基因调节肽的制作方法

专利名称：基因调节肽的制作方法
在美国，本申请是申请日为2001年12月21日的US申请10/028,075的部分继续申请。
基因控制一般认为在4个水平发生1)转录(起始或终止)，2)初级转录物的处理，3)mRNA的稳定及不稳定化，和4)mRNA翻译。细胞中基因控制的主要功能是调节细胞对其营养，化学和物理环境的酶学机制。
一般认为基因表达在转录和翻译两个水平被调节。基因表达的调整或调节需要称为转录因子的因子。术语“基因控制或调节”还指mRNA的形成和应用。尽管可以在许多不同的分子步骤进行控制，但差别转录最可能常常成为在原核生物以及真核生物中蛋白质合成速度差别的基础。一般认为激活子蛋白(也称为转录因子或转录激活子)结合DNA并在细胞中为启动子募集转录机制，从而刺激基因表达。另外，RNA转录物在细胞核中的差别处理，mRNA在细胞质中的差别稳定及mRNA差别翻译为蛋白质在真核生物基因控制中也是重要的。这些步骤限定了在转录循环中的调节结果，及在任何阶段的误调节均可产生多种疾病。
在单细胞生物体中，假如是原核或真核起源的，细胞对其环境的应答受许多外界刺激的影响，反映单细胞的广泛可变环境，多细胞生物体的大多数细胞经历的是相当恒定的环境。也许由于这个原因，专门应答环境变化的基因在多细胞生物体中比在单细胞生物体中占全部基因数目的很小一部分。
如上所述，细胞对环境变化作出反应，它们通过胞外信号感知。这些信号可以是物理的(例如光，温度，压力和电流)或化学的(例如食物，激素和神经递质)。细胞可以感知并产生信号。这使其可以彼此沟通。为达到这种状态，在单细胞和多细胞生物体中存在复杂的信号感知和产生机制。
可以区别两组化学信号可透过膜的及不可透过膜的信号。可透过膜的信号分子包含类固醇激素的大家族，如雌激素，孕酮和雄激素。类固醇穿过质膜并与特异受体结合，所述受体位于细胞质或细胞核中。在与激素结合后，所述受体经历构象变化。然后所述受体自身能与DNA结合或者与可以随后与DNA相互作用的蛋白质结合。一般地，类固醇激素通过这种程序可直接调节基因表达。膜不可通透的信号分子包括乙酰胆碱，生长因子，胞外基质成分，(肽)-激素，神经肽，凝血酶，溶血磷脂酸，酵母杂交因子，及针对群居阿米巴虫Dictyostelliumdiscoideum的叶酸和环AMP。它们自身可以是可透过膜的，但只在细胞外起作用，即，它们被位于细胞质膜的受体识别。所述受体特异于一个特定的信号分子或者密切相关的信号分子家族。在与其配体结合基础上，这些受体通过一些机制转导信号。
对多细胞生物体的基因控制最特征性及严格的要求是进行精确的发育决定，以便在正确的细胞中在正确的时间激活正确的基因。这些发育决定不仅包括与生物体发育相关的那些决定，例如在胚胎发生核器官发生或者在应答疾病期间可见的那些，还涉及那些细胞的分化或增殖或凋亡，所述细胞仅仅基本进行其遗传程序，不产生子代。
这种细胞如皮肤细胞，红细胞前体，眼晶状体细胞及抗体产生细胞，通常也受基因控制模式的调节，所述基因控制适合整个生物体而不是个别细胞的存活需要。
一般论述了基因控制至少存在三个成分分子信号，水平和机制。首先，论述了存在特异性基因可应答的特异性信号传导分子。其次，在蛋白质合成中从DNA转录至mRNA应用的一系列事件中在一或多个水平(即步骤)中进行控制。再者，在每个水平中，应用特异的分子机制以最终对基因的表达进行控制。
许多基因不受进入细胞中的信号传导分子的调节，而是受与细胞表面上的特异受体结合的分子调节。细胞表面受体与其配体之间的相互作用可以跟随有一串胞内事件，包括所谓第二信使(二酰甘油，Ca2+，环核苷酸)的胞内水平的变化。第二信使随后通过环AMP，环GMP，钙激活的蛋白激酶，或者由diaglycerol激活的蛋白激酶C引起蛋白质磷酸化的变化。
配体与细胞表面受体结合的许多应答是胞质性的，而且不参与细胞核中的即时基因激活。然而，已知一些受体配体相互作用导致特异的和限定的基因系列的即时核转录激活。例如，已知一种原癌基因，c-fos在一些细胞类型中通过提高几乎每一个已知第二信使，而且还通过至少两种生长因子而被激活，所述生长因子是血小板衍生生长因子和表皮生长因子。然而，精确确定这种激活是怎样完成的进展缓慢。在一些情况中，已经定性了应答细胞表面信号的转录蛋白质。
现存的在细胞表面相互作用之后激活失活转录因子的最清楚的实施例是核因子(NF)-κB，其最初被检测到是因为其刺激编码B淋巴细胞的κ种类免疫球蛋白的基因转录。κ基因中NF-κB的结合位点已经被充分阐述(见例如P.A.Baeuerle和D.Baltimore，1988，Science 242540)，提供了一种分析激活因子存在的方法。这种因子与抑制子复合存在于淋巴细胞的胞质中。用温和的变性条件体外处理分离的复合物以解离该复合物，因此游离的NF-κB与其DNA位点结合。已知细胞中活性NF-κB的释放在多种刺激后发生，包括用细菌脂多糖(LPS)和胞外多肽以及刺激胞内磷酸激酶的化学分子(例如佛波酯)处理细胞。因此，通过许多可能的刺激触发的磷酸化事件可说明NF-κB到活性状态的转变。激活的因子然后转位至细胞核以刺激具有激活的NF-κB结合位点的基因的转录。
炎症应答包括相继释放介质及募集循环白细胞，其在炎症位点被激活并进一步释放介质(Nat.Med.71294；2001)。这种应答是自限的并通过释放内源抗炎介质及清除炎症细胞而解决。白细胞的持续积聚和激活是慢性炎症的特点。目前治疗炎症的方法依赖于抑制促炎症介质的产生及发起炎症应答的机制。然而，解决炎症应答的机制可以在治疗慢性炎症中提供新的目标。在解决炎症的不同实验模型中的研究已经鉴别了解决炎症消退的一些推定机制和介质。我们已经示出环戊烯酮前列腺素(cyPGs)可能是内源抗炎介质并促进体内炎症消退。其它研究已经示出在炎症消退期间产生抗炎lipoxins的一种暂时方法。近年来，已经确定凋亡是在体内消退炎症的一种重要机制。已经假定白细胞凋亡的缺陷在炎症疾病的发病机理中是重要的。另外，在白细胞中选择性诱导凋亡可提供一种新的炎症疾病治疗方法。
鉴于NF-κB被认为是疾病的主要效应子(A.S.Baldwin，J.Clin.Invest.，2001，1073-6)，因此正在进行许多努力以找出用于治疗慢性和急性病变的安全的NF-κB抑制剂。NF-κB的特异性抑制剂应降低和药物如NSAIDS和糖皮质激素相关的副作用，并具有治疗多种人和动物疾病的潜力。患者受益于抑制NF-κB的特异性疾病或综合征范围非常广泛，从类风湿性关节炎，动脉粥样硬化，多发性硬化，慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经炎，哮喘，炎症性肠道疾病，至幽门螺旋菌相关的胃炎及其它炎症应答，及对NF-κB活性有作用的多种药物，如皮质类固醇，柳氮磺吡啶，5氨基水杨酸，阿司匹林，替泊沙林，来氟米特，姜黄色素，抗氧化剂和蛋白酶抑制剂。这些药物被认为是非特异性的，而且通常只可高浓度应用，以对处理个体的毒性而告终。
转录因子的失活胞质形式因此可以通过除去抑制剂而激活，如NF-κB的情况，或者通过与两个(或多个)蛋白质结合而激活，在α干扰素刺激因子的情况中无一是自身激活(D.E.Levy等，1989，Genesand Development 31362)。在α干扰素附着于其细胞表面受体后，所述蛋白质之一在1分钟或更短的时间内变化，而且这两种蛋白质可组合。激活的(组合的)因子然后转位于细胞核以仅刺激具有所述蛋白质结合位点的基因转录。鉴于α干扰素是机体对病原体和自身抗原应答的介质，因此调节在α干扰素刺激因子影响下的基因有助于治疗多种人和动物疾病。
通过细胞表面受体相互作用影响基因表达的信号传导分子的其它典型实施例是多肽激素如胰岛素，胰高血糖素，多种生长因子如EGF，VEGF等等。
类固醇激素及其受体代表影响转录的一种最佳已知情况。因为类固醇激素在脂质膜中是可溶的，因此它们可扩散入细胞中。它们通过结合特异的胞内受体而影响转录，所述受体是位点特异性DNA结合分子。进入细胞并在胞内起作用的信号传导分子的其它实施例是甲状腺激素(T3)，维生素D和视黄酸，及进入细胞并调节基因表达的其它脂质可溶的小信号传导分子。还已知这些信号传导分子的受体的特有DNA结合位点可作为应答元件。
参与调节基因表达的小分子的另一个实施例是乙烯，这是一种气体，例如诱导参与果实成熟的基因表达。同样，小型植物激素，如植物生长素和细胞分裂素通过调节基因表达而直接调节植物生长和分化。
鉴于调节因子在基因调节中的关键作用，找出可用于调整基因表达错误方法的人工或合成副本在化学和生物学边缘领域是一个长期目标。
本发明人在细胞生物体中基因调节的调节因子的生物学和生理学性质方面提出了一种见解，使得可以未曾期望地快速鉴别和找出作为基因调节因子的人工或合成化合物，及其作为新的化学成分生产药物组合物的应用或者在治疗疾病中的应用。在此提供的所述见解是通过蛋白酶解生物体内源蛋白质而衍生的许多小肽，或者通过蛋白酶解病原体蛋白质而衍生的小肽，即在宿主生物体中存在所述病原体期间衍生的小肽，通常对所述生物体的细胞可产生非常特异的基因调节活性。在一个特殊的实施方案中，本发明在使研究者增进关于在多种不同的条件和情况下控制NF-κB引起的基因表达的机制的知识的质量和数量方面具有重要价值。
根据这些见解，本发明提供了一种鉴别或获得一种信号传导分子的筛选方法，所述信号传导分子包含能在实验动物如猴或者小型实验室动物如大鼠或小鼠体外或体内调节基因在细胞中表达的一种肽或其功能衍生物或其类似物，所述方法包括提供具有至少一种引导肽或其衍生物或其类似物的所述细胞(或动物)，并确定基因转录因子的活性和/或核转位，特别的，其中所述引导肽长度为3-15个氨基酸，更优选的，其中所述引导肽长度为3-9个氨基酸，最优选的，其中所述引导肽长度为4-6个氨基酸。
此处与所述信号传导分子的作用或活性相关的功能衍生物或类似物例如可通过测定相关转录因子，如在NF-κB或AP-1分析中的NF-κB或AP-1的核转位而测定，或者通过在此所提供的另一种方法测定。片段可在一或两侧略少或多(即1或2个氨基酸)而仍提供功能活性。本发明还提供了一种筛选方法，其中所述方法进一步包括确定所述基因转录因子是否调节细胞因子的转录，例如通过检测细胞因子转录水平或者在处理的细胞或动物中的实际存在情况而测定，或者其中所述基因转录因子包含NF-κB/Rel蛋白质，或者通过确定在所述细胞中表达的至少一个感兴趣的基因或者在所述细胞中表达的多个基因的相对上调和/或下调情况而测定，这可以简单地通过基因芯片技术或者在此所述任何其它方法进行。
本发明还提供了一种鉴别或获得一种信号传导分子的筛选方法，所述信号传导分子包含能在实验动物如猴或者小型实验室动物如大鼠或小鼠体外或体内调节基因在细胞中表达的一种肽或其功能衍生物或其类似物，所述方法包括提供具有引导肽或其衍生物或其类似物的所述细胞(或动物)，并确定在所述细胞中表达的至少一种基因的相对上调和/下调情况，特别是其中所述引导肽是此处鉴别的足够小的肽。此处提供的鉴别或获得包含能调节基因在细胞中表达的肽或其功能衍生物或其类似物的一种信号传导分子的方法还可以包括提供(在体外或体内)一种引导肽或其衍生物或其类似物，并确定所述肽或其衍生物或其类似物与一种基因控制相关因子的结合情况，所述因子如转录因子，特别是其中所述转录因子调节细胞因子的转录，或者确定具有所述肽的所述细胞中的基因转录因子的活性和/或核转位。
有利的是，根据本发明提供的一种筛选方法，其中所述所述引导肽是肽或其衍生物或其类似物文库的成员之一，特别的，其中所述文库由基于在天然发生的蛋白质中的出现情况而选择的肽组成。基于使用此处提供的引导肽技术，对针对发现用于人体或动物治疗的新的化学成分的研究而言，优选所述蛋白质是哺乳动物蛋白质，最优选的是人体蛋白质。蛋白质序列可得自一般可获得的数据库，例如人类基因组数据库。可获取引导肽文库的其它有用的蛋白质是衍生自病原体蛋白质的那些蛋白质。为鉴别用于农作物培育的肽，可利用一些植物蛋白质数据库。
在一个优选的实施方案中，提供了本发明的一种筛选方法，其中所述文库中的引导肽在预测的蛋白酶解位点指导下进行选择，如预测或认为在MHC中被识别的肽，例如以下预测被识别为抗原决定簇并在HLA分子中呈递的hCG衍生肽TMTRVLQGV，VLQGVLPAL，VLPALPQVVCNYRDVR，VCNYRDVRFESI，LPQVVCNYRDVRFESI。在另一个实施方案中，提供了一种筛选方法，其中所述文库中至少一种所述肽基本上与所述文库中另一种肽重叠，例如VLQGVLPAL与VLPALPQVVCNYRDVR。有用的引导肽的其它系列或文库可以通过产生非常严密的重叠而设计，例如，相差1或2个氨基酸就全部重叠，例如LQGV，QGVL，GVLP等等，或者QGVLPA，VLPALP，PALPQV等等。当然，本发明目的在于提供作为信号传导分子的新的化学成分，该信号传导分子用于调节基因在细胞中的表达和通过本发明提供的筛选方法可鉴别或获得。此处提供了有用的信号传导分子作为NF-κB/Rel蛋白质的调节子，如以下详细描述。本发明还提供了如此提供的信号传导分子在生产调节基因表达的药物组合物中的应用，例如通过抑制NF-κB/Rel蛋白质激活而进行，或者其在生产治疗灵长类动物或家畜的药物组合物中的应用。
已知小肽甚至分解产物仍具有生物活性。内源或病原体衍生的蛋白质的蛋白酶解产物例如通过蛋白酶体体系统常规产生，并存在于I或II型主要组织相容性复合物(MHC)中。同样，已经公认传统已知的神经肽(也称为肽神经递质)或者小肽激素，如抗利尿激素，催产素，促甲状腺素释放激素，促性腺激素释放激素，促生长素抑制素，胃泌素，胰酶分泌素，P物质，脑啡肽，神经降压素，血管紧张素，及其衍生物或其等价物，具有独特的生物学活性，其一般通过细胞表面受体相互作用而介导。另外，现已知某些小型及富含精氨酸或赖氨酸或脯氨酸的肽，即具有50％以上精氨酸，或50％以上赖氨酸或50％以上脯氨酸，或者具有50％以上精氨酸和赖氨酸，或者50％以上精氨酸和脯氨酸，或者50％以上赖氨酸和脯氨酸，或者50％以上精氨酸和赖氨酸和脯氨酸残基，具有产生生物学活性的独特的膜通透性质。
然而，本发明涉及小肽，而不是传统已知的神经肽或肽激素，也不是上述鉴别的富含精氨酸或赖氨酸或脯氨酸的肽。优选的，本发明的肽及在本发明提供的筛选方法中用作引导肽的肽是小的。最优选的大小是4-6个氨基酸，2-3个氨基酸或者7-9个氨基酸的肽也非常可行，10-15个氨基酸的肽也是可行的，但对测试本发明提供的方法实用性较低，及10-15个氨基酸的或更大的肽优选的分解为较小的，功能更加活跃的片段。
如述，本发明提供了这样的见解，即通过蛋白酶解生物体的内源蛋白质衍生的或获得的小肽，或者通过蛋白酶解病原体蛋白质，即在宿主生物体中存在所述病原体期间衍生的或获得的小肽，对所述生物体的细胞可发挥非常特异性的基因调节活性。这个见解产生了针对系统方法实践或进行本发明方法以鉴别信号传导分子的直接动机，通过获得关于小(寡)肽或其修饰物或其衍生物(在此统称为引导肽)的调节基因表达的能力或趋向的信息而进行。此处提供的这种方法例如包括将所述肽或其修饰物或其衍生物与至少一种细胞接触，并确定在所述细胞中或从所述细胞中衍生的至少一种基因产物的存在情况。当所述引导肽包含相当于天然发生多肽片段的氨基酸序列时，这种方法时特别有益的。在此示范过程是这样一种方法，其中所述天然发生多肽包含一种激素如人绒毛膜促性腺激素(hCG)。然而，选自各种类别的其它蛋白质如免疫球蛋白，热休克蛋白，Cys蛋白酶，细胞色素p450酶(丝氨酸/苏氨酸，或酪氨酸)激酶，受体蛋白，蛋白质磷酸盐，当从中选择设计引导肽的多肽序列时应首先加以注意。其它蛋白质也可以作为起点。特别值得提及的是病原体蛋白质作为起点。例如从寄生虫病原体中值得选择这样的蛋白质，尤其与其宿主以特殊的体内寄生关系生存一定时间的那些生物体，如引起人体和动物囊尾蚴病的绦虫(Taenia spp)，及血吸虫(Schistosoma spp)，疟原虫(malaria)，或者锥虫(Trypanosoma)，贾第氏滴虫(Giardia spp)，Dictiocaulus spp，等。值得注意的其它病原体是胞内生物体如发现的(分枝)细菌和病毒。
在一个实施方案中优选系统的进行在此提供的这种测试，基于例如组合的化学形式进行，其中测试多个引导肽(在一个所谓的肽文库中)，并在随后的测试循环中进一步测试有希望的各个引导肽，或引导肽组，从而这种引导肽可以修饰为希望的肽，例如如此处描述用其它(D-或L-，非天然或天然发生的)氨基酸置换或取代或其修饰物或其衍生物。特别是包括这种随后的最佳化进程，本发明因此提供了一种系统方法以鉴别或获得一种信号传导分子，所述分子包含能调节基因在细胞中表达的一种肽或其功能衍生物或其类似物，所述方法包括提供具有肽或其衍生物或其类似物的所述细胞，并确定基因转录因子的活性和/或核转位，然后合成具有希望活性的分子。
这样首先可以系统获得对引导肽或其修饰物或其衍生物调节基因表达的趋向和能力的信息，并在随后的引导肽最佳化进程中改良所述能力，直至所述引导化合物被发展为调节被研究的基因的药物组合物或治疗方法中有效的化学成分。此处提供的获得关于引导肽或其修饰物调节基因表达能力信息的方法，包括将所述引导肽或其修饰物与至少一种细胞接触，并确定衍生自所述细胞的至少一种基因产物的存在情况。
如述，引导肽可衍生自天然发生的多肽如天然蛋白质分子。优选的，使用含有3-15个氨基酸的引导肽。以随机方式测试其衍生自被研究的生物体蛋白酶体的肽。引导肽可包含重叠的氨基酸序列及预测的化学或酶切/消化多肽而产生的肽。引导肽可以是线性肽以及环形肽。天然发生的蛋白质可以是内源蛋白质如人绒毛膜促性腺激素(hCG)。另外，可例如是衍生自病原体多肽的肽，所述病原体如Bordetella，耶尔森氏菌(Yersinia)，鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)和非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus)。如述，许多病原体具有进化机制以通过抑制NF-κB激活及抑制促炎症细胞因子的上调而抵消或避免宿主免疫应答。另一方面，一些病毒，包括HIV-1，CMV和SV-40，利用在感染部位被激活的NF-κB作为宿主因子。针对研究宿主-病原体的相互作用提供了一种方法，包括确定衍生自所述病原体多肽的引导肽对所述宿主基因表达的作用。
在一个实施方案中，进行线性扫描，其是使用合适的生物学分析以系统筛选衍生自蛋白质序列的重叠引导肽。这种生物学分析包括获得关于引导肽或其修饰物调节基因表达的能力或趋向信息的分析。用例如15-mer，或12-mer，或9-mer，或8-mer，或7-mer，或6-mer，或5-mer，或4-mer或3-mer肽扫描可产生关于形成相互作用位点的一段氨基酸线性序列颇有价值的信息，并使得可以鉴别具有调节基因表达能力或趋向的引导肽。引导肽可以加以修饰以调节其调节基因表达的能力或趋向，其可易于在体外生物学分析如报道子分析中分析。例如在一些位置的一些氨基酸可以用相似或不同性质的另一个氨基酸置换。丙氨酸(Ala)-置换扫描，包括用Ala残基系统置换每个氨基酸，当在搜索能调节基因表达的信号传导分子时是修饰引导肽氨基酸组成的一种适当方法。当然，这种置换扫描或作图也可以采用Ala之外的氨基酸，例如使用D-氨基酸。在一个实施方案中，衍生自天然发生多肽的肽经鉴别能调节基因在细胞中的表达。随后，产生了这种引导肽的多个合成的Ala突变体。对这些Ala突变体进行扫描，与引导多肽相对比其调节基因表达的增强或改良的能力。
另外，可以使用D-和/或L-立体异构体化学合成引导肽或其修饰物或其类似物。例如，产生一种引导肽，即天然来源的寡肽的反向倒置体。多肽反向倒置的概念(使用D氨基酸以反向顺序组装含有天然L氨基酸的亲代序列)已经成功用于合成肽。肽键的反向倒置修饰广泛用于肽模拟方法中以设计新的生物活性分子，所述方法应用于生物活性肽的许多家族。肽的序列，氨基酸组成和长度将影响正确装配和纯化是否可行。这些因素还决定终产物的溶解性。粗制肽的纯度典型随着长度增加而降低。序列长度少于15个残基的肽的产量通常令人满意，这种肽典型的能不费力地生产。肽的全部氨基酸组成是重要的设计变量。肽的溶解度明显受组成影响。具有高含量疏水性残基，如Leu，Val，Ile，Met，Phe和Trp的肽，在水溶液中溶解性有限或者完全不溶解。在这些条件下，难以在实验中使用这样的肽，而且如果需要也难以纯化所述肽。为达到良好的溶解性，保持疏水性氨基酸的含量低于50％并保证每5个氨基酸有至少一个带电荷的残基是明智的。在生理pH值下，Asp，Glu，Lys和Arg均具有带电荷的侧链。单一保守置换，如用Gly置换Ala，或者在N或C末端加入一系列极性残基，也可以改良溶解性。含有多个Cys，Met或Trp残基的肽也难以高纯度获得，部分是由于这些残基对氧化和/或副反应易感。如果可能，应选择这些残基最少的序列。或者，针对一些残基可进行保守置换。例如，正亮氨酸可用于置换Met，而Ser有时可用作Cys的较低反应性的置换。如果从蛋白质序列中产生了许多相继的或重叠的肽，在每个肽的起点进行改变可在亲水性和疏水性残基之间产生更好的平衡。各个肽中包含的Cys，Met和Trp残基数目的变化可产生相似作用。在本发明的另一个实施方案中，能调节基因表达的引导肽是一种化学修饰的肽。肽修饰包括磷酸化(例如对Tyr，Ser或Thr残基)，N-末端乙酰化，C-末端酰胺化，C-末端酰肼，C-末端甲酯，脂肪酸附着，磺化(酪氨酸)，N-末端丹酰化，N-末端琥珀酰化，三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸(PAM3 Cys-OH)以及Cys残基的法呢基化。引导肽的系统化学修饰可例如在引导肽最佳化进程中进行。
合成的肽可使用本领域已知的多种方法获得。这些方法包括固相肽合成(SPPS)及液相有机合成(SPOS)技术。SPPS是合成肽和小蛋白质的一种快速及简便的方法。C-末端氨基酸用接头分子通过酸不稳定键典型的附着于交联的聚苯乙烯树脂。这种树脂在用于合成的溶剂中是不溶的，使其相对简便及快速的洗去过量的试剂和副产品。
一般地，由中心碳原子(称为α-碳)组成的氨基酸由四个其它基团环绕氢，氨基，羧基和侧链基团。侧链基团称为R，其限定了氨基酸的不同结构。某些侧链含有可干扰酰胺键形成的功能性基团。因此，掩饰氨基酸侧链的功能基团是重要的。N末端可以用Fmoc或Boc基团保护，其在酸中稳定但可由碱除去。任何侧链功能基团均可用碱稳定而酸不稳定的基团保护。为开始每个偶联，在树脂上结合的氨基酸/肽的掩饰基团用在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％六氢吡啶除去。然后漂洗并加入一个在其α羧基基团已经激活的保护的氨基酸。激活通过原位产生N-羟基苯并三唑(HOBt)而实现。激活的氨基酸和树脂结合的氨基酸在存在碱的情况下反应以形成新的肽键。重复这过程直至在树脂装配成希望的肽。一旦肽完成，易于将其从树脂中裂解。这可以使用三氟乙酸(TFA)和清除剂的混合物来实现。清除剂中和在除去侧链保护基团期间形成的阳离子。所述溶液是至少82％TFA，剩余的是苯酚，thioanisol苯甲硫醚，水，乙烷二硫醇(EDT)和三异丙基硅烷(TIS)的混合物。树脂上的引导肽可以与裂解混合物反应几小时，然后在溶液中提供肽。随后可进行沉淀并在叔丁基甲基醚中洗涤，及如所希望地进行分析或纯化。
任何多肽链中的一个重要连接是酰胺键，其通过缩合一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基基团而形成。近来，对肽片段中关键的酰胺键由同配基团置换收到了密切关注，这是产生具有改良的稳定性的新生物活性物质的一种可能方法。在本发明的一个实施方案中，引导肽包含一个合成分子，其中至少一个酰胺键被一个同配基团如酮亚甲基或反式链烯基团置换。传统上充分阐明的分子被系统修饰并且分析产物化合物改良的生物学活性。最新组合化学方法可以合成大量相似的化合物。一般随后进行针对生物活性如调节基因表达能力的肽的选择，或筛选。在本发明的一个实施方案中，引导肽使用组合化学方法随机合成。具有新近自动筛选优势的组合化学方法使得可以在短时间内测试大量的化合物。这个技术包括制备大量的结构相关的化合物，其或者是在相同反应容器中的混合物形式或者平行合成的单独的化合物。在这种方式中，可以在短时间内合成大量的相似化合物。可以使用液相化学及通过固相合成制备组合文库；然而，固相合成可以使用过量的试剂以促进反应完全，并易于通过简单过滤聚合支持物及用溶剂洗涤而除去所述试剂和副产品。因此，固相合成提供了一种更有吸引力产生进行筛选的化合物文库的方法。
