这些抗体。通常，通过注射(静脉内注射或腹膜内注射两种方式中的一种)来给予这些抗体。一般熟悉此项技术者了解完成该给予的方法。还可能获得可被局部或口服给予、或能经过粘膜传送的组合物。
给予的剂量和模式将依赖于个体和将被给予的试剂而定。可通过临床试验中的例行试验或通过抗体有效的动物模式以外推法来确定剂量。
上述描述、术语、表达和实例仅为例示性且并非为限制性。本发明包括所有上述实施例的已知和未知的等效实施例。本发明仅受下列权利要求限制而不受本文档或任何其它源中的任何其它部分的任何陈述所限制。
权利要求
1.一种分子，其与TLR9上的肽片段结合并模拟该CpG基序效应。
2.如权利要求1的分子，其为抗体或其免疫功能片断、肽、寡核苷酸、肽模拟或有机化合物。
3.一种组合物，其包括与TLR9上的肽片段结合并模拟该CpG基序效应的分子。
4.如权利要求3的组合物，其中所述的分子是抗体或其免疫功能片断、肽、寡核苷酸、肽模拟或一有机化合物。
5.如权利要求1的分子，其中所述的分子结合于TLR9的Cys-Arg-Arg-Cys或Cys-Met-Glu-Cys中的至少一个。
6.一种促效药抗-TLR9分子，其与TLR9结合并刺激TLR9。
7.如权利要求2、4或6中任一项的抗体，其中所述的抗体是单克隆抗体。
8.如权利要求7的单克隆抗体，其中所述的抗体是嵌合抗体、人源化抗体、DelmmunisedTM抗体或人类抗体。
9.一种细胞系，其产生如权利要求2、4或6中任一项的抗体。
10.一种细胞系，其产生如权利要求9的抗体。
11.一种治疗TLR-调节性疾病的方法，其包括给予有效量的与TLR9上的肽片段结合并模拟该CpG基序效应的分子或组合物。
12.如权利要求11的方法，其中所述的分子是抗体或其免疫功能片断、肽、寡核苷酸、肽模拟或有机化合物。
13.如权利要求12的方法，其中所述的分子是与TLR9结合并刺激TLR9的促效药抗-TLR9分子。
14.如权利要求12的方法，其中所述的分子是单克隆抗体。
15.如权利要求14的方法，其中所述的单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体、DelmmunisedTM抗体或人类抗体。
16.如权利要求11的方法，其中所述的疾病是过敏性疾病。
17.如权利要求11的方法，其中所述的疾病是传染性疾病。
18.一种增强对肿瘤或癌症的治疗的方法，其包括与抗-肿瘤或抗-癌症剂结合而给予与TLR9上肽片段结合的分子或组合物，从而增强该抗-肿瘤或抗-癌症剂的效果。
19.一种诱导Th1-型反应的方法，其包括给予有效量的与TLR9上的肽片段结合并模拟该CpG基序效应的分子或组合物。
20.一种使被试者对因接触特定过敏源而引起的过敏性反应的脱敏的方法，其包括向该被试者给予有效量的与TLR9上的肽片段结合并模拟该CpG基序效应的分子或组合物。
21.一种使被试者免疫的方法，其包括向被试者给予抗原或编码于DNA疫苗中的抗原以及与TLR9上的肽片段结合并模拟该CpG基序效应的分子或组合物。
22.一种免疫原，其包括合成肽、重组体蛋白质或从含有CRRC和/或CMEC的TLR9衍生的编码该肽或该重组体蛋白质的DNA，其诱导结合于负责结合CpG的该TLR9抗原决定簇的抗体的产生。
23.如权利要求22的免疫原，其中所述的分子与CRRC和/或CMEC结合。
24.一种使病人免疫的方法，其包括给予合成肽、重组体蛋白质或从含有CRRC和/或CMEC的TLR9衍生的编码该肽或该重组体蛋白质的DNA，其诱导结合于负责结合CpG的该TLR9抗原决定簇的抗体的产生。
25.一种分子，其与TLR9上的肽片段结合且抑制该受体的功能。
26.一种治疗TLR-调节性疾病的方法，其包括给予有效量的与TLR9上的肽片段结合且抑制该受体的功能的分子或组合物。
27.一种编码抗体或其片断的核酸构建物，其与TLR9上的肽片段结合并模拟该CpG基序效应。
28.一种重组体表达载体，其包括如权利要求27的核酸。
29.一种细胞，其被如权利要求27的核酸所转化。
30.一种诱导宿主细胞表达与TLR9的肽片段结合的分子的方法，其包括给予包括如权利要求27的核酸的配方。
全文摘要
本发明包括与TLR9上的肽片段(peptidic segment)结合并模拟CpG基序效应的分子。CpG模拟试剂包括但不局限于抗体、小分子化合物、肽、模拟肽及核酸，其包含组合物，该组合物包含与TLR9上的肽片段结合并模拟CpG基序效应的分子，此组合物适用于给予给需要治疗的病人，并可选择性地与(例如)赋形剂、稀释剂或载剂配合使用。此外，本发明包括与位于
文档编号C07K16/18GK1642982SQ02818821
公开日2005年7月20日 申请日期2002年7月25日 优先权日2001年7月26日
发明者安玲玲, 吴和仁, M·S·C·冯 申请人:唐诚公司