组合化学方法非常适合于肽。引导肽文库可使用固相化学方法容易的合成。在使用分裂合成或平行合成的合成期间可以掺入序列简并。在分裂合成方法中，在每个偶联步骤之前先将固相支持物分为几部分。然后将不同分子单位(合成子)，如氨基酸与每部分偶联。在偶联之后重组所有部分，完成合成循环。这种“分裂及混和”方法的优点是在每个支持珠上产生一个独特的序列，而且合成子反应可变性可以通过改变偶联条件而校正。在氨基酸之间反应性变化明显的肽合成中需要“分裂及混和”方法。肽在树脂上的头-尾环化提供了环化化合物的一个简便易行的途径。除了固相合成的一般优点之外，如高效及便于纯化，肽在聚合支持物上的头-尾环化提供了甚至在高浓度下最小限度的分子间反应风险(例如，二聚体化和寡聚化)。这是相对于液相化学的另一个优势，液相化学方法需要高度稀释条件以避免线性肽的分子间副反应。
在一个实施方案中，提供了一种鉴别或获得信号传导分子的方法，所述信号传导分子包含能调节基因在细胞中表达的一种肽或其功能衍生物或其类似物，所述方法包括提供具有肽或其功能衍生物或其类似物的所述细胞，并确定基因转录因子的活性和/或核转位。
因此揭示的化学成分可以经系统的，总体的或局部的施用而导入体内。所述肽，或其修饰物或其衍生物，可以作为这样的实体或者作为药剂学合适的酸或碱添加盐而施用，所述盐是与以下物质反应而形成的无机酸(如盐酸，氢溴酸，高氯酸，硝酸，硫氰酸，硫酸和磷酸)；或者有机酸(如甲酸，乙酸，丙酸，羟基乙酸，乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸，马来酸和反丁烯二酸)；或者无机碱(如氢氧化钠，氢氧化铵，氢氧化钾)；或者有机碱(如单，二，三烷基和芳基胺及取代的乙醇胺)。选择的肽及任何衍生的实体也可以与糖，脂质，其它多肽，核酸和PNA缀合，作为缀合物或者在达到靶组织或器官后局部释放而在原位起作用。
回到引导肽的检测，例如可以在完全随机的基础上产生这样的引导肽文库，所述文库包含小肽片段作为测试实体(在此也称为引导肽)，每个小肽片段优选长度为大约3-15个氨基酸(更优选4-9个，甚至最好优选4-6个氨基酸)的已知氨基酸或氨基酸衍生物的每个组合，然后将每个所述引导肽或其修饰物或衍生物与至少一个细胞接触，然后确定在所述细胞中或衍生自其中的至少一种基因产物的存在情况。然而，优选的用更具选择性的肽文库起始，其中例如引导肽基于其在内源(宿主或病原体)蛋白质序列中的出现情况而加以选择，从所述蛋白质序列推定(优选长度为4-6个氨基酸)引导肽，然后基于推定的蛋白酶解位点合成。存在几个这样的模型，例如优选的使用一种计算机模型，其可以推定MHC-I或MHC-II特异性蛋白酶解序列。在这种肽文库的另一个实施例中，在所述文库中测试的引导肽通过从正在研究的蛋白质(考虑到当以重叠方式测试较长的肽序列时涉及的工作量，优选长度为4-5个氨基酸的短片段)中以重叠方式选择并合成的肽片段而衍生自一个蛋白质序列，其中所述重叠可以例如是1，2或3个氨基酸，或者其中在连续序列中仅相差1个氨基酸。更优选的是一种方法，其中所述肽文库由引导肽组成，所述引导肽可以这样衍生，即首先如上在蛋白质推定的蛋白酶解位点的指导下选择较长的肽序列，及从那些较长的序列中设计长度为4-6个氨基酸的肽片段，所述肽片段以重叠方式从推定的较长序列中衍生。
能够衍生出引导肽被进一步测试的肽序列的蛋白质非限制性的包括胶原蛋白，PSG，CEA，MAGE(黑素瘤相关生长抗原)，凝血酶敏感蛋白-1，生长因子，MMPs，钙调蛋白，嗅受体，细胞色素p450，激酶，Von Willebrand因子(凝固因子)，液泡蛋白(ATP合成酶)，糖蛋白激素，DNA聚合酶，脱氢酶，氨基肽酶，胰蛋白酶，病毒蛋白(如包膜蛋白)，弹性蛋白，冬眠相关蛋白，防冻糖蛋白，蛋白酶，环子孢子蛋白，核受体，转录激活子，细胞因子及其受体，细菌抗原，Nramp，RNA聚合酶，细胞骨架蛋白，造血(神经)膜蛋白，免疫球蛋白，HLA/MHC，G-偶联蛋白及其受体，TATA结合蛋白，转移酶，锌指蛋白，剪接蛋白，HMG(高速泳动族蛋白)，ROS(活性氧)，超氧化物酶，超氧化物歧化酶，原癌基因/肿瘤抑制基因，载脂蛋白。
本发明提供了获得关于引导肽，或其修饰物或衍生物调节基因表达的能力或趋向的信息的另一种方法，其中信息使用微阵列技术获得。微阵列技术利用基因组测序计划及其它测序结果产生的序列资源以回答什么基因在生物体的特定细胞类型中，在特定的时间，在特定的条件下表达。微阵列运用了互补单链核酸的优先结合。微阵列可以系统的检测细胞中的基因表达谱。关于这种技术有几个名称DNA微阵列，DNA阵列，DNA芯片，基因芯片等。微阵列典型的是一个玻璃(或者一些其它材料)片，核酸分子如DNA或RNA附着在其上的固定部位(斑点)。一个阵列上可以有成千上万个斑点，每个斑点均含有大量相同的DNA分子(或者相同分子的片段)，长度为20-几百个核苷酸。对基因表达研究，这些分子的每一个应该理想地鉴别基因组中的一个基因或一个外显子。所述斑点或者通过自动设备印迹于微阵列上，或者通过照相平版印刷术(与生产计算机芯片相似)或通过喷墨印刷合成。
在本发明的一个实施方案中，微阵列技术用于确定一种肽控制细胞中至少一个基因的相对上调和/或下调的能力。同样，本发明提供了一种方法，其使用微阵列技术确定一或多个引导肽或其衍生物对细胞中表达的多个基因的上调和/或下调的调节作用。在另一个实施方案中，合成具有希望活性的引导肽，所述活性例如在微阵列中确定。有几种方法中微阵列可以用于测定基因表达水平。最流行的微阵列应用之一是可以在两个不同的样品中对比基因表达水平，例如在未处理和处理条件下的相同细胞类型的两个不同样品。从在两种不同条件下的细胞中提取总mRNA，并使用两种不同染料标记例如绿色染料标记条件1的细胞，红色染料标记条件2的细胞(为更加精确，所述标记典型的通过称为逆转录酶的酶合成与提取的mRNA互补的单链DNA而进行)。将两种提取物均经过微阵列洗涤，来自提取物的标记基因产物与所述斑点中与其互补的序列杂交，由于优先结合互补单链核酸序列趋于彼此吸引而且互补部分越长，吸引力越强。染料使得可以测定与斑点结合的样品数量，例如，当荧光染料在激光激发时测定发射荧光的水平而测定。如果来自条件1的样品的RNA是丰富的，斑点将是绿色的，如果来自条件2的样品的RNA是丰富的，斑点将是红色的。如果两者相等，斑点将是黄色的，如果都不存在，将无荧光，斑点表现为黑色。因此，从每个斑点的荧光强度和色彩中，可以估计两个样品中基因的相对表达水平。
如在详细说明中所举例示出的，微阵列技术是一种监测引导肽上调或下调细胞中基因表达能力的具有吸引力的方法。典型的实验包括一系列平行样品，每个样品含有至少一种具有不同引导肽，或其修饰物或衍生物的细胞。所述实验还包括一种对照样品，其含有至少一种无引导肽的细胞。细胞可以是原代细胞，如外周血单核细胞(PBMC)或者衍生自实验室细胞系的细胞，如Jurkat，COS-7，MCF-7，293T细胞。在将肽加入样品后的一定时间，取等份。从含有在存在引导肽的情况下温育一定时间的细胞的每个等份中，使用微阵列技术制成诱导的和抑制的基因(簇)的目录。这个时间可以是在加入肽之后3小时，或更短的时间如2或1小时。显著的，甚至可以选择更短的时间以确定肽或其衍生物或类似物对基因表达的调节作用，如30分钟或者甚至低于20分钟。
本发明的引导肽对基因控制的可检测到的作用与基因转录的其它调节子相比是令人惊奇地快速，其在延长的温育时间，从例如6-24小时的范围内典型的诱导了基因表达的可检测到的变化。在一个优选的实施方案中，细胞首先暴露于已知可以改变细胞中基因表达程序的一种化合物，随后提供本发明的肽。化合物包括受体兴奋剂，受体拮抗剂及已知诱导靶基因转录变化的其它化合物。还包括模拟胞内信号的化合物，所述信号在天然应答受体兴奋剂或拮抗剂期间产生，例如离子霉素和PMA的组合。在另一个实施方案中，将细胞与一种微生物制剂如细菌脂多糖(LPS)或者甚至完整的细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli)，Bortadella pertussis，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))接触以诱导免疫应答。典型的实验包括包含至少一种细胞的一系列平行样品，其中为每个样品提供不同的引导肽，或者其修饰物或衍生物，组合已知改变所述细胞中基因表达程序的化合物。在另一个实施方案中，这种化合物和肽同时加入细胞中。在再一个实施方案中，肽或其功能衍生物在为细胞提供已知改变细胞中基因表达谱的化合物之前或之后加入细胞中。然后，使用微阵列产生诱导或抑制的基因目录。从这个目录中，可易于确定肽对基因控制的调节作用。
本发明还提供了一种鉴别或获得信号传导分子的方法，所述信号传导分子包含能调节基因在细胞中表达的一种肽或其功能衍生物或类似物，所述方法包括为所述细胞提供一种肽或其衍生物或类似物，并确定基因转录因子的活性。在本发明的一个实施方案中，包含能调节基因表达的肽或其功能衍生物或类似物的信号传导分子使用报道基因分析法鉴别。报道基因一般是编码易于分析的蛋白质的核酸序列。它们用于置换蛋白质产物更难以分析的其它编码区域。将报道基因与感兴趣的启动子的下游融合，以便启动子始发的转录通过报道基因。通常使用的报道基因编码酶如氯霉素乙酰转移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酸酶和萤光素酶。感兴趣的报道基因还包含荧光蛋白，其用UV照射发出荧光。这些包括绿色荧光蛋白(GFP)及其光谱变体，如黄色荧光蛋白(YFP)，红色荧光蛋白(RFP)及蓝色荧光蛋白(CFP)。报道基因可附着于其它序列，以便只产生报道基因蛋白，或者以便报道基因蛋白与另一种蛋白融合(融合蛋白)。报道基因可“报道”许多不同的性质和事件启动子强度，针对反向遗传学研究是否是天然的还是修饰的；基因输送系统的效力；及翻译起始信号的效力。报道基因构建体可转染入细胞中，例如，实验室细胞系中，这可使用本领域已知的许多转染方法之一进行，包括使用DEAE-葡聚糖，磷酸钙沉淀，腺病毒或逆转录病毒介导的基因转导，阳离子脂质体转染系统(例如使用Lipofectin，Lipofectamine，DOTAP或Fugene试剂)及电穿孔技术。将脂质体转染试剂与DNA混和导致自然形成的稳定复合物，其可直接加入有或无血清的组织培养基中。这些复合物粘附于细胞表面，与细胞膜融合并将DNA释放入胞质中。这种DNA转移方法非常温和，避免了细胞毒性作用，所以细胞可被高效转染。用报道基因构建体转染细胞可以是瞬时的或稳定的。本发明提供了一种确定引导肽对基因表达的调节作用的方法，其通过将转染的细胞暴露于本发明的引导肽或其混合物，并分析所述细胞中报道基因的活性。所述调节作用可以是抑制或刺激作用。在一个优选的实施方案中，报道基因分析用于分析NFκB活性，但也可以使用设计为分析一或多个其它转录因子活性的报道基因分析。萤光素酶报道基因构建体可以置于NFκB-驱动的启动子的控制下。将转染的细胞暴露于一系列引导肽，如不同长度的肽片段，其衍生自天然发生的多肽或者其中氨基酸例如由Ala残基或D氨基酸系统置换的合成肽。在一定的温育时间之后，分析萤光素酶活性以确定引导肽对NFκB活性的作用。从这个分析中，可以获知肽是否具有任何基因调节作用，及如果是这样，则这种作用是抑制还是刺激作用。
报道基因分析可以在相对短时间内分析大量不同的样品。其可易于使用多孔平板如96孔平板进行。许多报道基因的活性可以在例如自动平板读数器中使用比色或荧光检测进行分析。因此，报道基因分析可高通量的形式使用。当进行筛选肽的基因调节作用的多次循环时，这是特别有优势的，例如在引导肽最佳化的过程中。在这些类型的分析中，优选的注意力集中于少数不同的启动子元件上。例如，细胞可以用报道基因构建体转染以检测NFκB活性，或者用报道基因构建体转染以检测AP-1活性，或者用设计为易于确定NFAT-1活性的报道子构建体转染。细胞可以用一种报道基因构建体平行转染，但也可以提供细胞一个以上的报道基因构建体。当然，为区分不同启动子的活性，优选每个启动子构建体均含有不同的报道基因。在本发明的一个实施方案中，为细胞提供一种以上的报道基因构建体以确定肽或其衍生物或类似物对转录活性的作用。例如，将细胞用两种或者甚至三种不同的质粒共转染，每种质粒均含有一种与感兴趣的独特的启动子下游融合的独特的荧光报道基因。从中，确定所述肽对每种启动子的作用。在这种实验操作中，明显优选易于彼此相区分的共转染报道基因构建体的报道基因产物。可用于共转染报道基因分析的感兴趣的报道基因包括GFP或EGFP(增强的绿色荧光蛋白)及其光谱变体，如RFP，YFP和CFP。在将所述细胞暴露于本发明的肽之后，每个荧光报道基因的活性通过使用合适的滤光器检测荧光而测定，如多频带滤光器。多频带滤光器用于多重标记并同时观测多个荧光团。每个激发器，二色性和发射器均产生分离的激发和发射能量条带。
为检测引导肽对基因表达的作用，尤其是检测抑制作用，优选的在细胞中具有明显的基础基因转录活性。为便于检测肽对基因表达的抑制作用，将细胞用一种已知的诱导基因表达明显提高的化合物进行处理。这种化合物可在为细胞提供引导肽之前，之后或同时加入。例如，将含有在NF-κB驱动的启动子控制下的萤光素酶报道基因的细胞暴露于LPS。与未处理的对照细胞相比，这将诱导萤光素酶活性提高，其中在对照细胞中只具有较低的基础水平的NF-κB依赖的转录活性。随后或同时加入怀疑能调节基因表达的至少一种肽。然后分析所述肽对LPS诱导的萤光素酶活性的作用，并与在平行样品中的萤光素酶活性对比，所述平行样品包含只接受LPS但未接受肽的细胞。
使用一种鉴别或获得信号传导分子的方法，所述信号传导分子包含能调节基因在细胞中表达的一种肽或其功能衍生物或类似物，所述方法包括提供具有肽或其衍生物或类似物的所述细胞，并确定基因转录因子的活性和/或核转位，如此处所提供可进一步随机测试寡肽或引导肽的多样性，产生自动组合的化学形式，其中许多候选信号分子以一种模式(如果希望可以是随机模式)进行测试其与代表潜在信号分子的合成肽分子文库的反应性，这可以从测试的几万个(组合)分子中快速检测出特别相关的分子。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述引导肽，或至少其活性，可在位置或空间寻址，例如以阵列方式，如果需要则借助于计算机指导定位。在阵列中，所述多个肽可例如通过其在栅格或矩阵中的位置而寻址。
本发明还提供了一种鉴别或获得信号传导分子的方法，所述信号传导分子包含能调节基因在细胞中表达的肽或其功能衍生物或类似物，所述方法包括为所述细胞提供引导肽或其衍生物或类似物，并确定基因转录因子的核转位。从细胞质至细胞核的转位是转录因子激活的一种早期测定标准。认为这是偶联胞外刺激与特异靶基因转录激活的一个关键步骤。本领域技术人员可利用多种方法分析转录因子的转录因子核转位的亚细胞定位。分析核组分中转录因子存在情况的常规方法包括EMSA(电泳迁移率变动分析)及免疫细胞化学方法。还可以使用荧光显微镜观察荧光标记转录因子的转位，如GFP-NFκB。然而，为针对引导肽调节转录因子的核转位的能力而分析大量的样品，优选的使用不太精细的方法。例如，最近可以商业获得商业试剂盒(“转位试剂盒”)(Cellomics，Inc；www.cellomics.com)，其可用于常规测定转录因子从细胞质至细胞核的转位。所述分析包括通过特异初级抗体检测转录因子，随后通过荧光染料缀合的二级抗体检测所述初级抗体。可利用转位试剂盒测定多种转录因子的激活，包括NF-κB，STAT和ATF-2。与专门的软件和仪器一起，试剂盒还包含一个完全自动化的扫描仪以鉴别化合物，如肽或其衍生物，其在细胞对细胞的基础上抑制或诱导转录激活。在标准的高密度小平板上进行分析，在完整的细胞中测定转录因子转位的速度和程度，提供生物学代表性信息。可利用的试剂盒有多种规格。含有480个分析的试剂的试剂盒可以例如用于评价相对少量(例如10一15个范围的)衍生自天然发生多肽的肽片断的基因调节活性的阶段中。这可以鉴别少数可以调节基因转录因子活性的引导肽。在随后的筛选中，这种引导肽用于产生更有效的衍生物或同源物。在这种引导肽最佳化过程中，可以使用含有针对4800个测试样品试剂的试剂盒。在另一个实施方案中，使用含有针对19200个测试样品试剂的试剂盒筛选合成肽文库，例如确定通过组合化学产生的上千个随机肽的调节作用。试剂盒组合荧光试剂和最优化制备样品的方案和分析，并不要求细胞裂解，纯化或过滤步骤。固定后，将平板在4℃避光贮存，根据细胞类型和染料，稳定一段为期为一周至几个月的时间。
本发明还具有多种其它不同的应用和使用。针对临床和医药方面的兴趣和价值，本发明提供了在活体，优选灵长类动物组织和器官中选择性控制NFkB-依赖的基因表达的机会，本质上可以上调抗炎症应答如IL-10，及本质上下调促炎症应答如TNF-α，一氧化氮(NO)，IL-5，IL-1β所介导的应答。本发明因此提供了NFkB调节肽或其衍生物在生产治疗灵长类动物局部缺血药物组合物中的应用，及提供了一种治疗灵长类动物局部缺血的方法。在此提供的一个这样的实施例中，这种客体患有局部缺血或者已经经历了缺氧或梗塞。一个典型的临床实施例是活体人体客体心肌组织的多个部位或多个区域的心肌梗塞或慢性心肌缺血。
应答多种病理生理学和发育信号时，转录因子家族NFκB/Rel家族被激活并自身形成不同类型的异源和同源二聚体以调节含有κB特异结合位点的靶基因的表达。NF-κB转录因子是Rel同源结构域定性的相关蛋白质家族的异源或同源二聚体。它们形成两个亚家族，含有激活结构域(p65-RELA，RELB和c-REL)的及没有激活结构域(p50，p52)的亚家族。原型NFκB是p65(RELA)和p50(NF-κB1)的异源二聚体。在激活的NFκB二聚体之中，已知p50-p65异源二聚体参与增强靶基因的转录，及p50-p50同源二聚体参与转录抑制。然而，已知p65-p65同源二聚体针对靶基因既具有转录激活又具有抑制活性。已经在一些真核基因的启动子中发现了与不同NFB二聚体具有不同亲和力的κB DNA结合位点，而且激活的NFκB同源和异源二聚体之间的平衡最终决定了细胞内基因表达的性质和水平。此处所用术语“NFκB-调节肽”是指一种肽或其修饰物或衍生物，其能调节转录因子NFκB/Rel家族成员的激活。NFκB的激活可导致靶基因的转录增强。其还可以导致靶基因转录的抑制。NFκB激活可在多个水平加以调节。例如，失活的NFκB二聚体在细胞质和细胞核之间通过IκB蛋白质的动态穿梭，及其通过磷酸化和蛋白酶体降解，直接磷酸化，NFkB因子的乙酰化而终止，及激活的NFκB二聚体中的NFκB亚单位的动态识别，已经全部鉴别为是NFkB激活及因此在NFκB-介导的转录过程中是关键调节步骤。因此，NFκB-调节肽能调节在转录因子NFκB/Rel家族控制下的基因的转录。调节包括转录的上调或下调。
本发明还提供了一种治疗急性或慢性炎症疾病的方法，包括为需要这种治疗的客体施用一种分子，所述分子包含一种寡肽，肽或其功能类似物。特别重要的是，本发明提供了一种肽，其能调节灵长类动物中细胞因子的产生。如图59-65所示，其显示了促炎症细胞因子如TNF-α，IL-1β，IL-8，IL-6和IL-5减少，及抗炎症细胞因子IL-10增加(图59-65)。
优选地，这种肽长度为3-15个氨基酸，而且能调节基因如细胞因子在细胞中的表达。在一个优选的实施方案中，肽是一种信号传导分子，其能穿过细胞质膜，或者换言之，肽是可透过膜的。同样，治疗急性或慢性炎症疾病的一种有用的肽是一种能降低细胞产生NO和/或TNFα的肽。降低细胞中NO和/或TNFα的产生可以通过抑制NF-κB家族的转录因子实现。这种抑制发生在不同的水平，包括肽与转录因子直接结合。同样，此处提供的肽可抑制肽的核转位，如详细描述中所示。
本发明提供了NFκB-调节肽或者至少两种这样的肽的混合物在治疗影响或被NF-κB途径影响的疾病中的应用。在一个优选的实施方案中，本发明的肽适合用于调节细胞中一或多个细胞因子产生的策略中。特别有吸引力的是肽在生产药物组合物中的应用，所述药物组合物抑制细胞中细胞因子的产生，例如通过抑制NF-κB/Rel家族转录因子控制下的细胞因子的表达。例如，本发明提供了NFκB调节肽在生产治疗脓血症的药物组合物中的应用。另外，本发明提供了NFκB-调节肽在生产治疗炭疽热的药物组合物中的应用，例如通过调节炎症细胞因子如白细胞介素的产生或者通过降低细胞中NO和/或TNFα的产生而进行。表面上不相关的疾患如哮喘，类风湿性关节炎，炎症性肠道疾病，多发性硬化，慢性阻塞性肺病，过敏性鼻炎及心血管疾病均具有炎症成分。如前所述，NF-κB是广泛炎症基因包括TNF，IL-1和细胞附着分子的一种主要的调节子，所述炎症基因产生免疫性炎症疾病。类风湿性关节炎(RA)是慢性炎症疾病的一个原型。RA动物模型的研究表明NF-κB在调节关节滑膜炎症，凋亡及增生中有重要的参与作用。因此，NF-κB在RA及其它慢性炎症病变的治疗干涉中极具吸引力。一个合理的抑制NF-κB激活的途径是调节控制NF-κB转录活性的信号级联。明显的，如详细说明书中所举例示出，用本发明的肽处理小鼠可预防小鼠发生关节炎，甚至明显降低关节炎的严重程度。因此本发明提供了一种治疗关节炎或另一种免疫炎症疾病的方法，包括为需要这种治疗的客体施用一种分子，所述分子包含一种寡肽，肽或其功能类似物，其中所述分子能调节NF-κB活性，例如导致细胞产生的NO和/或TNFα减少。在另一个实施方案中，NFκB-调节肽或者能调节另一类型转录因子的肽用于生产一种治疗骨病的药物组合物。在正常的骨重塑中，破骨细胞和成骨细胞活性是联合的，由此再吸收的骨完全由新骨组织代替。骨病一般特征在于这个平衡被干扰，由此骨的再吸收比骨的形成净增加。完全成熟的功能性破骨细胞一般产生多种细胞因子和生长因子，其增强破骨细胞形成，活性和/或存活。这些包括IL-1a和b，IL-6，IL-11，M-CSF，和TNF-α。本发明提供了一种控制，优选抑制，破骨细胞分化和成熟的方法。于是可控制破骨细胞产生细胞因子。本发明提供了NFκB-调节肽在生产药物组合物中的作用，所述药物组合物可校正骨再吸收和骨形成之间被扰乱的平衡，例如通过控制破骨细胞发生的过程而进行。这种药物组合物有利地用于治疗与破骨细胞发生增加相关的疾病，如(更年期后)骨质疏松症和关节炎。
本发明由此提供了针对局部缺血的NFkB依赖性细胞中基因表达特异性位点控制的方法和手段。心血管疾病在世界范围内是男性和女性的主要杀手之一。主要是冠心病和中风导致的，6千万以上的美国人具有一或多种类型的心血管疾病，包括高血压，先天性心血管缺陷，及充血性心力衰竭。心血管疾病每天导致2600多名美国人死亡，而且自从1900年开始，除1918年外，在美国已经成为头号杀手()。心血管疾病花费美国大约$3292亿美元。根据疾病控制和预防中心(CDC)报道，如果消除所有形式的主要心血管疾病，平均寿命将提高7年。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽或其功能衍生物或类似物用于生产一种药物组合物以治疗局部缺血。局部缺血指组织血液供应阻塞，如中风或心肌梗塞。由于这种阻塞，位于受影响的血管的内皮组织成为“粘性的”并开始吸引循环的白细胞。与内皮结合的白细胞最后迁移到脑或心组织，导致明显的组织破坏。尽管急性心肌梗塞或中风均不是由炎症直接引起的，但在急性局部缺血之后发生的许多基本病理和损害是再灌注，受影响的器官血流恢复，期间的急性炎症应答引起的。因此，此处提供了一种治疗局部缺血，包括脑血管疾病和缺血性心力衰竭的方法，所述方法包括为需要这种治疗的客体施用本发明的肽。特别地，本发明提供了一种方法以在受影响的机体部分再灌注期间控制急性炎症应答，所述方法通过施用能调节编码促炎症细胞因子的基因表达的一种肽或其修饰物。
TNF-α是一种促炎症和多功能细胞因子，其参与不同的病理过程如癌症，感染和自身免疫炎症。TNFα最近已经在多种心脏相关疾病种检测到，包括充血性心力衰竭，心肌炎，扩张性和脓毒性心肌病，及缺血性心脏病。TNF mRNA和TNFα蛋白质在患有扩张性心肌病和缺血性心脏病病人的移植心脏中检测到，但TNF-α在无病变的心肌中未检测到。尽管未知信号肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)和肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)所共有的传导途径的完全细节，但令人感兴趣地是注意到近来描述的锌指蛋白，称为肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)，已经示出涉及TNFR1和TNFR2介导的信号传导中。因此，TRAF2介导的信号传导示出激活NF-κB，导致抗氧化剂蛋白锰超氧化物歧化酶(MSOD)表达增加。先前的研究提示了TNF在心肌缺血模型中的细胞保护作用是通过TNF诱导的MSOD上调所介导的。提示促炎症细胞因子如TNF在适时心脏应激应答中可能起重要作用，通过提供应答限定心脏损伤的早期抗凋亡细胞保护信号及通过提供延时信号而进行，所述延时信号促进在发生心肌损伤之后的组织修复和重塑。鉴于这样的观测，即本发明的一些肽能上调细胞中至少一种基因，本发明提供了一种方法其提高基因产物如MSOD及其它细胞保护性的NF-κB调节的基因的表达。
当以缺血性心力衰竭作为实施例，本发明的NFκB下调肽可例如作为合成的化合物通过不同的输送方式直接导入活细胞和组织中。这些包括以下输送方式1.冠状脉内输送是使用合成肽的基于导管的输送设施实现，所述合成肽(或衍生物)悬浮于合适的缓冲液中(如盐水)，其可以使用合适的局部输送导管局部注射入(即通过管壁注入心肌中)冠状动脉中，所述导管如10mm InfusaSleeve导管(Local Med，Palo Alto，CA)，装备3.0mm×20mm血管成形术球囊，经过一个0.014英寸的血管成形术操纵导线输送。输送典型的通过首先使血管成形术球囊膨胀到30psi，然后通过局部输送导管在80psi在30秒内输送所述蛋白质而实现(可以加以修改以合输送导管)。
2.预先合成的肽(或衍生物)的冠状脉内以大丸形式灌输可以通过以下方式实现，将所述物质通过Ultrafuse-X dual lumen导管(SciMed，Minneapolis，MN)或另外的合适设备在10分钟内人工注射入冠状动脉的最接近的孔。
3.合成肽(或衍生物)的心包输送典型通过将含有肽的溶液置入围心囊中而实现。通过右侧动脉刺孔，经胸廓刺孔或者直接外科手术方法进入心包。一旦确定进入，将所述肽灌输入心包腔中并收回导管。或者，输送通过借助于缓释聚合物如肝素一藻酸盐或乙烯乙烯基乙酸酯(EVAc)而实现。在这两种情况中，一旦所述肽(或衍生物)整合入聚合物中，将希望数量的肽/聚合物插入在心外膜脂肪下，或者使用例如缝合保护心肌表面。另外，所述肽/聚合物组合物可以沿着冠状脉的外膜表面定位。
4.合成肽(或衍生物)的心肌内输送可以在经胸廓切开术后直接观测或者使用胸腔镜或通过导管而实现。在任一情况中，含有肽的溶液使用注射器或其它合适的设备直接注入心肌中。
在任何给定的点可注射最多2cc的体积，并且在每个患者中可注射多个部位(最多30次注射)。基于导管的注射在荧光镜，超声或Biosense NOGA指导下进行。在所有情况中，在导管导入左心室后，使用可控制物质局部输送的导管注射心肌的所需区域。
本领域技术人员已知合适的药物载体和运载体的范围。因此，对非肠道施用，所述化合物典型的溶解或悬浮于无菌水或盐水中。
在另一个设施方案中，本发明提供了一种调节血管发生的方法，如图20-30阐明的本发明的肽对血管分枝的作用。同样，本发明可以调节脉管发生的过程，这通过肽控制脉管厚度的能力而显而易见(图31和32)。据报道，在体外hCG对子宫内皮细胞是一种强力的血管发生因子，并提示hCG在子宫内膜血管发生中的重要作用。重要地，我们已经鉴别了可调节血管发生(见例如表5)以及脉管发生的hCG衍生的肽。本发明提供了本发明的肽在生产治疗多种疾病的药物组合物中的应用，其中所述肽能降低细胞中NO和/或TNFα的产生。所述疾病包括，但非限于脓毒性休克，炭疽热，骨病，关节炎，及局部缺血病变如脑血管疾病和缺血性心力衰竭。本发明还提供了一种治疗这些疾病的方法，包括为需要这种治疗的客体施用一种分子，所述分子包含一种寡肽，肽或其功能类似物，其中所述分子能降低细胞产生的NO和/或TNFα。另外，包含一种寡肽，肽或其功能类似物的分子包含一种能调节细胞产生一或多种细胞因子的分子。例如，治疗这些疾病的方法包括为需要这种治疗的客体施用一种NFκB调节肽。
本发明例如还涉及炭疽热的治疗。炭疽热，是由产芽孢的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)(B.anthracis)导致的疾病，一直是亚洲和非洲驯养和野生草食动物中的世界性难题，及当用作生物战争或生物恐怖主义的生物武器时在世界范围内造成威胁。人体感染发生在与感染的动物或污染的动物产品接触之后。爆发或流行是对地方区域的持续威胁，因为孢子可以在土壤中长期存在。对某些动物产品的重点控制是必需的，以预防炭疽热在非地方病的地域发生。人炭疽热通常按进入宿主体内途径而分类。皮肤炭疽热，占人炭疽热病例的主要部分，其是具有通常轻微全身症状的局部感染，特征在于环绕非常广泛的浮肿的无痛丘疹。所述丘疹在第5或第6天溃烂并发展为特征性的皮肤炭疽热黑痂。在吸入空气中传播的孢子后发生的吸入性炭疽热，摄取了污染的食物产生的胃肠道炭疽热，及在一些情况中，未处理的皮肤炭疽热的特征在于从感染的初始部位传播细菌发展为严重的败血病和血毒症。在吸入性炭疽热中，吞噬细胞将所述孢子从肺泡转运至局部淋巴结，在此所述孢子发育并繁殖细菌。然后所述细菌播散入血流中，在此其被网状内皮组织系统暂时除去。在感染后2-5天，死亡之前，突然发生急性症状，特征在于血压过低，水肿及致命的休克，这是由于广泛的败血症和血毒症所致。一般的治疗干涉必须及早开始，因为败血症感染几乎总是致命的。
本发明涉及与治疗多种疾病如炭疽热相关的调节基因在细胞中的表达，也称为基因控制。如述，炭疽热是一种动物和人类疾病，并由于作为生物战争和恐怖主义的制剂而造成明显的威胁。其中吸入炭疽芽胞杆菌的孢子的吸入性炭疽热几乎总是致命的，因为在疾病进展为抗生素治疗无效的时间点之前几乎不可能加以确诊。炭疽芽胞杆菌的主要毒性因子是一种多-D-谷氨酸荚膜和炭疽热毒素。炭疽热毒素由一同作用的三种独特的蛋白质组成两种酶，致命因子(LF)和水肿因子(EF，一种腺苷酸环化酶)；及保护性抗原(PA)。PA是一种4个结构域的蛋白质，通过其羧基末端结构域与宿主细胞表面受体结合；通过类弗林蛋白酶对其N末端结构域进行裂解使PA形成七聚体，其与毒性酶通过同源N末端结构域而高亲和性结合。所述复合物被胞吞，内涵体的酸化导致PA七聚体通过形成一个14链的β桶而插入膜中，随后毒性酶通过一种未知机制转位于细胞质中。PA与LF的二元组合当静脉内给予时足以诱导动物迅速死亡，而且某些金属蛋白酶抑制剂在体外阻断所述毒素的作用。因此，LF是治疗剂的潜在靶，所述治疗剂抑制其催化活性或阻断其与PA的结合。LF是一种蛋白质(相对分子量为90,000)，其在炭疽热的发病机理中很关键。其包含4个结构域结构域I结合炭疽热毒素的膜转位成分，PA；结构域II，III和IV一起产生一个长深凹陷，其在裂解之前持有有丝分裂原活化蛋白激酶激酶-2(MAPKK-2)的16个残基的N末端尾部。结构域II类似蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的ADP-核糖基化的毒素，但活化位点已经突变并增大了底物识别性。结构域III插入结构域II中并似乎是来自于结构域II的结构元件的重复复制。结构域IV与锌金属蛋白酶家族相关性远，含有催化中心；其也与结构域I类似。所述结构因此表明蛋白质通过基因复制，突变并与具有高度的不同寻常的特异性的酶融合过程得以进化。
蛋白质的MAPKK家族是LF的唯一已知细胞底物。在LF接近其N末端进行裂解除去了下游同源物MAP激酶的停靠序列。致命毒素对肿瘤细胞的作用，例如是抑制肿瘤生长和血管发生，最可能的是通过抑制MAPKK-1和MAPKK-2途径。然而，在炭疽热发病机理中受影响的主要细胞类型是巨噬细胞。LF已经示出可以从有丝分裂原或胞外信号调节的MAPKK-1，MAPKK-2，MAPKK-3和MAPKK-6，胞外信号调节的激酶1(ERK1)，ERK2和p38的上游激活子中裂解短的N末端片段。最近的数据显示这导致抑制促炎症介导因子，NO和肿瘤坏死因子-α(TNFα)的释放，而不是抑制产生。另外，高水平的致命毒素导致巨噬细胞在几小时内通过未知机制被裂解。最近的数据提示出现这种情况是由于生长因子途径被抑制而导致巨噬细胞死亡。这些观察资料提示在感染的早期阶段，致命毒素可降低(或延缓)免疫应答，而在感染的晚期阶段，血流中高滴度的细菌引发巨噬细胞裂解及突然释放高水平的NO和TNF-α。这可以解释死亡之前的症状，其特征在于宿主巨噬细胞炎症途径的超常刺激，导致剧烈的血压低和休克。这些症状与LPS诱导的脓毒性休克类似。应注意的是LPS-无应答小鼠，如C3H/HeJ，对炭疽热毒素也具有相当的抗性。
LF的识别位点需要存在脯氨酸(P)残基，后接一个疏水性残基或甘氨酸(G)残基，LF在此之间进行裂解。所述识别位点在脯氨酸残基的N末端的5个氨基酸残基内，还需要在所述疏水性残基之后的一个无电荷的氨基酸及至少一个荷阳性电荷的氨基酸(和无阴性电荷的氨基酸，如Asp和Glu)。序列中的其它残基在关键残基之间或在供体和受体之间提供了合适的间隔，因此其组分不是关键的，可包括任何天然或非天然氨基酸。
本发明提供了一种调节基因在细胞中表达的方法，包括为所述细胞提供一种信号传导分子，所述分子包含一种小肽，即寡肽或其功能类似物或衍生物。这种分子在此也称为NMPF或者通过数字引用。由于目前易于合成这样氨基酸序列相对短的小肽，及功能类似物和衍生物，因此本发明提供了一种调节基因表达的方法，使用易于获得的合成化合物如合成肽或其功能类似物或衍生物进行。
本发明还提供了一种治疗炎症病变的方法，包括为需要这种治疗的客体施用一种分子，所述分子包含一种寡肽或其功能类似物或衍生物，所述分子能降低细胞产生的NO，特别是其中所述分子又能调节细胞中存在的基因转录因子的转位和/或活性，尤其其中所述基因转录因子包含NF-κB/Rel蛋白。有利的，本发明提供了一种方法，其中调节基因转录因子的转位和/或活性可以调节细胞产生的TNF-α，特别是其中TNF-α的产生被降低。考虑到TNF-α的产生对几乎所有，如果不是全部，炎症病变是重要的，因此降低TNF-α的产生可明显减轻，或缓和在此所述的众多炎症病变。特别地，本发明提供了一种方法，其中所述炎症病变包括急性炎症病变，所述方法特别用于治疗炭疽热相关的疾病，尤其当考虑到在炭疽热时，NO和TNF-α的降低将明显缓和疾病的进程。表6列出了具有这种调节作用的本发明的寡肽。
特别地，本发明提供了一种治疗方法，其中所述治疗包括为客体施用一种药物组合物，所述药物组合物包含能降低细胞产生NO的一种寡肽或其功能类似物或衍生物，优选的，其中所述组合物包含能降低细胞产生NO的至少两种寡肽或其功能类似物或衍生物，这种组合的实施例可以在表6的指导下选择，从而足以选择两或多种具有希望作用的寡肽，例如其中至少两种寡肽选自LQGV，AQGV和VLPALP。
本发明还提供了一种分离的，优选合成的，寡肽或其功能类似物或衍生物或者这种寡肽或其类似物或衍生物的混合物，其能降低细胞产生的NO。考虑到这些细胞在炎症过程中的关键作用，这种细胞优选是巨噬细胞或DC系。本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明的一种寡肽或其功能类似物或衍生物，或者包含至少两种寡肽或其功能类似物或衍生物，其能降低细胞产生的NO。另外，本发明提供了能降低细胞产生的NO的寡肽或其功能类似物或衍生物在生产一种药物组合物中的应用，所述药物组合物通过降低治疗客体体内巨噬细胞或DC产生的NO而治疗炎症病变。
肽的功能类似物或衍生物定义为一种氨基酸序列，或其它序列单体，其已经被改变以至所述序列的功能性质基本相同，在数量上非必需相同。可以多种方式提供一种类似物或衍生物，例如通过保守氨基酸取代。也可以设计肽模拟化合物，其功能或结构与作为起始点的原始肽相似，但是它们例如由非天然发生的氨基酸或聚酰胺组成。就保守氨基酸取代而言，一个氨基酸残基用具有一般相似性质(大小，疏水性)的另一个残基取代，由此全部功能很可能不受明显影响。然而，通常更多地需要改良特异性功能。通过系统改良氨基酸序列的至少一种希望的性质也可以提供一种衍生物。这可以，例如通过Ala-扫描和/或置换网状作图方法进行。使用这些方法，基于初级氨基酸序列，产生许多不同的肽，但每种肽均含有至少一个氨基酸残基取代。氨基酸残基可以用丙氨酸置换(Ala-扫描)或者通过任何其它氨基酸残基置换(置换网状作图)。通过这种方式合成原始氨基酸序列的许多位置变体。筛选每个位置变体的特异性活性。产生的数据用于设计有一定氨基酸序列的改良的肽衍生物。
衍生物或类似物也可以例如通过用D氨基酸残基取代L氨基酸残基而产生。这种取代产生实际上不天然发生的肽，可以改良氨基酸序列的性质。例如以反向倒置形式提供已知所有D氨基酸活性的肽序列，从而可以保留活性并提高半衰期。通过产生原始氨基酸序列的许多位置变体并筛选特异性活性，可以设计具有进一步改良特性的包含这种D氨基酸的改良的肽衍生物。
本领域技术人员完全能产生一种氨基酸序列的类似化合物。这可以例如通过筛选肽文库而进行。这种类似物基本具有相同功能性质的序列，在数量上非必需相同。同样，肽或类似物可以例如通过为它们提供(末端)半胱氨酸而环化，例如与赖氨酸或半胱氨酸或具有可以连接或多聚体化的侧链的其它化合物连接而二聚体化或多聚体化，产生串联或重复构型，缀合或另外与本领域已知的载体连接，只要是可以分离的不稳定连接即可。
本发明还提供了调节基因在细胞中表达的一种信号传导分子，所述分子包含一种小肽或其功能类似物或衍生物。令人惊讶地，本发明人发现小肽可作为调节信号转导途径和基因表达的信号传导分子。具有调节一或多个基因在细胞中表达的这种信号传导分子的小肽的功能类似物或衍生物可以通过此处提供的发现这种信号传导分子的多种方法中的至少一种方法鉴别或获得。
例如，此处提供了一种鉴别或获得一种信号传导分子的方法，所述分子包含能调节基因在细胞中表达的一种肽或其功能衍生物或类似物，所述方法包括提供具有肽或其衍生物或类似物的细胞并确定一或多个基因转录因子的活性和/或核转位。这种活性可以在多种方式中使用对研究的特异性转录因子特异的手段和/或方法确定。在详细说明书中，本发明提供了研究NF-κB/Rel蛋白转位和/或活性的方法，但当然研究可获得或可设计这种工具的任何其它转录因子的转位和或活性可能更容易。一种这样的其它转录因子是例如上述的干扰素α刺激因子。在这项研究中的其它有用转录因子包含c-Jun，ATF-2，Fos及其复合物，ELK-1，EGR-1，IRF-1，IRF-3/7，AP-1，NF-AT，C/EBPs，Spl，CREB，PPAR-γ，及STAT蛋白等。考虑到许多蛋白质进行蛋白酶解从而产生寡肽片段，许多在完整蛋白质之前的片段甚至已经具有功能，因此确定这种蛋白质(所述蛋白质是例如在详细说明书中所给出的那些非扩展列表，但可以例如认为MAPKK-2可产生一种肽MLARRKPVLPALTINP，随后产生包含MLARRKP或MLAR或VLPALT或VLPAL的肽，但NO合成酶在适当的蛋白酶解之后可产生肽FPGC或PGCP，GVLPAVP，LPA，VLPAVP或PAVP)的寡肽片段参与调节基因表达的反馈机制，很可能通过调节转录因子对基因表达的作用而进行。另外，蛋白质的寡肽片段(在详细说明书中所列出的那些非扩展列表)也可以调节胞外成分如因子XIII(因子XIII的寡肽片段的实施例是LQGV，LQGVVPRGV，GVVP，VPRGV，PRG，PRGV)或激活的C蛋白(APC)的活性，从而最后导致调节胞内信号转导途径和基因表达。
如述，本发明提供了作为信号传导分子的活性寡肽。为可以改良这种信号传导分子的生物可利用性(其在药物学，尤其当人工生产时有益)，本发明还提供了一种确定一种小肽或其衍生物或类似物是否可作为本发明的功能性信号传导分子的方法，所述方法进一步包括确定所述信号传导分子是否是可透过膜的，及如上所解释的，在通过质膜后及没有与细胞表面受体结合，是否发挥其基因调节作用。这种信号传导分子，即合成化合物是此处提供的一种小肽或其功能类似物或衍生物，因此优选不通过细胞表面受体介导的信号传导的随后一系列胞内事件而相互作用，而优选具有直接胞内活性的。
使用鉴别或获得一种信号传导分子的方法，所述信号传导分子包含能调节基因在细胞中表达的一种肽或其功能衍生物或类似物，所述方法包括提供具有一种肽或其衍生物或类似物的细胞及确定基因转录因子的活性和或核转位，如此处所提供，进一步可以(如果需要随机)测试寡肽或引导肽的多样性，产生自动组合的化学形式，其中大量候选信号分子以一种(如果需要随机)方式测试其与代表潜在的信号分子的合成肽的分子文库的反应性，这可以在几万个测试的(组合)分子中快速检测特别相关的分子。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述引导肽可位置或空间寻址，例如以阵列方式，如果需要则借助于计算机指导定位。在阵列中，所述大多数肽是例如可通过其在栅格或矩阵中的位置而寻址的。测试的这种肽片段或寡肽(在此也称为引导肽)的长度为至少2-3个氨基酸，不超过大约30个氨基酸，但优选并最适合生物体的明显情况是，其中内源蛋白质的这些分解产物发挥调节作用，这种肽更小，例如小于16，优选小于10，甚至更优选小于7个氨基酸，或者甚至长度只有4-5个氨基酸。
本发明例如提供了一种获得关于寡肽，或其修饰物或衍生物调节基因表达的能力或趋向信息的过程或方法，所述方法包括步骤a)将所述寡肽，或其修饰物或衍生物与至少一种细胞接触；b)确定所述细胞中的或衍生自其中的至少一种基因产物的存在情况。优选所述寡肽包含相当于天然发生的多肽，如hCG或MAPKK，或另外的激酶的片段的氨基酸序列，其是源于植物或动物细胞，或者是真核或原核起源，或者细胞中调节蛋白的一种合成酶，如其中所述调节蛋白是(促)炎症介导因子，如细胞因子。一些候选蛋白和肽片段列于详细说明书中，从本发明人的观点出发其对这种分析是首选的，但本领域及生物技术特定领域中的技术人员应立即意识到针对这种分析选择的蛋白质根据与其领域相关的目的而定。本发明例如提供了一种方法以获得关于一种寡肽，或其修饰物或衍生物调节基因表达的能力或趋向的信息，其中所述方法可以(如果需要随机)测试寡肽或引导肽的多样性，产生自动组合的化学形式，其中大量候选信号分子在一种(如果需要随机)方式中被测试其与表示潜在信号分子的合成肽的分子文库的反应性，可以从几万个测试的分子(组合)中快速检测特别相关的分子。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述引导肽可位置或空间寻址，例如在阵列方式中，如果需要则借助于计算机指导定位。在阵列中，所述大多数肽是例如可通过其在栅格或矩阵中的位置而寻址。测试的这种肽片段或寡肽(在此也称为引导肽)的长度为至少2-3个氨基酸，不超过大约30个氨基酸，但优选并最适合生物体的显而易见的情形，其中内源蛋白质的这些分解产物发挥调节作用，这种肽更小，例如小于16，优选小于10，甚至更优选小于7个氨基酸，或者甚至长度只有4-5个氨基酸。
特别地，本发明提供的方法还包括步骤c)包括确定未与所述寡肽，或其修饰物或衍生物接触的细胞中或衍生自其中的基因产物的存在情况，并确定在b步骤中发现的基因产物与c步骤中发现的基因产物的比率，这可易于用目前的基因芯片技术(见例如详细说明书中所述)及本领域已知的相关表达图方法进行。
本发明提供了另一种鉴别或获得关于信号传导分子(或者考虑到合成一般是一种小肽的所述分子的下一个步骤，所述信号传导分子自身是完整的)信息的方法，所述信号传导分子包含能调节基因在细胞中表达的一种肽或其功能衍生物或类似物，所述方法包括提供具有一种肽或其衍生物或类似物的细胞，并确定在所述细胞中表达的至少一种基因的相对上调和/或下调。所述上调可传统的通过在已经提供具有所述肽或其衍生物或类似物的细胞之后，确定细胞是否产生更多的(在上调的情况中)或更少(在下调情况中)的基因表达产物如mRNA或蛋白质而进行研究，其例如通过Northern或Western印迹或者通过PCR检测核酸，或者通过免疫学检测蛋白质进行。当然，可以组合本发明的多种方法以更好地分析所述肽或衍生物或类似物的功能类似物。另外，也可以容易的研究在所述细胞中表达的多个基因或基因簇的相对上调和/或下调，使用与一个阵列结合的或者以阵列形式产生的预定或已知相关核酸序列或其独特片段的可位置或空间寻址的文库，使用例如一个核酸文库或所谓的基因芯片表达分析系统进行研究。然后将已经提供具有所述肽或其衍生物或类似物的细胞裂解物或者细胞质和/或细胞核制品与所述文库接触，并确定例如mRNA与文库的各个核酸的相对结合情况，如在详细说明书中进一步的描述。
可作为信号传导分子调节基因在细胞中表达的小肽的功能类似物或衍生物，也可以通过鉴别或获得包含能调节基因在细胞中表达的寡肽或其功能衍生物或类似物的信号传导分子的方法鉴别或获得，包括提供一种肽或其衍生物或类似物，并确定所述肽或其衍生物或类似物和与基因控制相关因子的结合情况。这种基因控制相关的因子可以是与转录(初始或终止)，初级转录物加工，mRNA的稳定或不稳定及mRNA翻译相关的任何因子。
肽或其衍生物或类似物与这种因子的结合可以通过本领域已知的多种方法确定。传统地，肽或衍生物或类似物可以(放射性)标记，并通过检测标记的肽-因子复合物而确定与所述因子的结合情况，例如通过电泳，或者本领域已知的其它分离方法。然而，为确定与这种因子的结合，也可以应用阵列技术，如与肽文库一起使用，包括提供多种肽或其衍生物或类似物，并确定至少一种肽或其衍生物或类似物与基因控制相关因子的结合情况。
在一个优选的实施方案中，基因控制相关因子包括一种转录因子，如NF-κB-Rel蛋白质或希望研究的另一种转录因子。当确定本发明的功能类似物与这种因子结合时，当然可以进一步分析所述类似物，通过提供具有所述肽或其衍生物或类似物的细胞，并确定细胞中基因转录因子的活性和/或核转位，和/或通过提供具有所述肽或其衍生物或类似物的细胞并确定在所述细胞中表达的至少一种基因的上调和/或下调情况而进行分析。
本发明因此提供了一种信号传导分子，其用于调节基因在细胞中的表达和/或用于降低细胞产生的NO，及通过应用本发明的方法可鉴别或获得。这种信号传导分子的实施例如可选自寡肽LQG，AQG，LQGV，AQGV，LQGA，VLPALPQVVC，VLPALP，ALPALP，VAPALP，ALPALPQ，VLPAAPQ，VLPALAQ，LAGV，VLAALP，VLPALA，VLPALPQ，VLAALPQ，VLPALPA，GVLPALP，GVLPALPQ，LQGVLPALPQVVC，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，RPRCRPINATLAVEK，EGCPVCITVNTTICAGYCPT，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，SIRLPGCPRGVNPVVS，LPGCPRGVNPVVS，LPGC，MTRV，MTR，VVC，QVVC及其功能类似物或衍生物。
尽管更小的分子，尤其是寡肽大小更小的分子已经示出特殊效力，但本发明的信号传导分子优选的大小为至多30-40个氨基酸。令人惊讶地，本发明提供了这样的见解，即基因表达可以被小肽调节或控制，所述小肽很可能是较大多肽的分解产物，所述较大多肽例如是绒毛膜促性腺激素(CG)和生长激素或生长因子如成纤维细胞生长因子，EGF，VEGF，RNA 3′末端磷酸环化酶和CAP18。原则上，这种调节肽序列可以衍生自原核细胞和/或真核细胞产生的任何蛋白质多肽分子的一部分，而且本发明提供了这样的见解，即多肽的分解产物，优选在此所提供大小的寡肽，是自然用作调节基因表达的信号传导分子。特别地，作为信号传导分子，所提供的一种(合成)肽可得自或衍生自β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)，优选的来自带切口的β-HCG。从前认为带切口的β-HCG的分解产物参与免疫调节(PCT国际申请WO99/59671)或者治疗消耗性综合征(PCT国际申请WO97/49721)，但与调节基因表达的关系在这些出版物中未被指出。当然，这种寡肽，或其功能等价物或衍生物可能得自或衍生自其它蛋白质，所述其它蛋白质进行分解或蛋白酶解并接近于基因调节级联。优选地，所述肽信号传导分子得自具有至少10个氨基酸的肽，如具有以下氨基酸序列的肽MTRVLQGVLPALPQVVC，SIRLPGCPRGVNPVVS，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT，CALCRRSTTDCGGPKDHPLTC，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，CRRSTTDCGGPKDHPLTC，TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ。
不希望被理论所束缚，在此假定不包括一种未曾预料的基因调节模式。将多肽，如内源CG，EGF等，以及病原体多肽如病毒，细菌或原生动物多肽，进行分解为独特的寡肽，例如通过胞内蛋白酶解进行。独特的蛋白酶解酶在细胞中可广泛获得，例如在真核细胞溶酶体或蛋白酶体系统中。一些所得分解产物是3-15个氨基酸，优选4-9个氨基酸，最优选4-6个氨基酸长度的寡肽，令人惊奇地是其对细胞不是没有任何功能或作用，在此表明其可能在内源多肽的分解中通过反馈机制作为调节基因表达的信号传导分子参与，这通过例如肽LQGV，VLPALPQVVC，LQGVLPALPQ，LQG，GVLPALPQ，VLPALP，VLPALPQ，GVLPALP，VVC，MTRV和MTR调节基因转录因子如NF-κB的活性或转位而表明。本发明提供了上述的这些寡肽的合成形式及这些分解产物的功能类似物或衍生物，以调节细胞中基因的表达，并用于校正基因表达中误差或治疗疾病的方法中。寡肽如LQG，AQG，LQGV，AQGV，LQGA，VLPALP，ALPALP，VAPALP，ALPALPQ，VLPAAPQ，VLPALAQ，LAGV，VLAALP，VLPALA，VLPALPQ，VLAALPQ，VLPALPA，GVLPALP，GVLPALPQ，LQGVLPALPQVVC，SIRLPGCPRGVNPVVS，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，LPGCPRGVNPVVS，LPGC，MTRV，MTR，VVC，或其较长序列的功能类似物或衍生物(包括分解产物)是特别有效的。
通过使用本发明表述的见解，在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种调节细胞中基因表达的方法，包括提供信号传导分子给所述细胞，所述信号传导分子包含一种寡肽或其功能类似物或衍生物，其中所述信号传导分子是可透过膜的，由此其可进入细胞。大多数所述小肽具有变成包含于胞内的固有倾向，但在此提供的信号传导分子也可以具有额外的肽序列，如富集精氨酸或赖氨酸的氨基酸序列，其可以提高跨脂双层膜的内在化，及可能通过内在的蛋白酶解活性在稍后切除。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种调节细胞中基因表达的方法，所述方法包括提供信号传导分子给所述细胞，所述信号传导分子包含一种小肽(氨基酸序列)或其功能类似物或衍生物，其中信号传导分子调节NF-κB/Rel蛋白质转化或转位，正如所述，NF-κB最初鉴别是一种基因转录因子，其与所述基因中Igκ轻链增强子元件结合并确信是B细胞特异性的。然而，随后的研究表明NF-κB/Rel蛋白遍在表达，并作为转录因子在调节许多基因的表达中起重要作用，特别是参与免疫，炎症，发育和凋亡进程。NF-κB相关的基因转录因子可以通过不同刺激激活，如微生物产物，促炎症细胞因子，T和B细胞有丝分裂原，及物理和化学刺激。NF-κB反过来调节许多细胞因子，趋化因子，粘附分子，急性期蛋白和抗微生物肽的可诱导表达。
NF-κB代表一组结构相关的及进化保守的基因转录因子。迄今为止，已经描述了5种哺乳动物NF-κB蛋白，称为Rel(c-Rel)，RelA(p65)，RelB，NF-κ-B1(p50及其前体p105)，及NF-κ-B2(p52及其前体p100)。NF-κB蛋白质可存在同源或异源二聚体，而且尽管大多数NF-κB二聚体是转录激活因子，但p50/p50和p52/p52同源二聚体通常抑制其靶基因的转录。在果蝇中，已经鉴别并定性了3种NF-κB同源物，称为Dorsal，Dif和Relish。在结构上，所有NF-κB/Rel蛋白均呈现高度保守的NH2-末端Rel同源结构域(RHD)，其负责与DNA结合，二聚体化和与抑制蛋白如IκBs相关。在静息细胞中，NF-κB/Rel二聚体与IκBs结合并在细胞质中保持失活形式。与NF-κB相同，IκBs也是含有7个已知哺乳动物成员和1个称为Cactus的果蝇IκB的多基因家族的成员，所述哺乳动物成员包括IκBa，IκBβ，Iκbγ，IκBε，Bcl-3，前体Rel-蛋白，p100和p105。IκB家族特征在于存在锚蛋白重复的多个拷贝，其是蛋白质之间相互作用基序，通过RHD与NF-κB相互作用。在适当刺激下，IκB通过IκB激酶(IKKs)磷酸化，通过泛素连接酶复合物被多泛素化，并通过26S蛋白酶体降解。因此，NF-κB被释放并转位入细胞核中以引起基因表达。
NF-κB相关的转录因子调节在先天免疫应答中起重要作用的许多基因的表达。这种NF-κB靶基因包括编码细胞因子(例如IL-1，IL-2，IL-6，IL-12，TNF-α，Ltα，LTβ和GM-CSF)，粘附分子(例如ICAM，VCAM，内皮白细胞粘附分子[ELAM])，急性期蛋白(例如SAA)及可诱导的酶(例如iNOS和COX-2)的那些基因。另外，最近已经表明一些进化保守的抗微生物肽，例如β-防卫素，也由NF-κB调节，情况与果蝇相似。除了调节参与先天免疫的分子的表达之外，NF-κB在对获得性免疫重要的分子如MHC蛋白的表达及关键的细胞因子如IL-2，IL-12和IFN-γ的表达也起作用。最后，NF-κB在全部的免疫应答中均起重要作用，其通过影响对调节凋亡过程关键的基因的表达而进行，如c-IAP-1和c-IAP-2，Fas配体，c-myc，p53，及细胞周期蛋白D1。
在正常条件下，NF-κB在微生物和病毒侵染下迅速激活，这种激活通常与宿主对感染的抗性相关。然而，NF-κB的持久激活可导致促炎症因子如IL-12 and TNFα过量产生，引起组织损害，如胰岛素依赖型糖尿病，动脉粥样硬化，Crohn′s疾病，器官衰竭，甚至宿主死亡，如在细菌感染引起的脓毒性休克中。令人感兴趣地注意到为在宿主中存活，某些病原体如日本血吸虫(Schistosoma japonica)，鲍特菌(Bordetella)，耶尔森氏菌(Yersinia)，鼠弓形虫和非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus)具有进化机制以通过抑制N-κB激活而抵消或逃避宿主系统。另一方面，一些病毒，包括HIV-1，CMV和SV-40，利用NF-κB作为在感染部位激活的一种宿主因子。
另外，本发明提供了一种方法以探究在抗原呈递细胞如树突细胞中应答暴露微生物的基因表达中的变化，通过树突细胞应答微生物的基因表达图进行分析，所述微生物例如是细菌如大肠杆菌，或其它病原性细菌，真菌或酵母如白色念珠菌(Candida albicans)，病毒如流感病毒，及探究用本发明的信号传导分子(同时)治疗这些疾病的作用。例如，将人单核细胞衍生的树突细胞与一或多种病原体一起培养1-36个小时，并使用代表一(大或小)系列基因的寡核苷酸阵列分析基因表达。当所述病原体调节一系列不同数目基因表达时，这些基因根据起表达和功能的动力学加以分类。通常地，在暴露于病原体4小时之内，与病原体识别和吞噬作用相关的基因将被下调，而在暴露后8小时针对抗原处理和呈递的基因是上调的。用本发明的信号传导分子处理这种树突细胞(用病原体同时或之前或之后进行处理所述细胞)，可以研究本发明的信号传导分子对病原体对抗原呈递细胞作用的作用。
简而言之，本发明令人惊讶的提供了一种能调节细胞中基因表达的信号传导分子，所述分子是一种短肽或其功能类似物或衍生物，优选长度至多为30个氨基酸。在一个更优选的实施方案中，所述肽是一种寡肽或其功能类似物或衍生物，其长度为大约3-15个氨基酸，优选4-12个氨基酸，更优选4-9个氨基酸，最优选4-6个氨基酸。当然，这种信号传导分子可以更长，例如通过用更多的氨基酸或其它侧链基团将其延伸(N-和/或C-末端)，当所述分子进入最终目的地时，这些延伸部分可(酶促)切除。这种延伸甚至可优选预防信号传导分子不合时宜地激活；然而，所述分子的核心或活性片段包含前述寡肽或其类似物或衍生物。本发明的这种肽通过与传统已知的膜不可通透的信号传导分子不同的方式调节基因表达而发挥其生物学功能，所述膜不可通透的信号传导分子如乙酰胆碱，生长因子，胞外基质成分，(肽)-激素，神经肽，凝血酶，即不通过细胞表面受体介导的信号传导起作用。
特别地，本发明提供了一种NF-κB/Rel蛋白激活的调节因子，其包含本发明的信号传导分子。对这种调节因子将进行广泛搜寻。另外，本发明提供了本发明信号传导分子在生产调节基因表达的药物组合物中的应用。
同样，本发明提供了一种治疗骨病如骨质疏松的方法，包括为需要这种治疗的客体施用包含一种寡肽或其功能类似物的一种分子，所述分子能调节细胞产生NO和/或TNFα。这种治疗方法在不再获益于天然来源的一些在此提供的信号传导分子，如生理上衍生自hCG及其分解产物的信号传导分子的绝经期后的妇女中特别有效，。另外，本发明提供了一种治疗与成纤维细胞的TNFα活性相关的炎症病变的方法，所述病变如慢性关节炎或滑膜炎，所述方法包括为需要这种治疗的客体施用一种包含寡肽或其功能类似物的分子，其中所述分子能调节细胞中存在的基因转录因子，特别是NF-κB因子的转位和/或活性。这种治疗可以通过系统施用本发明的信号传导分子而实现，但也可以在关节，关节囊或腱鞘局部施用。所述分子可选自表6所示分子，或者在本发明方法中鉴别的。优选当所述治疗包括为客体施用一种药物组合物时，所述药物组合物包含还能降低细胞产生NO的寡肽或其功能类似物，例如其中所述组合物包含至少两种寡肽或其功能类似物，每种均能降低细胞产生的NO和/或TNFα，尤其其中至少两种寡肽选自LQGV，AQGV和VLPALP。
另外，本发明提供了能降低细胞产生NO和/或TNFα的寡肽或其功能类似物在生产一种药物组合物中的应用，所述药物组合物用于治疗炎症病变或绝经期后病变，或骨病如骨质疏松，或者用于导致体重下降。术语“药物组合物”是指单独的活性信号传导分子或者含有所述信号传导分子及一种药剂学可接受的载体，稀释剂或赋形剂的组合物。在详细说明书中描述的寡肽的可接受的稀释剂是例如生理盐水或磷酸盐缓冲盐溶液。在本发明的一个实施方案中，将一种信号分子以有效浓度系统施用于动物或人，例如通过静脉内，肌内或腹膜内施用。另一种施用方式包括体内或ex vivo器官或组织灌注，灌注液包含本发明的信号传导分子。也可以应用局部施用例如药膏或喷雾，例如在皮肤或粘膜表面例如口腔，鼻腔和/或生殖器炎症的情况中在关节，关节囊，腱鞘，脊髓内或四周神经束分叉的部位，疝气部位，心或脑梗塞部位或四周等可进行局部施用。所述施用可以是单一剂量施用，各种剂量按顺序间断施用，或者持续施用一段时间以足以可以基本上调节基因表达。在持续施用的情况中，施用时间根据许多因素加以变化，这些因素为本领域技术人员所已知。
活性分子的施用剂量可以在广泛范围内变化。可施用的活性分子的浓度限于在较低值的效力和在较高值的溶解性之间。对特定患者的最佳剂量应该并且可以由医生或专业人员根据熟知的相关因素加以确定，所述因素如患者的病情，体重和年龄等。
所述活性分子可在合适的载体中直接施用，所述载体如磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)或者于乙醇或DMSO中的溶液。然而，根据本发明优选的实施方案，所述活性分子通过使用一种药物输送系统经单一剂量输送而施用，所述系统如持续释放输送系统，其能使活性分子以足以调节基因表达的所需浓度保持一段时间。一种合适的药物输送系统是药物学失活的或者至少是可耐受的。优选不是免疫原性的或者导致炎症反应的，并应允许活性分子释放以在希望的时间内保持有效的水平。本领域已知适于持续释放的大量可选择的方法并包含在本发明范围内。合适的输送载体包括但非限于以下物质微囊体或微球体，脂质体及其它基于脂质的释放系统，粘性灌输液，可吸收的和/或可生物降解的机械屏障和移植体，及聚合的输送物质如聚环氧乙烷/聚环氧丙烷封阻共聚物，聚酯，交联的聚乙烯醇，聚酐，聚甲基丙烯酸酯和聚甲基丙烯酰胺水凝胶，阴离子碳水化合物聚合物等。本领域熟知有益的输送系统。
完成活性分子释放的一种特别合适的配方包括由生物可降解聚合物制成的可注射微囊体或微球体，所述聚合物如聚(dl-丙交酯)，聚(dl-丙交酯-共-乙交酯)，聚己内酯，聚乙交酯，聚乳酸共乙交酯，聚(羟基丁酸)，聚酯或聚甲醛。包含直径微大约50-大约500微米的微囊体或微球体的可注射系统具有比其它输送系统的优点。例如，它们一般使用较低活性的分子并可以由医辅人员施用。另外，这种系统通过选择微囊体或微球体的大小，药物荷载及施用剂量而固有地适应设计不同的药物释放持续时间和速度。另外，它们能通过γ射线照射而成功灭菌。
本领域技术人员熟知微囊体和微球体的设计，制备和应用，关于这些要点的详细信息可在文献中获得。生物可降解的聚合物(如丙交酯，乙交酯和己内酯聚合物)也可以用于除了微囊体和微球体之外的配方中，例如根据本发明含有活性分子的这些聚合物的预制膜或喷雾于膜上也是适合应用的。包含所述活性分子的纤维或细丝也包含在本发明范围内。
根据本发明适于单一剂量输送活性分子的另一种特别合适的配方包括脂质体。活性分子包装于脂质体或多层囊泡中对于定向药物输送及延长药物停留时间是所熟知的方法。荷载药物的脂质体的制备和应用是本发明技术人员所熟知的，在文献中已充分论证。
根据本发明另一种合适的单一剂量输送活性分子的方法包括使用粘性灌输。在这种技术中，高分子量的载体与所述活性分子混合使用，产生一种结构，其产生具有高粘性的一种溶液。合适的高分子量载体包括但非限于以下物质葡聚糖和环葡聚糖；水凝胶；(交联的)粘性物质，包括(交联的)粘弹性物质；羧甲基纤维素；透明质酸及硫酸软骨素。本领域技术人员熟知荷载药物的粘性灌输液的制备和应用。
根据另一种方法，所述活性分子可与可吸收的机械屏障如氧化再生的纤维素组合施用。所述活性分子可以与这种屏障共价或非共价的(例如离子)结合，或者其可简单地分散于其中。
本发明提供的一种药物组合物特别用于通过抑制NF-κB/Rel蛋白激活而调节基因表达。
NF-κB/Rel蛋白是一组结构相关的及进化保守的蛋白质(Rel)。熟知的是c-Rel，RelA(p65)，RelB，NF-κB1(p50及其前体p105)及NF-κB2(p52及其前体p100)。大多数NF-κB二聚体是转录的激活因子；p50/p50及p52/p52同源二聚体抑制其靶基因的转录。所有NF-κB/Rel蛋白均具有高度保守的NH2-末端Rel同源结构域(RHD)。RHD负责与DNA结合，二聚体化，并与已知为IκBs的抑制蛋白相关。在静息细胞中，NF-κB/Rel二聚体与IκBs结合并以失活形式保留在细胞质中。IκBs是多基因家族的成员(IκBα，IκBβ，IκBγ，IκBε，Bcl-3，及其前体Rel-蛋白，p100和p105)。锚蛋白重复的多个拷贝与NF-κB通过RHD相互作用(蛋白质-蛋白质相互作用)。在适当的刺激下，IκB通过被IκB激酶(IKKs)磷酸化，通过泛素连接酶复合物被多泛素化，并通过26S蛋白酶体降解。NF-κB释放并转位入细胞核中引起基因表达。
NF-κB对基因表达的调节包括先天免疫应答，如通过细胞因子IL-1，IL-2，IL-6，IL-12，TNFα，LT-α，LT-β，GM-CSF；粘附分子(ICAM，VCAM，内皮白细胞粘附分子[ELAM])的表达，急性期蛋白(SAA)，可诱导酶(iNOS和COX-2)及抗微生物肽(β-防卫素)。就获得性免疫而言，MHC蛋白IL-2，IL-12和IFN-α由NF-κB调节。全部免疫应答的调节包括调节对调节凋亡关键的基因(c-IAP-1和c-IAP-2，Fas配体，c-myc，p53及细胞周期蛋白D1)。
考虑到NF-κB及相关转录因子是最重要的促炎症转录因子，并鉴于本发明提供了一种信号传导分子，如可以抑制NF-κB及可能也抑制其它促炎症转录因子的寡肽及其功能类似物或衍生物，在此也称为NF-κB抑制因子，因此本发明提供了一种调节NF-κB激活的基因表达，尤其抑制所述表达并因此抑制重要的促炎症途径的方法。
这种抑制所述促炎症途径的效力的结果是广泛而深远的。本发明例如提供了一种减轻或治疗炎症性呼吸道疾病如哮喘的方法。一般地，哮喘患者表现出呼吸道内细胞的NF-κB持续激活。为这些患者，例如通过气雾剂提供本发明的信号传导分子，如LQGV或AQGV或MTRV或其功能类似物或衍生物，将通过抑制细胞的NF-κB激活而减轻这些个体的炎症呼吸道反应。可方便地生产这种将信号传导分子置于脂质体中的组合物。
正如所述，炎症包括相继激活信号传导途径，导致促炎症和抗炎症介导因子的产生。考虑到更多的注意力集中于引发炎症的促炎症途径，因此关于切断炎症并解决炎症反应的机制相对了解较少。认为转录因子NF-κB在诱导促炎症基因表达中具有重要作用，并引起将其作为治疗炎症疾病新目标的兴趣。然而，在炎症发作期间产生的白细胞NF-κB激活也与促炎症基因表达相关，而这种在炎症消退期间的激活与抗炎基因的表达及诱导细胞凋亡相关。在炎症消退期间抑制NF-κB延长炎症反应并防止凋亡。这示出NF-κB具有体内抗炎作用，包括调节炎症消退。本发明提供了一种工具以在末期调节炎症，本发明提供的信号传导分子或调节因子可以在体内在炎症反应的不同阶段调节NF-κB途径，在一个特殊的实施方案中，本发明提供了一种NF-κB调节因子，以用于消退炎症，例如通过调节白细胞凋亡而进行。有益的寡肽可在促进休克的那些因子中发现。
本发明还提供了一种方法以减轻或治疗新生儿肺部疾病，这种疾病也称为早产儿慢性肺部疾病，这是通常见于早产儿的一种病变，其进展为一种长期的肺部炎症或支气管肺部发育异常。用本发明提供的NF-κB抑制因子，如寡肽LQGV或其功能类似物或衍生物治疗这种新生儿，可以预防或减轻这种肺部疾病。
近年来骨生物学中的进展使得可洞察骨病的发病机理。本发明还提供了一种治疗绝经期后病变如骨质疏松症的方法，包括调节并抑制破骨细胞分化及抑制TNFα诱导的成骨细胞程序死亡，从而限制在绝经期后的妇女中非常显著的骨结构的分解，已知绝经期后妇女不再具有天然来源的hCG并因此缺乏hCG衍生的信号分子的调节作用。本发明因此提供了一种治疗骨病的如骨质疏松症(其通常见于但非仅见于绝经期后妇女)的方法。另外，本发明提供的NO和TNFα调节因子在牙周炎中抑制炎症反应和骨损失。另外，考虑到在强直性脊椎炎中在TNFα活性与临床表现的程度之间存在相互关系，因此本发明提供了通过使用本发明提供的信号传导分子治疗脊椎炎的方法。
另外，考虑到在胰岛素依赖型糖尿病(I型)的进展中一种重要的病原性成分包括在树突细胞中见到的NF-κB途径过度激活，用本发明的NF-κB抑制因子处理将导致糖尿病症状减轻，或者至少推迟疾病发作的时间。根据本发明特别有效的寡肽信号传导分子是GVLPALPQ，LQGV，MTRV，VLPALPQVVC，VLPALP，VLPALPQ，LPGCPRGVNPVVS，LPGC，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，和CPRGVNPVVS，它们示出在非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)中推迟糖尿病的发作。治疗糖尿病尤其非胰岛素依赖型糖尿病(II型)的另一种方法包括用一种寡肽信号传导分子或其功能类似物或衍生物抑制PPARγ级联。
提供的另一种应用是关于抗击或治疗自身免疫疾病。免疫疾病的非限制性实例包括桥本氏甲状腺炎，原发性粘液水肿，甲状腺功能亢进，恶性贫血，自身免疫性萎缩性胃炎，Addison′s病，绝经期提前，胰岛素依赖型糖尿病，僵人(stiff-man)综合征，Goodpasture′s综合征，肌无力，男性不育，普通天疱疮，类天疱疮，交感神经眼炎，晶状体性眼色素层炎，多发性硬化，自身免疫性溶血性贫血，先天血小板减少性紫癜，先天白细胞减少症，原发胆管硬化，慢性活动性肝炎，隐发性硬化，溃疡性结肠炎，Sjgren′s综合征，类风湿性关节炎，皮肌炎，多肌炎，硬皮病，混合结缔组织病，盘状红斑狼疮，及系统性红斑狼疮。
本发明提供的另一种应用是关于抗击或治疗微生物所致感染的方法，特别是由在感染期间激活NF-κB途径的微生物所引起的那些感染。
这种微生物有很多，包括细菌，病毒，真菌和原生动物，但其它病原体(例如蠕虫)可具有相同作用。微生物感染激活NFκB途径一般通过激活Toll样受体途径而发生。本发明提供了一种方法以调节尤其抑制与生物体的一般通过Toll样受体途径之一激活的炎症反应相关的部分基因表达。
Toll样受体介导的NF-κB激活在宿主识别病原体中是重要的。这种病原体识别一般通过种系编码的分子发生，即所谓的模式识别受体(PRR)。这些PRR识别普遍的病原体相关分子模式(PAMP)。所述模式识别受体表示为膜结合或可溶的蛋白质。它们包括CD14，β2-整联蛋白(CD11/CD18)，C-型凝集素，巨噬细胞消除受体，补体受体(CR1/CD35，CR2/CD21)及Toll样受体(TLR)。TLR通过其识别及区分不同类别病原体的能力而与其它PRR区别。TLR代表一个跨膜蛋白家族，所述跨膜蛋白具有一个胞外结构域，包含多个拷贝的富亮氨酸重复(LRRs)和一个胞质Toll/IL-1R(TIR)基序，其与I型IL-1受体(IL-1RI)的胞内信号化结构域明显同源。因此，认为TLR属于IL-1R超家族。
病原体相关的分子模式(PAMPS)不是由宿主表达的，而是病原微生物的成分。这种PAMPS包含细菌细胞壁成分如脂多糖(LPS)，脂蛋白(BLP)，肽聚糖(PGN)，脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，脂磷壁酸质(LTA)，含有未甲基化的CpG基序的DNA，酵母和真菌细胞壁甘露聚糖及β葡聚糖，双链RNA，原生动物的一些独特的糖基化蛋白质和脂质等。
这些PAMPS的识别首先使得可通过TLR差示识别病原体。例如，TLR2通常在应答革兰氏阳性细菌的BLP、PGN，分枝菌的LAM，及酵母的甘露聚糖时激活，而TLR4通常由革兰氏阴性细菌的LPS及革兰氏阴性细菌的LTA激活，一种分泌的小分子MD-2也可导致TLR4信号传导。
根据本发明能调节基因表达的一些寡肽先前已经在小动物中exvivo和在体内进行了测试，但与调节基因表达的关系无进一步发现。观测到这些寡肽对小鼠中LPS诱导的脓毒病的有益作用，即对脓毒病的抑制作用。这些寡肽的免疫调节作用已经在体外及ex vivo的分析如T细胞分析中观测到，其示出抑制病理性Th1免疫应答，抑制炎症性细胞因子(MIF)，增加抗炎细胞因子(IL-10，TGF-β)的产生及对抗原呈递细胞(APC)如树突细胞，单核细胞和巨噬细胞的免疫调节作用。
已经发现独特的合成寡肽或其类似物或衍生物，例如与通过蛋白酶解从内源性蛋白质如hCG中衍生的分解产物相似的寡肽，可用于例如通过NF-κB抑制而调节基因表达，因此发现了这种寡肽的更广泛的应用。现在已知活性NF-κB在细胞中释放在各种刺激之后发生，所述刺激包括用细菌脂多糖处理细胞及与Toll样受体相互作用(见例如Guha and Mackman，Cell.Sign.2001，1385-94)。特别地，对树突细胞，单核细胞和巨噬细胞进行LPS刺激会诱导在转录因子激活的影响下的许多基因，所述转录因子如NF-κB，p50，EGR-1，IRF-1及可通过本发明信号传导分子调节的其它因子。考虑到LPS诱导EGR-1是最大程度诱导TNFα所需的，因此可预见EGR-1的抑制会显著降低在LPS激活之后见到的脓毒病的作用。现已知信号传导分子如本发明所提供的寡肽的基因调节作用使得可以合理设计信号分子混合物，以更好地减轻脓毒病中所见症状。将一种这样的混合物，LQGV，AQGV和VLPALP的1∶1∶1混合物施用于灵长类革兰氏阴性细菌诱导的猕猴脓毒病休克模型，发现在这个灵长类模型中是有效的。因此，本发明提供了治疗灵长类动物脓毒病的一种药物组合物，及治疗灵长类动物脓毒病的一种方法，包括将所述灵长类动物与本发明的信号传导分子接触，优选与这种信号传导分子的混合物接触。这种信号传导分子或混合物的施用优选系统施用，例如通过静脉内或腹膜内施用。在另一个实施方案中，这种治疗还包括应用例如抗生素，然而只有当这种应用未显示治疗不当时才可进行，因为在那些治疗的个体中由抗生素作用的细菌分解会产生进一步的毒素负担的危险。
涵盖的其它应用是关于抗击或治疗病毒感染，尤其是在感染期间激活NFκB途径的病毒所致感染的方法。这种病毒感染有多种多样，经典的实例是B型肝炎病毒通过持久激活NF-κB而诱导的细胞转化。使用本发明提供的信号传导分子提供了对抗或预防这种细胞转化的方法。
由本发明的信号传导分子有效抑制的其中NF-κB持久激活的其它疾病是一种移植相关疾病，如移植相关的免疫应答，移植物抗宿主病(尤其是骨髓移植)，急性或慢性异体移植排斥，及输血后血小板减少症。
由本发明的信号传导分子有效抑制的其中NF-κB持续激活的另一种情况是预防或减轻梗塞后局部缺血相关的组织损害，例如在体内的脑和心血管梗塞中或者在制备或贮存的以制备进一步用作移植物的ex vivo的器官或组织中可见的组织损害。局部缺血相关的组织损害现可通过用抑制NF-κB激活的本发明的信号传导分子灌注(原)缺血部位而减轻。其中局部缺血(也称为灌注不足)起作用的病变例如包括惊厥，其可归因于血管收缩所致病灶局部脑缺血，这与通过新的脑成像技术检测到的变化证据一致。HELLP(溶血，肝酶升高，及低血小板计数)固有的肝脏机能障碍也可归因于急性灌注不足的作用。局部缺血的其它病变在心肌梗塞后可见，产生由冠状动脉长期闭塞及体内再灌注所致不可逆转的心肌损害，其在PCT/NL01/00259中已经加以论述。
既然已经了解独特的合成寡肽可用于例如通过NF-κB抑制而调节基因表达，因此发现了这种寡肽的更广泛的应用，所述寡肽例如是与通过蛋白酶解从内源性蛋白质如hCG中衍生的分解产物相似的那些寡肽。例如，本发明提供了用包含至少一种信号传导分子的灌注液灌注移植物的一种方法，然后可以更大程度减少由于移植物中NF-κB激活所致局部缺血或植入前损害，由此可以更广泛应用移植物。
本发明提供了一种信号传导分子，用于调节基因在细胞中的表达。在此给出了这种信号传导分子在生产治疗人或动物疾病的药物组合物中的应用的一些实例。在一个实施方案中，本发明提供了在治疗免疫介导的功能失调中的这种应用，尤其在发现NF-κB/Rel蛋白在免疫应答中的关键作用的那些情况中。然而正如所述的，既然已知信号传导分子如寡肽或其类似物或衍生物的基因调节，因此还提供了通过调节其它转录因子如AP-1或PPARγ及其它因子的活性而调节基因表达，也正如所述的，现已知很可能是分解产物的寡肽在调节基因表达中起如此关键的作用，因此本发明提供了简便的方式以鉴别进一步的基因表达调节肽，并提供了这些肽的合成形式及其类似物和衍生物用于各种病变中及用于制备各种药物组合物。这种治疗及有效的药物组合物例如见于以下病变，其中免疫介导的病变包括慢性炎症，如糖尿病，多发性硬化或者急性或慢性移植排斥，特别是在抗原呈递细胞(APC′s)或树突细胞(DCs)由于(过度活性)和持久的NF-κB表达而增强的那些情况中，或者其中免疫介导的病变包括急性炎症，如脓毒病或过敏性休克或急性移植排斥。可以用包含本发明信号传导分子的药物组合物治疗的其它免疫介导的病变包括自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎(尤其通过抑制NF-κB对这些基因表达的作用而抑制IL-8和/或IL-15产生)，过敏反应，如哮喘或寄生虫病，对感染因素的过强免疫应答，所述感染因素如病毒或细菌(尤其包括生物体感染所致急性出血性疾病，所述生物体如Yersinia pestis，埃博拉病毒，Staphylococcus aureus(例如tampon-disease)，细菌(如meningococcal)或病毒性脑膜炎和/或脑炎，及其它危及生命的病变中)。这种过强应答例如见于前惊厥，反复发作的自然流产(RSA)或者早产或其它妊娠相关的病变。尤其在与遗传编程性肿瘤生长因子β-1产生增加相关的惊厥/前惊厥形式中，推荐使用本发明的治疗方法。同样，在RSA可能归因于妊娠期间IL-10水平提高或者归因于例如由于存在不利的等位基因所致TNFα活性提高，尤其编码TNFα的基因的启动子中存在G-A多态性的情况中，推荐使用本发明提供的药物组合物进行治疗。本发明还提供了这种妊娠相关的免疫失调的治疗方法，其通过激活天然杀伤细胞(NK)活性而抑制NF-κB活性而进行治疗。同样，在妊娠的猪中见到的LPS诱导的生育力下降或者流产可通过应用本发明提供的信号传导分子或方法而降低。
在治疗免疫介导的病变中的这种应用优选包括调节治疗的个体中淋巴细胞，树突细胞或抗原呈递细胞亚群的相对比率和/或细胞因子活性，尤其是当所述亚群包含Th1或Th2，或者DC1或DC2细胞时。本发明的其它实施方案包括使用本发明的信号传导分子以生产一种药物，以调节心血管或循环系统疾病，如冠状动脉闭塞，及用于妊娠相关的心血管或循环系统疾病中。
另外，本发明提供了一种药物组合物以调节心血管疾病或循环系统疾病，尤其妊娠相关的心血管疾病或循环系统疾病，所述药物组合物包含本发明的一种信号传导分子或其混合物。这种组合物用于调节心血管或循环系统疾病，尤其妊娠相关的心血管或循环系统疾病的方法中，包括将动物(尤其是哺乳动物)用本发明的至少一种信号传导分子处理。非妊娠相关的病变例如血胆固醇过多相关的病变对本发明的信号传导分子治疗也敏感。例如，阿朴脂蛋白E(apo E)缺乏症与一系列病理学改变相关，包括异常脂蛋白血症，动脉硬化，Alzheimer′s病，体重增加及寿命变短。多态性apoE基因的不同等位基因的遗传在大多数人群中是造成血浆胆固醇中10％的变化的原因。针对一个变体apoE2是杂合的个体，如果存在一个额外的遗传或环境因素，可产生III型β异常脂蛋白血症。apoE的一些更不常见的等位基因在杂合个体中产生这种病变的显性表达。ApoE是LDL受体的配体，其对血浆胆固醇的作用由LDL受体对携带变体apoE蛋白的脂蛋白的亲和性的差别介导。已经通过在转基因小鼠中表达基因构建体而广泛研究了调节apoE基因转录的因子，其包括因子之间的复杂相互作用，所述因子结合5’启动子区域，第一个内含子及与结构基因相隔几千个碱基的3’区域中的成分。apoE基因的缺失与脂蛋白代谢物(血浆总胆固醇)，HDL胆固醇，HDL/TC，和HDL/LDL比率，apo B缺失的血浆中的酯化率，血浆甘油三酯，肝HMG-CoA还原酶活性，肝胆固醇含量，血浆高半胱氨酸(高胱氨酸)和葡萄糖水平降低，及严重动脉硬化和皮肤黄瘤症中的变化相关。本发明提供了一种方法和信号传导分子以治疗与LDL受体功能失调相关的病变，所述LDL受体如ApoE及阿朴脂蛋白家族其它成员。特别地，优选使用包含GVLPALPQ和/或VLPALP或其功能类似物或衍生物的一种信号传导分子。
本发明还提供了信号传导分子在制备药物组合物或药物或者治疗各种疾病的方法中的应用，所述应用不同于在制备治疗免疫介导的病变的药物组合物或治疗免疫介导的病变的方法中的应用。例如，本发明提供了局部应用，例如制成包含本发明信号传导分子的药膏或喷雾剂，以预防或减轻皮肤病，如湿疹，银屑病，也可以用于与过度暴露于紫外线相关的皮肤损害。
同样，本发明涵盖了在缓解控制中的应用，从而调节与前列腺素合成相关的基因，由此影响COX2途径。
另外，本发明还提供了信号传导分子在制备一种药物组合物或药物及在治疗各种病变的方法中的应用，其不同于在制备治疗消耗综合征如治疗患有HIV感染的特殊个体的药物组合物中的应用，或者治疗这种个体的消耗综合征的方法中的应用。
在一个实施方案中，本发明提供了应用本发明的信号传导分子制备药物组合物或药物以调节血管发生或血管形成，尤其在胚胎发育期间，或者在移植后刺激移植的器官中的血管形成或者在以后的阶段对其加以抑制。导致血管发生的信号传导分子在详细描述中揭示。
本发明提供的应用还包括调节细胞上TNFα受体(例如CD27)表达，从而调节治疗的个体中淋巴细胞，树突细胞或抗原呈递细胞亚群的相对比率和/或细胞因子活性。如在详细描述中所描述的，本发明的特殊寡肽能负调节T细胞系细胞上CD27表达。
负调节TNFα在与脓毒性休克相似的、不仅展示TNFα活性提高而且表现为进一步释放其它炎症化合物如NO的病变中也特别有效。NO的产生在血管和炎症应答中是关键的介导因素。我们的结果示出用炎症活性化合物如LPS刺激的炎性细胞如巨噬细胞产生大量NO。然而，用大多数NMPF肽(NMPF肽1-14，43-66和69)，甚至以非常低的剂量(1pg/ml)共刺激这些细胞，就抑制NO产生。可优选通过负调节TNFα和NO产量而治疗的典型类脓毒性休克病变包括以下病变，例如Bacillus anthracis(炭疽热)和Yersinia pestis毒素所致疾病，或者可能参与生物恐怖活动的这些微生物的感染。炭疽热毒素由Bacillus anthracis产生，是导致炭疽热的致病因素，而且是所述疾病的主要症状的原因。临床上炭疽热很罕见，但在生物战争和恐怖活动中潜在应用B.anthracis而逐渐增加。尽管存在炭疽热的疫苗，但各种因素使大规模接种不切实际。通过用抗生素治疗可从宿主中根除这种细菌，但因为毒素的持续作用，一旦症状明显则这种治疗的效力很低。因此，所述毒素作用的特异性抑制剂为抗生素治疗提供了有价值的帮助。所述毒素由一个称为“保护性抗原”(PA)的单一受体结合基序及两个称为“水肿因子”(EF)和“致死因子”(LF)的酶基序组成。在作为无毒单体从所述细菌中释放后，这三种蛋白质布散于哺乳动物细胞表面并装配为毒性的细胞结合的复合物。
通过细胞表面蛋白酶将PA切割为两个片段，使得保留与细胞结合的片段PA63七聚体化，并高亲和性结合EF和LF。在通过受体介导的胞吞而内化之后，所述复合物被运输至内涵体。在低pH下，PA基序插入膜中并介导EF和LF转位于细胞液中。EF是一种腺苷酸环化酶，其对专业的吞噬细胞具有抑制作用，而LF是一种蛋白酶，其特异性作用于巨噬细胞，导致其死亡及宿主死亡。
另外，本发明提供了本发明的信号传导分子在生产调节基因表达的药物组合物中的应用及在通过调节基因表达而进行治疗的方法中的应用。可通过特殊肽调节的特殊基因如图70所示。
TNFα自身和/或TNFα受体的负调节，也有益于具有Chagas心肌病变的个体。
同样，在此提供了本发明信号传导分子在制备一种药物组合物中的应用，所述药物组合物在创伤修复尤其在烧伤中调节血管形成或血管发生。同样，在此提供了一种药物组合物，其用于手术后生理应激反应的情况中，从而不仅有益于从治疗中形成血管，而且还改善患者的一般状态。
本发明信号传导分子的另一种应用包括其用于制备治疗癌症的另一种药物组合物。这种药物组合物优选通过调节及正调节传统上由NF-κB活性负调节的细胞程序死亡应答而起作用。用本发明的信号传导分子抑制所述活性可以增加肿瘤细胞死亡。本发明提供的信号传导分子的另一种抗癌活性包括尤其在人体造血系肿瘤的情况中负调节c-myb。本发明还提供了对14.3.3蛋白的负调节。
本发明信号传导分子的另一种应用包括其用于制备治疗癌症的进一步的药物组合物。这种药物组合物优选通过调节及负调节尤其是肿瘤细胞上的运铁蛋白受体可利用性而起作用。运铁蛋白受体传统上通过NF-κB活性而正调节。用本发明的信号传导分子抑制所述活性可以降低铁的摄取并增加肿瘤细胞的死亡。特别地，类红细胞和血栓样细胞对这种治疗敏感。
本发明的信号传导分子的再一种应用包括其用于制备治疗癌症、尤其是由病毒引起的癌症的再一种药物组合物，如逆转录病毒诱导的恶性肿瘤及其它病毒诱导的恶性肿瘤。这种药物组合物优选通过调节及负调节传统上由病毒诱导的转录或NF-κB活性正调节的细胞增殖应答而起作用。用本发明的信号传导分子抑制所述活性可以降低增殖并增加肿瘤细胞死亡。这种药物组合物也可以通过调节IL-8诱导的血管发生应答而起作用，从而例如通过抑制转录因子AP-1或NF-κB表达而抑制IL-8表达，导致抑制依赖于血管形成的肿瘤的生长。
另外，本发明提供了信号传导分子在制备优化人或动物生育力及胚胎存活的药物组合物中的应用及在优化生育力和胚胎存活的方法中的应用。特别地，本发明提供了使得在受精个体中负调节TNFα的一种方法和组合物，优选地其与在所述个体中正调节IL-10的组合物和方法组合。这种组合物和方法在人体和动物医药中均有直接用途。
本发明还提供了信号传导分子在制备调节个体体重的药物组合物中的应用，特别是通过应用本发明的信号传导分子而在过氧化物酶体增殖因子激活的受体γ(PPARγ)及脂质代谢物的影响下调节基因表达，本发明还提供了调节体重的方法，包括为个体施用本发明的信号传导分子。
本发明的信号传导分子的进一步应用是调节基因在培养的细胞中的表达，例如图70所示。这种方法包括用本发明的信号传导分子作用于培养的细胞。培养的细胞(在本领域已知的体外细胞培养条件下培养的细胞)的增殖和或分化可以通过本发明的信号传导分子作用于所述培养的细胞而调节。应理解的是研究细胞的增殖或分化，如干细胞研究，将非常有益于了解存在影响基因调节的第三种主要途径，而且合成肽及其类似物或衍生物应用简便。
另外，应理解的是本发明提供的信号传导分子有一种有利用途，即用作疫苗中的共刺激物质，伴随现代佐剂或代替传统使用的分枝杆菌佐剂，尤其鉴于某些分枝杆菌表达hCG样蛋白，现假定这些细菌通过为宿主提供模拟本发明鉴别的信号传导分子的分解产物已经利用本发明提供的在基因调节中发现的这种第三种途径。本发明提供的治疗和组合物的应用非仅限于动物，植物及其它生物体也可进行本发明提供的该第三种途径。另外，既然已经表明存在这种途径，本发明提供了使其作为诊断项目，例如在一种方法中确定细胞的基因调节状态，包括确定信号传导分子的存在与否或者确定能从(优选内源)蛋白质中产生这种信号传导分子的蛋白酶的存在与否。
附图简述

图1-2处理的BALB/c小鼠(6只)的骨髓(BM)细胞产量。从处理的小鼠中分离BM细胞，并在体外在存在rmGM-CSF的情况下培养9天。这些图示出在培养分离自处理的小鼠的BM细胞9天后的细胞产量，所述处理是用PBS，LPS，或与NMPF肽4，46，7和60组合的LPS处理。在这些图中，细胞产量以与PBS处理的细胞产量的相对百分比表示。每种条件由6个培养平皿组成，这些图中示出的结果是6个平皿的代表结果。大于20％的差异认为是显著的，线条表示与LPS对照组相比的显著性数据。示出了一代表性实验。包括所有实验条件的发现在三个额外的实验中全部再现。
图3体内处理对CD11c+细胞上MHC-II表达的作用。从处理的BALB/c小鼠(n＝6)中分离骨髓(BM)细胞，并在体外在存在rmGM-CSF的情况下培养9天。该图示出在分离自PBS，LPS，或与NMPF组合的LPS处理的小鼠的BM细胞培养9天后，以平均荧光强度(MFI)表示的MHC-II表达。每种条件由6个培养平皿组成，这些图中示出的结果是6个平皿的代表结果。大于20％的差异认为是显著的，线条代表与LPS对照组相比显著的数据。示出了一个代表性实验。包括所有实验条件的发现在三个额外的实验中全部再现。
图4-7在体外处理的BM培养物的骨髓(BM)细胞产量。将BALB/c小鼠(n＝3)的BM细胞在体外培养，及在存在rmGM-CSF情况下，用PBS，LPS(t＝6天)，NMPF 4，7，46，60(t＝0天或t＝6天)或者NMPF与LPS的组合(t＝6天)处理。这些图示出在培养BM细胞9天后以与PBS处理的细胞产量相比的相对百分比表示的细胞产量。每种条件由6个培养平皿组成，这些图中示出的结果是6个平皿的代表结果。大于20％的差异认为是显著的，线条代表与LPS对照组相比显著的数据，点划线代表与PBS组相比显著的数据。示出了一个代表性实验。包括所有实验条件的发现在三个额外的实验中全部再现。
图8-11体外处理对CD11c+细胞上MHC-II表达的作用。将BALB/c小鼠(n＝3)的BM细胞在体外培养，及在存在rmGM-CSF情况下，用PBS，LPS(t＝6天)，NMPF 4，7，46，60(t＝0天或t＝6天)或者NMPF与LPS的组合(t＝6天)处理。这些图示出在培养BM细胞9天后以CD11c阳性细胞的平均荧光强度(MFI)表示的MHC-II。每种条件由6个培养平皿组成，这些图中示出的结果是6个平皿的代表结果。大于20％的差异认为是显著的，线条代表与LPS对照组相比显著的数据，点划线代表与PBS组相比显著的数据。示出了一个代表性实验。包括所有实验条件的发现在三个额外的实验中全部再现。
图12-15处理的BALB/c小鼠(n＝6)的骨髓(BM)细胞产量。从处理的小鼠中分离BM细胞，并在存在rmGM-CSF的情况下ex vivo(ex vivo)培养9天。这些图示出在悬浮(未附着)及附着于(附着)培养平皿培养BM细胞9天后的细胞产量。BM分离自用PBS，LPS或者与不同NMPF肽组合的LPS处理的小鼠。在这些图中，细胞产量以与PBS处理相比的相对百分率表示。每种条件由6个培养平皿组成，这些图中示出的结果是6个平皿的代表结果。大于20％的差异认为是显著的，线条代表与LPS对照组相比显著的数据。示出了一个代表性实验。包括所有实验条件的发现在三个额外的实验中全部再现。
图16-17NOD小鼠的体外处理的BM培养物的骨髓(BM)细胞产量。将15周龄年老雌性NOD小鼠(3只)的BM细胞在体外培养，并在存在rmGM-CSF的情况下用PBS或NMPF处理9天。这些图示出在悬浮(未附着)及附着于(附着)培养平皿培养BM细胞9天后的细胞产量。在这些图中，细胞产量以与PBS处理相比的相对百分率表示。每种条件由6个培养平皿组成，这些图中示出的结果是6个平皿的代表结果。大于20％的差异认为是显著的，线条代表与LPS对照组相比显著的数据。示出了一个代表性实验。包括所有实验条件的发现在三个额外的实验中全部再现。
图18NMPF-1，2，3，4，5，6，10，11和13对巨噬细胞(RAW264.7)中LPS诱导的NO产量(以微摩尔表示)的作用。该图示出在0.78ng/ml-100ng/ml浓度范围内10μg/ml NMPF明显抑制NO产量。
图19Jurkat T细胞在有或无NMPF 4(LQGV)，87(VGQL)，6(VLPALP)和88(PLAPLV)的情况下用PHA(10μg/ml)处理。在温育3小时后，制备核提取物并分析转录因子(p65，p50，c-REL，c-FOS，CREB1和ATF2)。该图示出NMPF对这些转录因子的作用。
图20-32用NMPF在体外处理受精鸡卵及NMPF对血管发生的作用。将受精鸡卵(第0天)用PBS，NMPF，VEGF或与NMPF组合的VEGF处理。针对每种条件注射10只鸡卵。在温育第8天，将胚胎从鸡卵中取出并置于100-mm培养平皿上。将所述胚胎和血管用显微镜体内照相。对每个鸡卵照1张一般观察照片，对血管照4张详细照片。血管发生(血管分枝)的量化通过计数血管分枝的数目实现。这种血管形成(vasculogenesis)的量化通过测定血管厚度实现。在照片中测定血管分枝的数目和血管厚度，并联系10mm2的光栅(照片中)以进行对比。计算每种条件的分枝平均数和平均血管厚度(N＝10)，并使用Student′s T检验与PBS或VEGF对照组相对比。线条表示与PBS对照组相比显著的数据(p＜0.05)，点划线表示与VEGF组相比显著的数据(p＜0.05)。图20-30示出NMPF对血管分枝的作用。图31-32示出NMPF对血管厚度的作用。
图33通过EMSA检测NF-κB。该图示出用LPS或NMPF与LPS的组合处理4小时的RAW264.7细胞的核提取物中NF-κB存在情况。数字1-13相当于用NMPF和LPS处理的细胞核提取物。CTL相当于只用LPS处理的细胞核提取物。放射性标记的NF-κB探针的特异性通过用CTL的核提取物和相当于只含标记的寡核苷酸的样品(无核提取物)的olg测试与三种不同浓度(1×，10×，100×)的未标记寡核苷酸(u1，u2，u3)竞争而示出。描述(NMPF-1)VLPALPQVVC，(NMPF-2)LQGVLPALPQ，(NMPF-3)LQG，(NMPF-4)LQGV，(NMPF-5)GVLPALPQ，(NMPF-6)VLPALP，(NMPF-7)VLPALPQ，(NMPF-8)GVLPALP，(NMPF-9)VVC，(NMPF-11)MTRV，(NMPF-12)MTR。
图34.HPLC层析(波长206)，其中叠加了得自LPS及LPS与NMPF组合刺激的RAW264.7细胞的核蛋白提取物的数据图。
图35.NMPF-4肽的MSn分析。
图36LPS刺激的RAW264.7细胞的核提取物的一个级分的MSn分析。上方示出所述级分的全部谱图，下方示出质量413.13处的MS/MS谱。
图37LPS与NMPF-4组合刺激的RAW264.7细胞的核提取物的一个级分的MSn分析。上方示出所述级分的全部谱图，下方示出质量416.07处的MS/MS谱。
图38-49在猕猴中NMPF对脓毒性休克综合征的作用。在70分钟时间点灌注大肠杆菌，并在灌注大肠杆菌结束时(190分钟时间点)注射抗生素Baytril。对照猴(猴429)在100分钟时间点用0.9％NaCl处理，而NMPF处理的猴(猴459和427)在相同时间点接受NMPF处理作为对照猴。这些图示出了在实验期间对照猴429(图38-41)，NMPF处理的猴459(图42-45)及427(图46-49)的心率(每分钟跳动的次数)，血压(mmHg)，收缩压和舒张压之间的压差及血氧浓度(饱和度％)。
图50这些图(A-C)示出LPS(10μg/ml)与不同NMPF肽(1pg/ml)共同刺激的RAW 264.7巨噬细胞的NO产量。
图51这些图(A-C)示出LPS(10μg/ml)与三种不同浓度的不同NMPF肽(1pg/ml)共同刺激的RAW 264.7巨噬细胞的NO产量。
图52该图示出用各种NMPF肽处理2周的糖尿病NOD小鼠的百分比。
图53该图示出在用NMPF肽处理的NOD小鼠中进行的葡萄糖耐量测试(GTT)(A)，及空腹血糖水平。
图54和55处理的RAW264.7细胞核提取物中存在的NF-κB的半定量数量。(A)示出抑制LPS诱导的NF-κB转位的NMPF肽NMPF-1(VLPALPQVVC)，NMPF-2(LQGVLPALPQ)，NMPF-3(LQG)，NMPF-4(LQGV)，NMPF-5(GVLPALPQ)，NMPF-6(VLPALP)，NMPF-9(VVC)，NMPF-12(MTR)和NMPF-14(环LQGVLPALPQVVC)。促进LPS诱导的NF-κB转位的NMPF肽是NMPF-7(VLPALPQ)，NMPF-8(GVLPALP)和NMPF-11(MTRV)。在该图中，A表示用未标记的寡核苷酸的一倍竞争，B只表示未标记的寡核苷酸，C表示用10倍未标记的寡核苷酸的竞争，D表示用百倍未标记的寡核苷酸竞争。为进行竞争，使用LPS处理的细胞的标记的提取物(见+LPS)与未标记的寡核苷酸。核中NF-κB的基础水平由以下肽降低NMPF-1(VLPALPQVVC)，NMPF-2(LQGVLPALPQ)，NMPF-3(LQG)和NMPF-4(LQGV)，而核中NF-κB的基础水平由以下肽提高NMPF-5(GVLPALPQ)，NMPF-7(VLPALPQ)，NMPF-8(GVLPALP)，NMPF-9(VVC)，NMPF-11(MTRV)，NMPF-12(MTR)和NMPF-13(LQGVLPALPQVVC)(图55)。
图56处理的NOD小鼠脾DC中的NFκB将NOD小鼠用PBS或NMPF处理。之后，分离脾DC并分析核NFκB p65。用NMPF-3，4，5，4+5，4+6，5+6和4+5+6处理的NOD小鼠示出NFκB p65水平降低。
图57NOD和CS7b16小鼠骨髓衍生的DC中的NFκB我们在体外测试了NMPF对NOD和C57BL/6小鼠DC中NFκB的作用。分离骨髓(BM)并在存在GM-CSF的情况下培养，以产生BM衍生的DC。获得的DC用LPS(5ng/ml)和NMPF 1，2，5或6刺激30分钟，然后测定NFκB p65活性。
当用5ng/ml LPS刺激时，C57BL/6 DC与未处理的DC相比未示出NFκB活化提高。然而，NOD DC示出在用LPS刺激后，NFkB活化提高2倍。NMPF对NFκB的作用在C57BL/6 DC中检测不到，因为用LPS刺激不引起NFκB活化。然而，NOD DC中NMPF能抑制(NMPF1，2，5和6)LPS诱导的NFκB活化(图57)。这些结果示出与C57BL/6 DC相比，NOD DC中NFκB的高反应性，且NMPF抑制NOD DC中高反应性NFκB活化。
图58该图(图58A)示出NMPF 1-9对血管发生的作用，它们在第8天加入。NMPF 1，2，3，5，6，7，8和9处理与PBS处理相比示出明显抑制血管发生。而NMPF-4明显增加血管发生。该图还示出在第8天仅用VEGF处理明显增加血管发生。图58B示出在第8天用NMPF 2，3，5，7，8和9处理明显抑制VEGF诱导的血管发生。另外，在第0天用NMPF 1和6及VEGF处理明显抑制血管发生(数据未示出)。
图59-65这些图示出未处理的猴(429)及NMPF处理的猴(459)和NMPF处理的猴(427)的血清TNFα(图59)，IL-1β(图60)，IL-8(图61)，IL-6(图62)，IL-5(图63)，IL-10(图64)和IFN-γ(图65)水平，所述未处理的猴在注射大肠杆菌后8小时处死，所述NMPF处理的猴(459)在与未处理的猴同一时间处死，所述NMPF猴(427)不处死，其在大肠杆菌处理后38小时死亡。在以下时间点取血液样品0，30(注射大肠杆菌)，45，60(安慰剂或NMPF处理)，75，90，105，120，135，150(Baytril处理)，165，180，195，210，225，240，255，270，300，330，360，390，420，450，480，510，540，570，600及630分钟。
图66-69这些图示出使用NMR1小鼠进行脓毒性关节炎实验的结果。在静脉内注射S.aureus LS-1细菌后，将一组小鼠经腹膜内用PBS处理，每周三次共两周，将其它组小鼠经腹膜内用NMPF-6(100μg)处理，每周三次共两周。每组10只小鼠。在13天的期间内测定体重降低情况(图66)，存活力(图67)，关节炎严重程度(图68)及关节炎发生频率(图69)。
图70示出在LPS或PHA刺激的PMBC中被调节的基因，所述PMBC进一步用本发明的基因调节肽处理。图70A-70E涉及LPS刺激的细胞，70F-70J涉及PHA刺激的细胞。图70A示出对照实验，其中细胞只用LPS处理，不额外用所述肽处理，70B示出用VVC的处理作用，70C示出用MTRV的处理作用，70D示出用MTR的处理作用，70E示出用MTRVLQGVLPALPQ的处理作用。70F示出对照实验，其中细胞只用LPS刺激，不额外用所述肽处理，70G示出用VVC的处理作用，70H示出用MTRV的处理作用，70I示出用MTR的处理作用，70J示出用MTRVLQGVLPALPQ的处理作用。分离周围血单核细胞(PBMC)，来自肝素化静脉血的PBMC通过Ficoll Hypaque的密度梯度离心仪(Pharmacia，Uppsala，Sweden)分离。将PBMC洗涤三次并以5.0×10e6细胞/ml再悬浮于补加2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，50μg/ml链霉素，1mM丙酮酸及10％热灭活的人血清的RPMI-1640中。将2ml(10×106个细胞)细胞悬浮液铺板于6孔平板中，并用LPS(1μg/ml)，LPS和NMPF(1μg/ml)，PHA(10μg/ml)，PHA和NMPF(1μg/ml)或只用等体积的PBS处理。未处理的PBMC及用LPS或LPS与NMPF处理的PBMC培养1.5小时，而未处理的PBMC及用PHA或PHA与NMPF处理的PBMC培养3小时。在温育后，收集所有细胞(附着及未附着的)并洗涤3次，进一步用于微阵列实验中。在这个实验中测试以下NMPFNMPF-9(VVC)，NMPF-11(MTRV)，NMPF-12(MTR)和NMPF-70(MTRVLQGVLPALPQ)。
本发明的详细描述细胞对环境和内在变化均起反应，它们通过细胞外和细胞间以及细胞内信号察知。这些信号的性质可例如是物理或化学信号。另外，血液中存在的不同类别的分子彼此相互反应并诱导一连串反应，对其它分子具有直接作用和/或最后引起细胞应答，例如补体系统及血液凝固蛋白。
许多基因不是通过进入细胞的信号传导分子调节的，而是通过与细胞表面上特异性受体结合的分子而调节，所述细胞表面上特异性受体例如具有酶活性的受体(受体酪氨酸激酶，受体样蛋白质酪氨酸磷酸酶，受体丝氨酸/苏氨酸激酶，组氨酸激酶，鸟苷酰基环化酶)及不具有酶活性的受体(细胞因子受体，整联蛋白，G-蛋白偶联受体)。细胞表面受体与其配体之间的相互作用可通过调节一或多种胞内转导蛋白的一连串胞内事件级联进行，包括所谓第二信使(二酰甘油，Ca2+，环核苷酸，肌醇(1，4，5)三磷酸，磷脂酰肌醇(3，4，5)三磷酸，磷脂酰肌醇转移蛋白(PITP))的胞内水平的变化。这导致激活或抑制所谓的“效应蛋白”。第二信使反过来引起蛋白质中的变化，例如通过环AMP，环GMP，钙激活的蛋白激酶，或蛋白激酶(例如AGC组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，CAMK组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，CMGC组丝氨酸/苏氨酸激酶，蛋白质酪氨酸激酶组，或其它激酶如MEK/Ste7p)的作用使蛋白质磷酸化。蛋白激酶所致的磷酸化是信号传播中的一种调节机制，其调节不同的细胞途径如Ras/MAPK途径，MAP激酶途径，JAK-STAT途径，wnt-途径。在许多情况中，这均导致基因表达发生变化(例如用于调节其它基因，细胞存活，生长，分化，成熟，功能活性的基因)。
对配体与细胞表面受体结合的许多应答是细胞质性的，而且不涉及细胞核中立即基因激活。在一些情况中，在细胞表面相互作用之后预先存在的无活性转录因子被激活，导致立即基因激活。例如，蛋白质NF-κB，其可在几分钟之内通过各种刺激激活，包括膜受体(例如模式识别受体，如与病原体相关的分子模式结合的Toll样受体)，炎性细胞因子如TNF-α，IL-1，T细胞活化信号，生长因子及应激诱导因子。
我们用NMPF肽LQGV进行的基因组实验示出自从细胞仅用肽处理4小时后，就显示出对信号转导和基因调节非常明显的立即作用。在这个短时间内，在存在强刺激因子(PHA/IL-2刺激的T-细胞系(PM1))的情况中，LQGV负调节至少120个基因并正调节至少6个基因，表明对本发明信号传导分子的具有深远意义的作用及对基因表达的调节作用。受LQGV影响的基因包括致癌基因，转录因子、胞内酶、膜受体、胞内受体、信号转导蛋白(例如激酶)的基因及一些未知分子的基因。这示出在此描述的作为合成的信号传导分子(寡肽或其功能类似物或衍生物)的一个例子的LQGV，在不同胞外和胞内水平具有广谱作用。另外，我们的HPLC/MS数据示出在半小时内巨噬细胞系(RAW267.4)的细胞核中存在LQGV，还表明在DNA水平以及在胞内水平的直接作用，这通过NF-κB实验进一步证实。LQGV的最终调节作用依赖于例如细胞类型，细胞的分化和成熟状态，其它调节分子的功能状态和存在状况。这通过休克实验而证实，其中不同的NMPF肽对疾病具有相似或不同作用。用DC，受精鸡卵和CAO进行实验获得相同结果；NMPF作用依赖于共刺激的类型(GM-CSF单独或与LPS或VEGF组合)及处理时间。由此，NMPF具有在不同水平调节细胞应答的能力。
本发明借助于以下实施例进行进一步阐述。
实施例材料和方法肽合成本文中提及的肽如LQG，AQG，LQGV，AQGV，LQGA，VLPALP，ALPALP，VAPALP，ALPALPQ，VLPAAPQ，VLPALAQ，LAGV，VLAALP，VLPALA，VLPALPQ，VLAALPQ，VLPALPA，GVLPALP，CNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，LQGVLPALPQVVC，SIRLPGCPRGVNPVVS，LPGCPRGVNPVVS，LPGC，MTRV，MTR和VVC通过固相合成制备(Merrifield，1963)，使用基于芴甲氧羰基(Fmoc)/叔丁基的方法(Atherton，1985)，用2-氯三苯甲基氯化物树脂(Barlos，1991)作为固体支持物。谷氨酰胺的侧链用三苯甲基官能团保护。手工合成所述肽。每个偶联均由以下步骤组成(i)通过于二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶除去α-氨基Fmoc-保护，(ii)将Fmoc氨基酸(3eq)与在DMF/N-甲基甲酰胺(NMP)中的二异丙基碳二亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)偶联，及(iii)将剩余的氨基官能团用在DMF/NMP中的乙酐/二异丙基乙胺(DIEA)加帽。在完成合成的基础上，将所述肽树脂用三氟乙酸(TFA)/H2O/三异丙基硅烷(TIS)95∶2.5∶2.5的混合物处理。30分钟后，加入TIS直至脱色。将该溶液真空蒸发并用二乙醚沉淀所述肽。将粗制的肽溶解于水中(50-100mg/ml)，通过反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化。HPLC条件是层析柱-Vydac TP21810C18(10×250mm)；洗脱系统-于水中的0.1％TFA梯度系统(A)及于乙腈(ACN)中的0.1％TFA v/v梯度系统(B)；流速-6ml/分钟；在190-370nm检测吸光度。使用不同的洗脱系统。例如针对肽LQG和LQGV10分钟100％A，随后50分钟内线性梯度0-10％B。例如针对肽VLPALP和VLPALPQ5分钟5％，B随后以1％B/分钟线性梯度进行。将收集的级分通过旋转膜蒸发在40℃减压浓缩为大约5ml。剩余的TFA通过具有乙酸盐形式阴离子交换树脂(Merck II)的柱洗脱两次而用乙酸盐交换。将洗脱物浓缩并在28小时内冻干。随后将其在PBS中溶解以制备所述肽。
转录因子实验巨噬细胞系将得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)的RAW 264.7巨噬细胞在37℃在5％CO2中使用含有10％FBS和抗生素(100U/ml的青霉素，及100μg/ml链霉素)的DMEM培养。将细胞(1×106/ml)与2ml肽(10μg/ml)温育。8小时后，洗涤培养的细胞并制备核提取物。
核提取物核提取物和EMSA根据Schreiber等所述方法(Schriberet al.1989，Nucleic Acids Research 17)制备。简而言之，肽刺激或未刺激的巨噬细胞的核提取物通过细胞裂解及随后的核裂解制备。然后将细胞悬浮于400μl缓冲液(10mM HEPES(pH 7.9)，10mM KCl，0.1mM KCL，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF及蛋白酶抑制剂)中，强力涡旋15秒，在4℃放置15分钟，并以15,000rpm离心2分钟。将沉淀的核再悬浮于在冰上的缓冲液(20mMHEPES(pH 7.9)，10％甘油，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制剂)中30分钟，然后将裂解物在15,000rpm离心2分钟。含有溶解的核蛋白的上清贮存在-70℃直至用于电泳迁移率变动分析(EMSA)。
EMSA通过将从对照组(RAW 264.7)和肽处理的RAW 264.7细胞中制备的核提取物与代表NF-κB结合序列的合成的32P标记双链探针(5′AGCTCAGAGGGGGACTTTCCGAGAG 3′)温育进行电泳迁移率变动分析。简而言之，将探针用T4多核苷酸激酶根据厂商指导进行末端标记(Promega，Madison，WI)。将退火的探针如下与核提取物温育在EMSA中，结合反应混合物(20μl)含有在结合缓冲液中的0.25μg聚(dI-dC)(Amersham Pharmacia Biotech)及20000rpm的32P标记的DNA探针，所述结合缓冲液由5mM EDTA，20％Ficoll，5mM DTT，300mM KCl和50mM HEPES组成。所述结合反应通过加入细胞提取物(图10)起始，在室温持续30分钟。通过在6％聚丙烯酰胺凝胶中电泳将DNA-蛋白质复合物与游离寡核苷酸区别开。将所述凝胶干燥并曝光于X光胶片。
Apo E实验阿朴脂蛋白E(apo E)的缺乏与一系列病症相关，包括异常脂蛋白血症，动脉硬化，Alzheimer′s病，体重增加及寿命变短。多态性apoE基因的不同等位基因的遗传是造成大多数人群中10％的血浆胆固醇变异的原因。对于一个变体apoE2是纯合的个体，如果存在一种额外的遗传或环境因子，可产生III型异常β脂蛋白血症。apoE的一些更罕见的等位基因在杂合个体中产生这一病症的显性表达。ApoE是LDL受体的配体，其对血浆胆固醇的作用通过LDL受体与携带变体apoE蛋白的脂蛋白的亲和性差异而介导。调节apoE基因转录的因子已经通过在转基因小鼠中表达基因构建体而深入研究，其涉及结合5’启动子区域，第一个内含子及与结构基因相隔几千个碱基的3’区域中的元件的各种因子间的复杂相互作用。apoE基因的缺失与脂蛋白代谢(血浆总胆固醇)、HDL胆固醇、HDL/TC及HDL/LDL比率、apo B-耗竭的血浆中的酯化率、血浆甘油三酯、肝HMG-CoA还原酶活性、肝胆固醇含量的变化，血浆高半胱氨酸(高胱氨酸)和葡萄糖水平降低，及严重动脉硬化和皮肤黄瘤症相关。
结果NF-κB实验转录因子NF-κB参与许多基因的转录调节。从LPS和肽处理的RAW264.7细胞中或者从LPS处理的RAW264.7细胞中制备核蛋白提取物。为确定所述肽是否调节NF-κB转位入细胞核中，对这些提取物进行EMSA。图33示出用LPS或者LPS与肽组合处理4小时的RAW264.7细胞的核提取物中存在的NF-κB量。在此我们观察到一些肽确实能调节NF-κB转位，因为针对NF-κB的标记寡核苷酸量降低。在这个实验中，示出调节NF-κB转位的肽是(NMPF-1)VLPALPQVVC，(NMPF-2)LQGVLPALPQ，(NMPF-3)LQG，(NMPF-4)LQGV，(NMPF-5)GVLPALPQ，(NMPF-6)VLPALP，(NMPF-7)VLPALPQ，(NMPF-8)GVLPALP，(NMPF-9)VVC，(NMPF-11)MTRV，(NMPF-12)MTR。
在巨噬细胞中NFκB分析小鼠巨噬细胞系将RAW 264.7小鼠巨噬细胞在含有10％或2％FBS，青霉素，链霉素和谷氨酰胺的DMEM中，在37℃、5％CO2条件下培养。将细胞种植在12孔平板(3×106个细胞/ml)中2小时，总体积为1ml，然后用LPS(E.coli 026B6；Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)和/或NMPF(1μg/ml)刺激。温育30分钟后，将平板离心及收集细胞以提取核提取物。
核提取物核提取物和EMSA根据Schreiber等所述方法制备(Schriber et al.1989，Nucleic Acids Research 17)。将细胞收集在试管中并以2000rpm(每分钟转数)在4℃离心5分钟(Universal 30 RF，HettichZentrifuges)。将沉淀用冰冻的Tris缓冲盐水(TBS pH 7.4)洗涤，再悬浮于400μl低渗缓冲液A(10mM HEPES pH 7.9，10mM KCl，0.1mMEDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(Complete Mini，Roche))中，在冰上放置15分钟。加入25μl 10％NP-40并将样品离心(2分钟，4000rpm，4℃)。收集上清(细胞质级分)并贮存于-70℃。将含有细胞核的沉淀用50μl缓冲液A洗涤并再悬浮于50μl缓冲液C(20mM HEPES pH 7.9，400mM NaCl，1mMEDTA，1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物及10％甘油)。将样品在4℃摇动至少60分钟。最后，将样品离心并将上清(核级分)贮存于-70℃。
用Bradford试剂(Sigma)确定提取物中最终蛋白质浓度。
EMSA为进行电泳迁移率变动分析，合成代表NF-KB结合序列的一种寡核苷酸(5′-AGC TCA GAG GGG GAC TTT CCG AGA G-3′)。将100pmol有义和反义寡聚物退火并使用T4多核苷酸激酶根据厂商指导用γ-32P-dATP标记(Promega，Madison，WI)。将核提取物(5-7.5μg)在结合反应混合物(20μl)中与75000cpm探针在室温温育30分钟，所述结合反应混合物含有0.5μg聚dI-dC(Amersham PharmaciaBiotech)及结合缓冲液BSB(25mM MgCl2，5mM CaCl2，5mM DTT和20％Ficoll)。将DNA-蛋白质复合物通过在4-6％聚丙烯酰胺凝胶中电泳(150V，2-4小时)而从游离寡核苷酸中分离。然后将该凝胶干燥并曝光于X线胶片。
结果转录因子NF-κB参与许多基因的转录调节，核蛋白质提取物从LPS(1mg/ml)，NMPF(1mg/ml)或者LPS与NMPF组合处理的RAW264.7细胞中制备。为确定NMPF肽是否调节NF-κB转位入细胞核中，对这些提取物进行EMSA。图54和55示出处理的RAW264.7细胞中存在的NF-κB量。图54示出NMPF肽能调节NF-κB的基础水平以及LPS诱导的NF-κB水平。在这个实验中，示出抑制LPS诱导的NF-κB转位的NMPF肽是NMPF-1(VLPALPQVVC)，NMPF-2(LQGVLPALPQ)，NMPF-3(LQG)，NMPF-4(LQGV)，NMPF-5(GVLPALPQ)，NMPF-6(VLPALP)，NMPF-9(VVC)，NMPF-12(MTR)及NMPF-14(环LQGVLPALPQVVC)。在这个实验中促进LPS诱导的NF-κB转位的NMPF肽是NMPF-7(VLPALPQ)，NMPF-8(GVLPALP)和NMPF-11(MTRV)。细胞核中NF-κB基础水平由NMPF-1(VLPALPQVVC)，NMPF-2(LQGVLPALPQ)，NMPF-3(LQG)和NMPF-4(LQGV)降低，而细胞核中NF-κB基础水平由NMPF-5(GVLPALPQ)，NMPF-7(VLPALPQ)，NMPF-8(GVLPALP)，NMPF-9(VVC)，NMPF-11(MTRV)，NMPF-12(MTR)和NMPF-13(LQGVLPALPQVVC)提高(图55)。在其它实验中，NMPF-10(QVVC)还示出调节NF-κB转位入细胞核中(数据未示出)。NMPF对DC的作用(ex vivo/体外)NOD和C57BL/6小鼠这些研究中使用的小鼠全部在鹿特丹的Erasmus医学中心(C57BL/6)或荷兰Balkbrug的Lucky Farm Company(NOD)的无病原体设备中饲养。所有小鼠均自由摄食和饮水。所述实验由荷兰鹿特丹的Erasmus医学中心的动物实验委员会批准。
体内处理在这个实验中使用13-14周龄的雌性NOD小鼠。随机分成10组，每组11只(NMPF-3，4，5和6)或13只(NMPF-7，4+5，4+6，5+6和4+5+6)小鼠，用PBS(PBS组)或NMPF(溶解于PBS中)处理。每种NMPF的注射量为100μg，总体积为100μl。在处理5周后，将小鼠处死并分离脾以纯化DC。
分离脾DC在无菌条件下取出PBS和NMPF处理的小鼠的脾。然后将脾用胶原酶D(Gibco BRL，life technologies)和DNase 1在RPMI-1640中37℃消化45分钟，产生单细胞悬浮液。通过与Gey′s培养基在正在融化的冰上温育5分钟取出红细胞。将细胞洗涤并根据厂商指导用N418磁珠(Miltenyi Biotec，Bisley，U.K.)和AutoMACS(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)富集表达CD11c的细胞。通过流式细胞计量术确定所述富集的细胞群由80-90％CD11c+和MHC II+细胞组成。集合每组获得的DC并在12孔平板(Nalge NuncInternational)中培养2小时(3×106个细胞/ml)，然后在体外用1μg/mlLPS(Sigma，E.Coli 026.B6)刺激30分钟。将细胞根据在核提取物段落中所述方案裂解并使用TransFactorTM试剂盒(Clontech，BD)分析NFκB(p65)。
分离骨髓衍生的DC针对这个实验，使用未处理的雌性NOD(13-14周龄)和C57BL/6(13-14周龄)小鼠。取出股骨和胫骨，使用具有0.45mm针头的注射器用MI-1640冲洗骨髓。骨髓悬浮液内的聚集部分通过强烈抽吸而分离，通过70微米细胞过滤器过滤。悬浮液中的红细胞用Gey′s培养基裂解并洗涤。每只小鼠获得大约4-6×107个骨髓细胞。
在开始培养时，将细胞浓度调节为在R10培养基中2×105个细胞/ml，R10培养基为无HEPES的RPMI-1640培养基，补加了100IU/ml青霉素，50mg/ml链霉素，1mM丙酮酸，50uM 2-ME，10％v/v热灭活的胎牛血清(Bio Whittaker，Europe)及20ng/ml重组小鼠粒细胞单核细胞集落刺激因子(rmGM-CSF；BioSource International，Inc.，USA)。然后将10ml细胞种植于100mm无附着物的细菌学培养平皿(Falcon)中。每种条件使用6个培养平皿。将培养物置于37℃5％CO2温育器中。在开始培养后，每3天在每个平皿中加入10ml新鲜R10培养基。在培养开始后11天，收集未附着的DC细胞，用Coulter Counter(Coulter)计数。
集合从每只小鼠获得的DC，在12孔平板(Nalge Nunc International)中培养2小时(3×106个细胞/ml)，然后在体外用5ng/ml LPS(Sigma，E.Coli 026.B6)或者LPS和1μg/ml NMPF(NMPF-1，2，5或6)刺激30分钟。根据在核提取物段落所述方案裂解细胞，使用TransFactorTM试剂盒(Clontech，BD)针对NFκB(p65)进行分析。
核提取物核提取物和EMSA根据Schreiber等所述方法制备(Schreiber et al.1989，Nucleic Acids Research 17)。将细胞收集在试管中，在4℃以2000rpm(每分钟转数)离心5分钟(Universal 30 RF，Hettich Zentrifuges)。用冰冷的Tris缓冲盐水(TBS pH 7.4)洗涤沉淀并再悬浮于400μl低渗缓冲液A(10mM HEPES pH 7.9，10mM KCl，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(Complete Mini，Roche))，在冰上放置15分钟。加入25μl10％NP-40并将样品离心(2分钟，4000rpm，4℃)。收集上清(细胞质级分)并贮存于-70℃。将含有细胞核的沉淀用50μl缓冲液A洗涤并再悬浮于50μl缓冲液C(20mM HEPES pH 7.9，400mM NaCl，1mMEDTA，1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物及10％甘油)。将样品在4℃摇动至少60分钟。最后，将样品离心并将上清(核级分)贮存于-70℃用Bradford试剂(Sigma)确定提取物中最终蛋白质浓度。
转录因子分析使用基于ELISA的TransFactorTM(Clontech，BD)试剂盒根据厂商指导分析NFκB亚基p65。
结果在处理的NOD小鼠的脾DC中的NFκB本领域熟知高血糖症与细胞核中的较高水平的NFκB相关。用NMPF-3，4，5，4+5，4+6，5+6和4+5+6处理的NOD小鼠与PBS处理的NOD小鼠相比示出糖尿病的发生率降低，并具有较低血糖水平(数据未示出)。当分析这些小鼠脾DC的核提取物中的NFκB时，NMPF处理的小鼠DC示出较低水平的NFκB(图56)。
NOD和C57b16小鼠中骨髓衍生的DC中的NFκB近来，Weaver et al J.Immunol 2001及其它人已经描述了NOD小鼠和I型糖尿病患者的DC中，由于活性过强的IKK所致NFκB调节中的缺陷。他们示出衍生自NOD小鼠的DC与衍生自C57BL/6和BALB/c小鼠的DC对各种形式的NFκB刺激更敏感。这增强了NODDC分泌IL-12的能力，在致糖尿病的应答期间促成病原性Th1(Tc1)细胞发育。Hegazy DM et al.Genes Immun 2001示出NFκB基因的多样性及对I型糖尿病的敏感性具有A10等位基因与具有A14等位基因的个体更可能发展为糖尿病。因此，我们测试了NMPF对NOD和C57BL/6小鼠DC中NFκB的作用。我们从这些小鼠中分离了骨髓(BM)并在存在GM-CSF的情况下培养，以产生BM衍生的DC。对附着和未附着的细胞均加以收集。获得的细胞群首先使用CD11c，CD 11b，MHC II(I-AK)和MHC I(H-2BD)抗体通过FACS进行鉴定(数据未示出)。在NOD和C57BL/6小鼠中，95％的细胞是CD11c+，90％是CD11b+。然而在NOD小鼠中，86％是CD11c+/CD11b+，而在C57BL/6小鼠中仅67％是CD11c+/CD11b+。这提示NOD和C57BL/6小鼠中DC的成熟和分化水平不相同。与C57BL6小鼠相比，我们观测到显著较低的DC产量(p＝0.0001)。之后，将DC用LPS(5ng/ml)和NMPF 1，2，5或6刺激30分钟，然后确定NFκB活性。
当用5ng/ml LPS刺激时，与未处理的DC相比，C57BL/6 DC不示出NFκB活化增加(图57)。然而，NOD DCs在用LPS刺激后示出NFκB活化增加2倍。NMPF对NFκB的作用在C57BL/6 DC中检测不到，因为用LPS刺激不引起NFκB活化。然而，在NOD DC中，NMPF能抑制(NMPF1，2，5和6)LPS诱导的NFκB活化(图57)。
这些结果示出在NOD DC中与在C57BL/6 DC中相比，NFκB过度应答，而且NMPF在NOD DC中抑制过度活性的NFκB活化。
肽的核位置实验使用反向高效液相层析(RP-HPLC)方法证实核提取物中存在合成的寡肽。使用装备Vydac单体C18柱(column218MS54，LC/MS C18reversed phase，300A，50m，4.6mm ID×250mm L)的Shimadzu HPLC系统；洗脱系统是于水中的0.01％TFA和5％乙腈(v/v)(CAN)梯度系统(A)，及于80％乙腈(ACN)中的0.01％TFA(v/v)梯度系统(B)；流速为0.5ml/min，在190-370nm测定吸光度。
梯度时间程序如下时间(min) 缓冲液B浓度0.01 05.0030.0 8040.0 10060.0 10065.0 070.0 0肽LQGV的洗脱时间通过在一单独的层析中注射2μg该肽而确定。在LCQ Deca XP(Thermo Finnigan)上对可能含有NMPF-4(LQGV)的级分进行质谱(MS)分析(洗脱时间通过在同一或单独的层析中注射所述肽而确定)。
结果肽的核位置实验对EMSA实验中使用的核蛋白质提取物也通过HPLC和MS检测LQGV的存在情况。图34示出HPLC层析(波长206)，其中叠加了从LPS及LPS与NMPF-4(LQGV)组合刺激的RAW264.7细胞的核蛋白质提取物中获得的数据图。这个图还示出寡肽加上LPS处理的细胞的核提取物与LPS处理的细胞的核提取物相比各种分子信号的存在与否。由于LQGV的HPLC图示出所述肽在大约12分钟洗脱(数据未示出)，因此收集相当于10-15分钟区间的级分并在MS中分析这种肽的存在情况。
所述肽的分子量为大约416道尔顿。除了416质量之外，图35还示出了一些其它分子量。这可以通过肽浓度高而诱导了二聚体和钠加成物的形成而解释(m/z 416-[M+H]+，438-[M+Na]+，831-[2M+H]+，853-[2M+Na]+，1245-[3M+H]+，1257-[3M+Na]+)。图36示出得自LPS刺激的细胞的核提取物的10-15分钟级分的MS结果。这些结果示出没有416道尔顿质量，而图37示出存在416道尔顿质量，MSn数据(图37)和MS序列证实得自LQGV+LPS刺激的RAW264.7细胞中的核蛋白质提取物中存在LQGV肽。
内毒素休克模型(脓毒病(sepsis))脓毒病为制备内毒素模型，将BALB/c小鼠腹膜内注射8-9mg/kg LPS(E.coli 026B6；Difco Lab.，Detroit，MI，USA)。对照组(PBS)仅用PBS经腹膜内处理。为测试不同来源(合成的，商业hCG制品[c-hCG])的NMPF的作用，在LPS注射2小时后，用300-700IU不同的hCG制品(PG23；Pregnyl batch no.235863，PG25；Pregnyl batch no.255957)及合成的肽(5mg/kg)处理BALB/c小鼠。在其它实验中，将BALB/c小鼠腹膜内注射10mg/kg或11mg/kg LPS(E.coli 026B6；Difco Lab.，Detroit，MI，USA)。在LPS处理2和24小时后，将小鼠用NMPF肽处理。
半定量疾病测定使用以下测定方案记录小鼠疾病的严重程度1 皮毛有渗出物，但与正常小鼠相比未检出行为差异。
2 皮毛有渗出物，蜷缩反射，对刺激(如敲击笼子)有应答，在手握期间如健康小鼠一样主动。
3 对敲击笼子应答减慢，当手握时处于被动或温顺状态，但单独在新环境中仍好奇。
4 缺乏好奇，对刺激很少应答或不应答，经常不动。
5 呼吸困难，在翻滚至背位后无力或缓慢翻滚右侧位(垂死)。
6 处死。
结果内毒素休克模型(脓毒病)脓毒病实验为确定合成肽(NMPF)在高剂量LPS休克模型中的作用，将BALB/c小鼠经腹膜内注射不同剂量的LPS，并在5天的时间里每天评估存活者。在这个实验中(LPS内毒素模型)，将BALB/c小鼠经腹膜内注射8-9mg/kg LPS(E.coli 026B6；Difco Lab.，Detroit，MI，USA)。对照组(PBS)仅用PBS经腹膜内注射处理。在注射LPS 2小时后，用300-700IU不同hCG制品(PG23；Pregnyl batch no.235863，PG25；Pregnyl batch no.255957)或用肽(5mg/kg)处理BALB/c小鼠。
这些实验示出(表1)NMPF肽4，6，66和PG23完全抑制休克(所有小鼠在前24小时内疾病分值均不高于2；不久之后完全康复，疾病分值为0)，而肽2，3和7加速休克(所有小鼠在前24小时内疾病分值为5，大多数死亡，而用LPS+PBS处理的对照小鼠在前24小时内疾病分值为3-4，大多数在具有疾病分值5之后48小时死亡(在72小时存活率为17％)。另外，肽1，5，8，9，11，12，13，14和64在不同实验中示出在功效以及活性类型(抑制vs促进)方面有可变性。这种可变性可能归因于各种肽的分解速度，以及各种肽及其分解产物在体内所具有的不同作用。另外，这些实验还示出在c-hCG制品中抗休克活性的可变性，其可能归因于抗休克和促进休克的NMPF中存在的变化。疾病迹象在所有实验动物中均可见，但动力学和疾病的严重程度明显不同。这些数据是至少10个独立实验的代表。
在表2中可见在脓毒性休克实验中，肽LQG，LQGV，VLPALP，VLPALPQ中的ALA置换作用(PEPSCAN)。推断甚至一个氨基酸由中性氨基酸置换即可引起不同的活性。因此，这些肽中基因组差异以及多样性可非常精确调节免疫应答。这些肽的衍生物也可引起更好的活性有效性，所述衍生物例如但非限于通过加入在合成期间或之后差别修饰的经典或非经典氨基酸或衍生物而产生，所述修饰例如苄基化，酰胺化，糖基化，蛋白酶解，与抗体分子或其它细胞配体连接等。
为确定用NMPF处理的BALB/c小鼠在疾病的不同阶段是否抑制脓毒性休克，在用高剂量LPS(10mg/kg)诱导脓毒性休克后2和24小时，经腹膜内注射合成的肽(NMPF)。
如表3和4所示，在诱导休克后用PBS处理的对照小鼠在14和24小时达到疾病分值5，并在第二次注射PBS之后仍保持如此状态。对照组在48小时的存活率为0％。与对照组相反，用NMPF 9，11，12，43，46，50和60处理的小鼠在诱导脓毒性休克后24小时达到最大疾病分值2-3，并在第二次注射NMPF之后在48小时进一步达到最大疾病分值1-2。另外，用NMPF 5，7，8，45，53和58处理的小鼠达到疾病分值5，在第二次注射NMPF之后，所有小鼠均恢复为疾病分值1-2，在NMPF组中存活率为100％。用NMPF 3处理的小鼠达到疾病分值3-4，第二次注射NMPF后挽救了这些小鼠。这些实验示出NMPF肽在疾病不同阶段具有抗休克活性，而且NMPF甚至在已经出现其它不可逆转损害时的疾病阶段仍具有抗休克活性。这表明NMPF在不同细胞水平均有作用，而且还具有修复和再生能力。
树突细胞实验小鼠在这项研究中使用的小鼠品系是BALB/c(Harlan，Bicester，Oxon，GB)。在实验中使用的所有小鼠均为雌性8-12周龄的小鼠。
将小鼠在特殊的无病原体的设备中饲养。荷兰鹿特丹Erasmus大学的动物使用委员会批准了所有研究。
体内处理为每组至少6只小鼠经腹膜内注射LPS(10mg/kg；Sigma)。在LPS诱导2和24小时后，将小鼠经腹膜内注射100μl的NMPF(5mg/kg)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在这个模型中LPS诱导的休克在48小时有90％以上死亡率。
骨髓细胞培养从处理的小鼠中分离骨髓细胞并如下培养。通过CO2窒息杀死BALB/c小鼠。在无菌条件下取出股骨和胫骨并剥离肌和肌腱。将骨置于R10培养基(RPMI 1640，补加50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素，0.2M丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺，50μM 2-巯基乙醇和10％胎牛血清(Bio Whittaker，Europe))中。
然后将骨通过使用无菌棉纸更彻底清洁，移至具有2ml R10培养基的冰冷研钵中。将骨用研钵粉碎以从骨中获得细胞。将细胞通过无菌100μM滤膜(Beckton Dickinson Labware)过滤并收集在50ml试管中(FALCON)。重复这个步骤直至骨部分呈现透明状态。
将分离的细胞再悬浮于10ml的RIO中，加入30ml的Geys培养基。将细胞悬浮液在冰上保持30分钟，以裂解红细胞。
之后，将细胞在R10培养基中洗涤两次。在开始培养时，将细胞浓度调节为于R10培养基中2×105个细胞/ml，所述培养基中补加20ng/ml重组小鼠粒细胞单核细胞集落刺激因子(rmGM-CSF；BioSourceInternational，Inc.，USA)，将细胞种植于100mm无附着物的细菌学培养平皿(Falcon)中。针对每种条件，使用6个培养平皿并进一步分析，集合细胞并如前述分析。将培养物置于37℃，5％CO2-温箱中。在开始培养后每3天在每个平皿中加入一次10ml新鲜R10培养基，该培养基中补加了20ng/ml的rmGM-CSF。
在开始培养后9天，收集未附着的细胞并用Coulter Counter(Coulter)计数。
或者，如上所述从未处理的小鼠中分离BM细胞及培养，并在体外用如下条件处理在培养开始后第0天或第6天加入NMPF 4，NMPF46，NMPF 7，NMPF 60(20μg/ml)。或者在第6天加入有或无NMPF的LPS(1pg/ml)。
免疫荧光染色将细胞(2×105)用FACS缓冲液(具有1％BSA和0.02％叠氮化钠的PBS)洗涤，移至一个圆底96孔平板(NUNC)中。用于染色的抗体是MHC-II(I-A/I-E)PE和CD11c/CD18 FITC(PharMingen/Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，US)。
将细胞再悬浮于200μl FACS缓冲液中，其含有浓度为2.5ng/μl抗体的这两种抗体。然后将细胞在4℃温育。之后，将细胞洗涤3次并最后再悬浮于200μl FACS缓冲液中，在FACSCalibur流式细胞计量仪(Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)中进行流式细胞计量分析。所有FACS数据均使用CellQuest软件(Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)进行分析。
统计学分析高于20％的差异认为是显著的。
结果树突细胞实验ex vivo骨髓细胞培养物的细胞产量为确定LPS和NMPF处理对得自骨髓与rmGM-CSF的9天培养物的细胞产量的体内作用，如上所述将细胞从处理的小鼠的BM中分离并培养，收获并计数。如图1和2所述，LPS(10mg/kg)处理的小鼠的骨髓培养物的细胞产量与PBS处理的小鼠相比明显降低。在LPS诱导休克之后，用NMPF 4，NMPF7，NMPF 46和NMPF 60处理的小鼠与在存在rmGM-CSF时用LPS处理的小鼠相比细胞产量明显提高。另外，得自NMPF46处理的小鼠的BM培养物甚至与PBS组相比明显提高细胞产量。
体内处理的骨髓衍生的DC的免疫荧光染色在存在rmGM-CSF情况下培养BM细胞使针对CD11c和MHC-II是阳性的细胞数增加。针对这些细胞膜标记是阳性的细胞是骨髓衍生的树突细胞(DC)。DC是潜在的抗原呈递细胞(APC)，并调节免疫应答。为确定骨髓产生的DC的成熟状态，将细胞用CD11c和MHC-II染色。
如图3所示，与PBS组相比，LPS处理的小鼠的CD11c阳性细胞上MHC-II分子的表达明显降低。MHC-II表达中的这种降低通过在体内用NMPF 4和NMPF 46处理进一步加强。然而，用NMPF 7和NMPF 60处理甚至与PBS组相比仍明显提高MHC-II分子表达。
体外骨髓细胞培养物的细胞产量为确定LPS和NMPF在体外对骨髓细胞的9天培养物的细胞产量的作用，从未处理的BALB/c小鼠中分离BM细胞，并在存在rmGM-CSF的情况下培养。除了rmGM-CSF之外，向培养物中在第0天或第6天补加NMPF，在第6天加入或不加入LPS。
如图4-7所示，LPS处理的BM细胞与PBS处理组相比细胞产量明显降低。用NMPF 4，7，46或60在第0天或第6天无LPS处理的BM细胞，示出与PBS组相比细胞产量明显增加。然而，用NMPF 4在第6天处理的BM细胞培养物示出与PBS组相比细胞产量明显降低，这种作用与LPS的作用相似(图4)。另外，用NMPF 4，7，46或60在第6天与LPS组合处理的BM细胞示出与LPS组相比细胞产量明显增加，甚至在NMPF 7组中，细胞产量与PBS组相比也明显增加。
体外处理的骨髓衍生的DC的免疫荧光染色为确定DC的成熟状态，将CD11c阳性细胞针对MHC-II抗体进行染色。图7-11示出LPS对MHC-II表达与体内实验相比具有相反作用，即LPS体外处理组与PBS组相比MHC-II表达明显提高。NMPF 4与LPS组合进一步加强LPS的作用，而NMPF 7在有或无LPS(t＝6)的情况下分别与LPS和PBS处理组相比明显抑制MHC-II表达。然而，用NMPF 46而无LPS(t＝0)处理的细胞示出CD11c阳性细胞上MHC-II表达明显增加。另外，在NMPF 60及有或无LPS的处理组中发现与LPS和PBS处理的细胞相比对MHC-II表达无明显不同。
为确定LPS和NMPF处理对得自骨髓与rmGM-CSF的9天培养物的细胞产量的体内作用，如上述从处理的小鼠中分离BM并培养，收获并计数。“附着”细胞的细胞产量在NMPF 4，7，9，11，43，46，47，50，53，58，60处理组中明显增加，甚至在NMPF 7，46和60处理组中细胞产量与PBS组相比也明显增加(图14-15)。另外，“未附着”细胞的细胞产量在NMPF 4，7，9，11，46，50，53，58，60处理组中明显增加，同样在NMPF 46处理组中细胞产量与PBS组相比也明显提高(图12，13)。
为确定LPS和NMPF在体外对雌性NOD小鼠的骨髓细胞的9天培养物的细胞产量的作用，从未处理的NOD小鼠中分离BM细胞，并在存在rmGM-CSF的情况下培养。除了rmGM-CSF之外，培养物中还补加了NMPF。在这些实验中，“未附着”细胞的骨髓细胞产量在NMPF 1，2，3，4，5，6，7，8，9，12和13处理组中与PBS组相比明显增加，在NMPF11处理组中观测到无作用(图16)。这些实验的“附着”骨髓细胞示出与“未附着”的细胞不同的产量，即在用NMPF 3和13处理的培养物中细胞产量明显增加，而用NMPF 2和6处理的培养物中示出与PBS组相比细胞产量明显降低(图17)(更多的额外结果概括于表5)。
冠状动脉闭塞(CAO)实验CAO诱导和处理NMPF在慢性炎症以及急性炎症小鼠模型中具有免疫调节作用。由于一些细胞因子如TGFβ，TNFα，IL-1和ROS(活性氧)参与由长期冠状动脉闭塞及再灌注所产生的不可逆转的心肌损害，引起局部缺血和心肌梗塞，我们在随意饲养的雄性Wistar大鼠(300g)中测试了这些肽的心脏保护性质。根据由美国生理学协会委员会批准的动物关怀及使用指导原则以及鹿特丹Erasmus大学动物关怀委员会的规定进行实验。简而言之，将大鼠(3只)稳定30分钟，随后在10分钟内静脉内注射1ml肽(0.5mg/ml)进行处理。在完成处理后5分钟，将大鼠进行60分钟冠状动脉闭塞(CAO)。在CAO之后5分钟，将大鼠再次在10分钟时间内静脉内注射1ml肽(0.5mg/ml)，随后再灌注(IP)120分钟。实验及手术程序详见于Cardiovascular Research37(1998)76-81中所述。在每个实验结束时，将冠状动脉再次闭塞并灌注10ml台盼蓝(0.4％，Sigma Chemical Co.)以将正常灌注的心肌染成深蓝色，描绘了未染色的危险区(AR)。然后将心脏迅速切离并从上至下切成1mm的薄片。使用显微外科剪刀从每个薄片中去除右心室并将左心室分成AR区和剩余的左心室。然后将AR区在37℃在Nitro-Blue-Tetrazolium(Sigma Chemical Co.；1mg/ml Sorensen缓冲液，pH 7.4)中温育10分钟，其将活组织染成紫色，但梗塞的组织不染色。在从未梗塞区中分离梗塞区(IA)之后，将LV的不同区域干燥并单独称重。梗塞大小以与AR区的百分比表示。对照大鼠用PBS处理。
结果冠状动脉闭塞(CAO)实验我们的CAO数据示出对照组中仅用PBS处理的15只大鼠在60分钟CAO及随后再灌注2小时后，梗塞面积为70±2％(平均值±标准误差)。而用肽VLPALP，LQGV，VLPALPQVVC，LQGVLPALPQ，LAGV，LQAV和MTRV处理的大鼠梗塞面积分别为62.6％，55.6％，55.5％，67.2％，51.4％，62.6％及68.12％。在此我们观测到某些肽(如VLPALP，LQGV，VLPALPQVVC，LAGV)对梗塞危险区具有保护作用。另外，肽LQAV处理示出较小的梗塞面积，但在一些情况中，该区域时出血性梗塞。另外，NMPF-64(LPGCPRGVNPVVS)在CAO实验中也具有保护作用(35％)。令人注意的是用某些上述肽处理的大鼠示出血液粘稠度较低。除了免疫学作用之外，这些肽对血液凝固系统也许还具有直接或间接作用，因为它们与血液凝固因子有一些相同之处(NMPF的其它结果见表5)。因此，在这两个模型中，循环系统在所述疾病的发病机制中起重要作用。
鸡卵实验用NMPF在体内处理受精鸡卵。将受精的鸡卵(Drost LoosdrechtBV，the Netherlands)以对角线位置在孵化器中(Pas Reform BV，theNetherlands)在37℃和32％相对湿度下孵化。
在PBS中产生NMPF肽(1mg/ml)和VEGF溶液。每种条件注射至少10只鸡卵。如下进行处理孵化第0天，在蛋壳上钻一个洞以打开气囊。在第一个洞右下方10mm处钻第二个洞以进行注射。将蛋壳上的洞用碘酒消毒。注入100μl的NMPF肽(100μg/卵)和/或VEGF(100ng/ml)。将蛋壳上的洞用胶带(Scotch MagicTMTape，3M)密封，并将鸡卵置于孵化器中。
量化血管发生在孵化第7天，将鸡卵在UV灯下观测以检测胚胎是否以正常方式发育，并计数死亡的胚胎。在孵化的第8天，将胚胎通过在鸡卵底部打开蛋壳从鸡卵中取出。将蛋壳膜小心切开并去除。将胚胎置于一个100mm培养平皿中。使用显微镜(Zeiss Stemi SV6，Germany)为胚胎和血管体内照相(Nikon E990，Japan)。照1张一般观察照片及4张血管详细照片。只对具有存活胚胎的鸡卵进行评估。
数据分析血管发生的量化通过计数血管分枝数而实现。血管形成的量化通过测定血管厚度而实现。使用Corel Draw 7在照片中计数血管分枝数和血管厚度(4张照片/鸡卵)。之后，将血管分枝数和血管厚度数值与显微镜的光栅(10mm2)联系起来以用于对比。计算每种条件(10种)下血管分枝平均数和血管平均厚度并使用Student′s T检验与PBS对照组对比。
结果鸡卵实验为确定NMPF对血管发生和血管形成的作用，如材料和方法部分所述用NMPF或者NMPF与VEGF的组合处理受精鸡卵。图20-30示出NMPF 3，4，9和11促进血管发生(p＜0.05)，而NMPF VEGF，7，43，44，45，46，51和56抑制血管发生(p＜0.05)。NMPF 6，7，12，45，46和66能抑制VEGF诱导的血管发生。另外，NMPF 6自身未示出对血管发生的任何作用，但其抑制(p＜0.05)NMPF 3诱导的血管发生。
图31-32示出NMPF1，2，3，4，6，7，8，12，50，51和52具有血管形成抑制作用(p＜0.05)，只有NMPF 44促进(p＜0.05)血管形成。
NOD实验小鼠将13-14周龄的雌性小鼠经腹膜内注射PBS(6只)或NMPF肽(VLPALPQVVC，LQGV，GVLPALPQ，VLPALP，VLPALPQ，MTRV，LPGCPRGVNPVVS，CPRGVNPVVS，LPGC，MTRVLQGVLPALPQVVC，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL)(5mg/kg，n＝6)进行处理，每周3次共两周。每4天检测尿液葡萄糖含量(Gluketur Test；Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)。将这些研究中使用的所有小鼠均在无病原体设备中饲养。使其自由摄食和饮水。该实验由鹿特丹Erasmus大学动物实验委员会批准。使用AbbottMedisense Precision血糖仪测定静脉血葡萄糖水平而评估糖尿病。如果两次连续测定葡萄糖水平≥11mmol/1(200mg/dl)则认为小鼠具有糖尿病。糖尿病的发作从第一次连续读数开始确定日期。
在28周龄的禁食小鼠中(5只)通过腹膜内注射(i.p.)1g/kg D-葡萄糖进行葡萄糖耐量试验(GTT)。在0(禁食)，5，30和60分钟从尾静脉收集血样并测试葡萄糖含量。
NO试验细胞培养将得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)的RAW264.7鼠巨噬细胞系，在37℃及5％CO2条件下使用含有10％胎牛血清(FCS)，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素，0.2M丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺和50μM 2-巯基乙醇的DMEM中培养(Bio Whittaker，Europe)。每两天更换一次培养基。
亚硝酸盐测定在RAW 264.7巨噬细胞上清中测定亚硝酸盐的产生情况。将细胞(7.5×105/ml)在48孔平板中的500μl培养基中培养。将细胞用LPS(10μg/ml)和/或NMPF(1pg/ml，1ng/ml，1μg/ml)刺激24小时，然后收集培养基。亚硝酸盐通过向100μl培养基样品中加入100μl Griess试剂(Sigma)而测定。使用微量平板读数器测定OD540，亚硝酸盐浓度通过与使用亚硝酸钠在培养基中的标准溶液产生的OD540对比而计算。
结果NOD实验为确定NMPF对NOD小鼠中疾病进展是否有作用，测试NMPF对预先糖尿病化的13-14周龄的雌性NOD小鼠的作用。仅在处理两周后(每隔一天注射NMPF(5mg/kg))，分析所有NOD小鼠17周龄的糖尿数据。在不同的NMPF组中观测到与PBS组相比有意义的抗糖尿作用(小鼠糖尿阴性)，尤其在用肽VLPALPQVVC，VLPALP，MTRV，LPGCPRGVNPVVS和LPGC处理的NMPF组中。另外，葡萄糖耐量试验的损害与胰岛炎正相关，但与功能性β细胞的数目负相关，这个试验还示出用NMPF成功处理的NOD小鼠与PBS组相比耐受葡萄糖。我们的结果示出PBS处理的NOD小鼠在23周均患有糖尿病。而用NMPF每周3次共处理两周的NOD小鼠示出有意义的对糖尿病进展的抑制。最强的抗糖尿病作用在用NMPF-1，4，5，6，7，65，66和商业hCG制品(Pregnyl，Organon，Oss，The Netherlands，batch no.235863)处理组中观测到。这些小鼠具有低空腹血糖水平并耐受葡萄糖(数据部分示出)。然而，NMPF-71示出对糖尿病的发生率无作用，而NMPF-64和NMPF-1具有中等抗糖尿病作用。
NO实验NO产生是血管和炎症应答的一种重要介导因子。我们的结果示出LPS刺激的巨噬细胞(RAW 264.7)产生大量NO。然而，用甚至非常低剂量(1pg/ml)的大多数NMPF肽(NMPF肽1-14，43-66和69)共刺激这些细胞均抑制NO产生。
结果ApoE实验本发明提供了一种方法和一种信号传导分子以治疗与LDL受体功能异常相关的病变，所述LDL受体如ApoE及阿朴脂蛋白家族其它成员。特别地，优选使用包含GVLPALPQ(NMPF-5)和/或VLPALP(NMPF-6)或其功能类似物或衍生物的一种信号传导分子。ApoE缺陷小鼠实验组(6只/组)给予高胆固醇饮食并每隔一天腹膜内注射PBS或NMPF。2.5周后，测定体重，如下表所示。
平均体重(g)SD(g)p值ApoE-/-PBS 31.667 1.007ApoE-/-NMPF-431.256 1.4960.536ApoE-/-NMPF-529.743 1.1600.019背景/PBS 26.760 1.58210-6ApoE-/-NMPF-629.614 1.0640.004在数据库中分析不同的肽分析肽的不同数据库例如是
蛋白质组学工具相似性检索BLAST数据库(ExPasy，NCBI)SMART(EMBL)PATTINPROT(PBIL)翻译后修饰预测SignalP(CBS)一级结构分析HLA肽结合预测(BIMAS)MHC I型和II型肽结合(SYFPEITHI)氨基酸级表现(疏水性，其它构象参数等)(PROTSCALE)一个蛋白质片段作为螺旋轮的表现(Helix Wheel/HelixDraw)结果可从蛋白质数据库中产生的用于鉴别本发明信号传导分子方法中的相关寡肽不完全列表pdb|1DE7|1DE7-AINTERACTION OF FACTOR XIII ACTIVATION PEPTIDE WITHALPHA-THROMBINLQGV，LQGVV，LQGVVP
pdb|1DL6|1DL6-ASOLUTION STRUCTURE OF HUMAN TFIIB N-TERMINALDOMAINLDALPpdb|1QMH|1QMH-ACRYSTAL STRUCTURE OF RNA 3′-TERMINAL PHOSPHATECYCLASE，AN UBIQUITOUS ENZYMELQTV，VLPAL，LVLQTVLPALpdb|1LYP|1LYPCAP18(RESIDUES 106-137)IQG，IQGL，LPKL，LLPKLpdb|1B9O|1B9O-AHUMAN ALPHA-LACTALBUMINLPELpdb|1GLU|1GLU-AGLUCOCORTICOID RECEPTOR(DNA-BINDING DOMAIN)PARPpdb|2KIN|2KIN-BKINESIN(MONOMERIC)FROM RATTUS NORVEGICUSMTRIpdb|1SMP|1SMP-IMOL_ID1；MOLECULESERRATIA METALLO PROTEINASE；CHAINALQKL，LQKLL，PEAP，LQKLLPEAPpdb|1ES7|1ES7-BCOMPLEX BETWEEN BMP-2 AND TWO BMP RECEPTOR IAECTODOMAINSLPQ，PTLP，LQPTLpdb|1BHX|1BHX-FX-RAY STRUCTURE OF THE COMPLEX OF HUMAN ALPHATHROMBIN WITH THE INHIBITOR SDZ 229-357LQV，LQVVpdb|1VCB|1VCB-ATHE VHL-ELONGINC-ELONGINB STRUCTUREPELPpdb|1CQK|1CQK-ACRYSTAL STRUCTURE OF THE CH3 DOMAIN FROM THEMAK33 ANTIBODYPAAP，PAAPQ，PAAPQVpdb|1FCB|1FCB-AFLAVOCYTOCHROMELQG，pdb|1LDC|1LDC-AL-LACTATE DEHYDROGENASECYTOCHROME COXIDOREDUCTASE(FLAVOCYTOCHROME B＝2＝)(E.C.1.1.2.3)MUTANT WITH TYR143 REPLACED BY PHE(Y143F)COMPLEXED WITH PYRUVATELQGpdb|1BFB|1BFBBASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR COMPLEXED WITHHEPARIN TETRAMER FRAGMENT
LPAL，PALP，PALPEpdb|1MBF|1MBFMOUSE C-MYB DNA-BINDING DOMAIN REPEAT 1LPNpdb|1R2A|1R2A-ATHE MOLECULAR BASIS FOR PROTEIN KINASE ALQG，LTELLpdb|1CKA|1CKA-BC-CRK (N-TERMINAL SH3 DOMAIN)(C-CRKSH3-N)COMPLEXEDWITH C3G PEPTIDE(PRO-PRO-PRO-ALA-LEU-PRO-PRO-LYS-LYS-ARG)PALPpdb|1RLQ|1RLQ-RC-SRC(SH3 DOMAIN)COMPLEXED WITH THE PROLINE-RICHLIGAND RLP2(RALPPLPRY)(NMR，MINIMIZED AVERAGE STRUCTURE)LPPL，PPLPpdb|1TNT|1TNTMU TRANSPOSASE(DNA-BINDING DOMAIN)(NMR，33STRUCTURES)LPG，LPGL，LPKpdb|1GJS|1GJS-ASOLUTION STRUCTURE OF THE ALBUMIN BINDING DOMAINOF STREPTOCOCCAL PROTEIN GLAAL，LAALPpdb|1GBR|1GBR-BGROWTH FACTOR RECEPTOR-BOUND PROTEIN 2(GRB2，N-TERMINAL SH3 DOMAIN)COMPLEXED WITH SOS-A PEPTIDE(NMR，29STRUCTURES)LPKL，PKLPpdb|1A78|1A78-ACOMPLEX OF TOAD OVARY GALECTIN WITH THIO-DIGALACTOSEVLPSIPpdb|1ISA|1ISA-AIRON(II)SUPEROXIDE DISMUTASE(E.C.1.15.1.1)LPAL，PALPpdb|1FZV|1FZV-ATHE CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN PLACENTA GROWTHFACTOR-1(PLGF-1)，AN ANGIOGENIC PROTEIN AT 2.0A RESOLUTIONPAVP，MLPAVPpdb|1JLI|1JLIHUMAN INTERLEUKIN 3(IL-3)MUTANT WITH TRUNCATION ATBOTH N-AND C-TERMINI AND 14 RESIDUE CHANGES，NMR MINIMIZEDAVERAGELPC，LPCL，PCLPpdb|1HSS|1HSS-A0.19 ALPHA-AMYLASE INHIBITOR FROM WHEATVPALP
pdb|3CRX|3CRX-ACRE RECOMBINASE/DNA COMPLEX INTERMEDIATE ILPA，LPAL，PALPpdb|1PRX|1PRX-AHORF6 A NOVEL HUMAN PEROXIDASE ENZYMEPTIP，VLPTIPpdb|1RCY|1RCYRUSTICYANIN(RC)FROM THIOBACILLUS FERROOXIDANSVLPGFPpdb|1A3Z|1A3ZREDUCED RUSTICYANIN AT 1.9 ANGSTROMSPGFP，VLPGFPpdb|1GER|1GER-AGLUTATHIONE REDUCTASE(E.C.1.6.4.2)COMPLEXED WITHFADLPALP，PALPpdb|1PBW|1PBW-ASTRUCTURE OF BCR-HOMOLOGY(BH)DOMAINPALPpdb|1BBS|1BBSRENIN(E.C.3.4.23.15)MPALPAI18887211.3 366 327 18 382[Homo sapiens]qd27c01.x1Soares_placenta_8to9weeks_2NbHP8to9WHomo sapiens cDNA clone IMAGE1724928 3′similar togbJ00117 CHORIOGONADOTROPIN BETA CHAIN PRECURSOR(HUMAN)；，mRNA sequence.；minus strand；translatedMXRVLQGVLPALPQVVC，MXRV，MXR，AI12690619.8 418 343 1 418[Homo sapiens]qb95f01.x1 Soares_fetal_heart_NbHH19WHomo sapiens cDNA clone IMAGE1707865 3′similar to gbJ00117CHORIOGONADOTROPIN BETA CHAIN PRECURSOR(HUMAN)；，mRNA sequence.；minus strand；translatedITRVMQGVIPALPQVVCAI22158129.1 456 341 23 510[Homo sapiens]qg20a03.x1Soares_placenta_8to9weeks_2NbHP8to9W Homo sapiens cDNA clone IMAGE1760044 3′similar to gbJ00117 CHORIOGONADOTROPIN BETA CHAIN PRECURSOR(HUMAN)；，mRNA sequence.；minus strand；translatedMTRVLQVVLLALPQLVMm.42246.3Mm.42246 101.3 837 304 28 768 GENE＝Pck1 PROTSIM＝pirT24168phosphoenolpyruvate carboxykinase 1，cytosolic；translatedKVIQGSLDSLPQAV，LDSL，LPQMm.22430.1Mm.22430 209.4 1275 157 75 1535 GENE＝Ask-pending
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PGAP，LPQRPRGPNP，LPQ，PRGP，PNPHs.303116.2 PROTSIM＝pir；T33097 stromal cell-derived factor 2-likel；translatedGCPRpdb|1DU3|1DU3-ACRYSTAL STRUCTURE OF TRAIL-SDR5GCPRGMpdb|1DOG|1DOG-RCRYSTAL STRUCTURE OF DEATH RECEPTOR 5(DR5)BOUNDTO APO2L/TRAILGCPRGMpdb|1BIO|1BIOHUMAN COMPLEMENT FACTOR D IN COMPLEX WITH ISATOICANHYDRIDE INHIBITORLQHVpdb|4NOS|4NOS-AHUMAN INDUCIBLE NITRIC OXIDE SYNTHASE WITHINHIBITORFPGC，PGCPpdb|1FL7|1FL7-BHUMAN FOLLICLE STIMULATING HORMONEPARP，VPGCpdb|1HR6|1HR6-AYEAST MITOCHONDRIAL PROCESSING PEPTIDASECPRG，LKGCpdb|1BFA|1BFARECOMBINANT BIFUNCTIONAL HAGEMAN FACTOR/AMYLASEINHIBITOR FROMPPGP，LPGCPREV，LPGC，PGCP，CPREswissnew|P01229|LSHB HUMANLutropin beta chain precursorMMRVLQAVIPPLPQVVC，MMR，MMRV，LQA，LQAV，VLPPLP，PPLP，QGVVC，VVC，VLPPLPQ，AVLPPLP，AVLPPLPQswissnew|P07434|CGHB PAPANChoriogonadotropin beta chain precursorMMRVLQAVLPPVPQVVC，MMR，MMRV，LQA，LQAG，VLPPVP，VLPPVPQ，QVVC，VVC，AVLPPVP，AVLPPVPQswissnew|Q28376|TSHB HORSEThyrotropin beta chain precursorMTRD，LPK，QDVC，DVC，IPGC，PGCPswissnew|P95180|NUOB MYCTUNADH dehydrogenase I chain BLPGC，PGCPsptrembl|Q9Z284|Q9Z284NEUTROPHIL ELASTASEPALP，PALPSsptrembl|Q9UCG8|Q9UCG8URINARY GONADOTROPHIN PEPTIDE(FRAGMENT)LPGGPR，LPG，LPGG，GGPR.
XP_028754 growth hormone releasing hormone[Homo sapiens]LQRG，LQRGV，LGQL
一个进一步非限制性列表包括胶原蛋白，PSG，CEA，MAGE(黑素瘤相关的生长抗原)，血小板反应蛋白-1，生长因子，MMP，钙调蛋白，嗅感受蛋白，细胞色素p450，激酶，Von Willebrand因子(凝固因子)，液泡蛋白(ATP合成酶)，糖蛋白激素，DNA聚合酶，脱氢酶，氨基肽酶，胰蛋白酶，病毒蛋白(如包膜蛋白)，弹性蛋白，冬眠相关蛋白，抗冻糖蛋白，蛋白酶，环子孢子蛋白，核受体，转录活动蛋白，细胞因子及其受体，细菌抗原，Nramp，RNA聚合酶，细胞骨架蛋白，造血(神经)膜蛋白，免疫球蛋白，HLA/MHC，G-偶联蛋白及其受体，TATA结合蛋白，转移酶，锌指蛋白，剪接蛋白，HMG(高速泳动族蛋白)，ROS(活性氧)，超氧化物酶，超氧化物歧化酶，原癌基因/肿瘤阻抑基因，载脂蛋白。
SignalP(CBS)SignalP预测(例如)MTRVLQGVLPALPQVVCHLA肽结合预测(BIMAS)(例如)半解离时间I型HLA分子(A_0201)VLQGVLPAL(84)GVLPALPQV(51)VLPALPQVV(48)RLPGCPRGV(14)TMTRVLQGV(115)分值MHC II(H2-Ak 15-mers)CPTMTRVLQGVLPAL 14PGCPRGVNPVVSYAV 14HLA-DRB1*0101 15-mers PRGVNPVVSYAVALS 29TRVLQGVLPALPQVV 28
LQGVLPALPQVVCNY 22HLA-DRB1*0301(DR17)15-mers CPTMTRVLQGVLPAL 26MTRVLQGVLPALPQV 21SIRLPGCPRGVNPVV 17表1 小鼠休克实验结果测试物质 在如下时间(小时)的存活百分率(％)0164072PBS 100 100 6717PG23 100 100 100 100PG25 100 838383肽NMPF序列1 VLPALPQVVC 100 1050172 LQGVLPALPQ 100 670 03 LQG 100 8320174 LQGV 100 100 100 1005 GVLPALPQ 100 100 80176 VLPALP 100 100 100 1007 VLPALPQ 100 830 08 GVLPALP 100 100 83679 VVC 100 100 505011 MTRV 100 100 675012 MTR 100 100 675013 LQGVLPALPQVVC100 100 100 10014 (环)LQGVLPALPQVVC100 83838364 LPGCPRGVNPVVS100 100 100 10066 LPGC 100 100 100 100
表2 休克实验的额外结果NMPF序列ID抗休克作用LQGV+++AQGV+++LQGA+++VLPALP +++ALPALP ++VAPALP ++ALPALPQ ++VLPAAPQ ++VLPALAQ +++加速休克作用LAGV+++LQAV+++VLAALP +++VLPAAP +++VLPALA +++VLPALPQ +++VLAALPQ +++VLPALPA +++
表3 休克实验的进一步额外结果NMPF肽 在如下时间(小时)的存活百分率(％)Tx Tx0142448PBS 100 100 100 0NMPF-3 100 100 100 0NMPF-5 100 100 100 100NMPF-7 100 100 100 67NMPF-8 100 100 100 100NMPF-9 100 100 100 100NMPF-11 100 100 100 100NMPF-12 100 100 100 100NMPF-43 100 100 100 100NMPF-45 100 100 100 100NMPF-46 100 100 100 100NMPF-50 100 100 100 100NMPF-53 100 100 100 100NMPF-58 100 100 100 100NMPF-60 100 100 100 100
表4 进一步的额外结果NMPF肽 疾病分值Tx Tx0 14 24 48PBS0，0，0，0，0，05，5，5，5，4，45，5，5，5，5，5NMPF-3 0，0，0，0，0，03，3，3，3，3，44，4，4，4，4，4NMPF-5 0，0，0，0，0，05，5，5，5，5，55，5，5，5，5，52，2，2，2，2，2NMPF-7 0，0，0，0，0，01，1，4，4，4，45，5，5，5，5，52，2，2，2，NMPF-8 0，0，0，0，0，03，3，5，5，5，55，5，5，5，5，52，2，4，4，4，5NMPF-9 0，0，0，0，0，03，3，4，4，5，52，2，2，2，2，21，1，2，2，2，2NMPF-110，0，0，0，0，01，1，3，3，4，42，2，2，2，4，41，1，1，1，1，1NMPF-120，0，0，0，0，01，1，1，1，3，31，1，1，1，1，11，1，1，1，1，1NMPF-430，0，0，0，0，01，1，4，4，4，41，1，1，1，3，32，2，2，2，2，2NMPF-450，0，0，0，0，05，5，5，5，4，43，3，4，4，5，52，2，4，4，5，5NMPF-460，0，0，0，0，01，1，2，2，3，31，1，2，2，2，21，1，1，1，1，1NMPF-500，0，0，0，0，01，1，1，1，3，32，2，2，2，3，31，1，1，1，1，1NMPF-530，0，0，0，0，05，5，5，5，5，55，5，5，5，5，51，1，2，2，2，2NMPF-580，0，0，0，0，05，5，5，5，3，35，5，5，5，3，31，1，1，1，1，1NMPF-600，0，0，0，0，01，1，4，4，2，22，2，2，2，4，41，1，1，1，1，1
表5 各种肽在各种实验致的结果总结
+＝有效；-+＝可变效果；空格表示在作表时无效或者未测试表6 NO和/或TNF-A的调节
从-+至+++++++代表从刚有调节活性至调节活性非常高。
猴实验NMPF的功效在此将LQGV，AQGV和VLPALP的1∶1∶1混合物施用于革兰氏阴性菌诱导的猕猴脓毒病模型以预防脓毒性休克。
势不可挡的炎症和免疫应答是脓毒性休克的基本特点并在组织损害，多器官损伤及脓毒病引起的死亡的发病机制中起重要作用。细胞因子尤其肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-1β，及巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)已经示出是脓毒性休克的关键介导因子。然而，传统的抗TNF和抗IL-1治疗未表现出对具有严重脓毒病的患者有更多的益处。我们设计了在小鼠中完全阻断LPS诱导的脓毒性休克的肽，即使当注射LPS后接近24小时才开始用这些肽治疗也完全阻断脓毒性休克。这些肽还能抑制MIF产生。这个发现提供了使用这些肽治疗患有脓毒性休克患者的可能性。由于灵长类动物与人在进化上更接近，我们测试了这些肽在灵长类动物中的安全性和有效性。
实验设计
在这个临床前研究中仅使用首次用于实验的猴，以排除与先前处理的任何相互作用。将动物用盐酸克他命(ketamine)麻醉。将动物从口腔插管并使其自由呼吸。用O2/N2O/异氟烷使动物保持麻醉状态。给予动物阿托品作为O2/N2O/异氟烷麻醉前的药物处理。在2小时的输注大肠杆菌及随后的大肠杆菌攻击6小时期间维持手术麻醉的水平，之后去除气管内插管并将动物安乐死。在细菌诱导之前，进行1小时输注前心率和血压监测。
给两只猕猴输注10CFU/kg革兰氏阴性菌大肠杆菌以诱导致命的脓毒性休克。1只猴接受安慰剂处理，并在输注细菌后7小时内未从麻醉中恢复而处死。另一只猴接受测试化合物治疗并在同一时间点处死。
在1991年用相同的细菌菌株进行的一个限制剂量的滴定试验中，所用剂量被证实在8小时内诱导致命的休克。在近年来的试验中，使用低3倍的剂量诱导明显的临床和病理解剖学脓毒性休克迹象而无致命结果。
将所述猴在观测期间保持麻醉状态并在开始输注细菌7小时后处死以进行病理学检测。将所述动物进行大体尸检，其中打开腹腔和胸腔并原位检测内脏器官。
使用3只猕猴的详细实验描述在猕猴(Maccaca mulatta)中进行研究。在研究中只使用首次进行实验的猕猴以排除与先前处理的任何相互作用。在实验之前，由兽医自然评估动物的健康状态。所有动物菌告知健康状态良好及没有病原性体外和体内寄生虫和常见的细菌如Yersinia pestis，Yersiniaenterocolitica，Yersinia pseudotuberculosis，Shigella，Aeromonashydrophilia，病原性Campylobacter species和Salmonella的感染。
试剂大肠杆菌菌株购自ATCC(E-coli；086aK61 serotype，ATCC33985)。在对照实验中，该菌株证实对人与猕猴血清中的杀细菌因子易感性相同。
在实验之前，建立新鲜的培养物；将大肠杆菌菌株培养1天，收获并彻底洗涤以除去游离的内毒素。在输注入动物之前，评估细菌数和存活力。将系列稀释的大肠杆菌原种铺板于BHI琼脂上并在37℃培养过夜。计数每个平板上菌落并计算每ml的菌落形成单位数。使用实验当天体重测定值以计算大肠杆菌剂量，并将大肠杆菌原种以输注所需的浓度(输注的总剂量体积为大约10ml/kg)悬浮于等渗盐水(N.P.B.I.，Emmer-Compascuum，The Netherlands)中。将该大肠杆菌悬浮液在冰上保持直至进行输注。
在猴中使用抗生素以同步休克诱导。使用Baytril(Baytril 2.5％，Bayer，Germany)代替庆大霉素，因为所用菌株证实只对后者略易感。
通过动物胸部上的数字或字母组合记号鉴别各个动物。
实验设计
麻醉将所有动物在实验前禁食一夜。在进行实验的当天早晨，将动物用盐酸克他命(Tesink，The Netherlands)镇静，并运至手术室。将动物侧面置于温控的取暖电毯上以保持体温。使用Vet-OX 5700监测直肠温度。将动物经口腔插管并使其自由呼吸。将动物使用O2/N2O/异氟烷吸入麻醉法在输注大肠杆菌及观测大肠杆菌攻击的7小时期间保持麻醉，之后除去气管内插管并对动物进行安乐死或使其从麻醉中恢复。将导管插入股静脉或头静脉并用于输注等渗盐水，活大肠杆菌及抗生素。难以觉察的体液丢失通过以3.3ml/kg/hr速度输注含有2.5％葡萄糖的等渗盐水(Fresenius，′s Hertogenbosch，The Netherlands)而补偿。
预备工作在麻醉期间将动物利用器具测定血压(用自动护腕)，心率和体温。以3.3ml/kg/hr速度输注等渗盐水以补偿体液丧失。将导管插入股静脉以输注大肠杆菌和抗生素。使用温控取暖电毯以保持体温。在大肠杆菌攻击期间及施用大肠杆菌后6小时期间对所述猴持续进行监测。在7小时后，将两只动物(对照动物及用NMPF处理的动物)处死以对比所述化合物在组织学水平的直接作用。将用NMPF处理的第三只动物从麻醉中恢复并在恢复后的前12个小时期间密切观测，随后进行定期的每日观测。使第三只动物恢复是与兽医商议后决定的。
诱导脓毒性休克在输注大肠杆菌之前，进行1小时输注前心率和血压监测。所有三只动物均接受静脉内注射致死剂量10×109CFU/kg体重的大肠杆菌086(k61 serotype；ATCC 33985)。在该小组在1991年进行的一个剂量滴定研究中，这个细菌剂量在开始输注后8小时内诱导致命休克。输注时间为2小时。
抗生素在完成2小时的大肠杆菌输注后立即静脉内施用Baytril(i.v.；9mg/kg)。
用NMPF处理在大肠杆菌攻击开始后30分钟，为动物施用一种单一静脉内药丸注射剂，其是NMPF寡肽的混合物。所述寡肽混合物含有以下NMPF肽LQGV(5mg/kg)，AQGV(5mg/kg)和VLPALP(5mg/kg)。将这些NMPF肽溶解于0.9％氯化钠溶液中以进行注射(N.P.B.I.，Emmer Compascuum，The Netherlands)。
结果初步猴实验结果观测测试化合物对在用所述寡肽混合物处理的猴中脓毒病的抗休克作用，即观测对这个灵长类模型的早期7小时轨迹中脓毒病作用的抑制作用。这些肽的免疫调节作用已经在体外及ex vivo分析如T细胞分析中观测到，如抑制病理性Th1免疫应答，抑制炎性细胞因子(MIF)，提高抗炎细胞因子(IL-10，TGF-β)的产生及提高对抗原呈递细胞(APC)如树突细胞和巨噬细胞的免疫调节作用。
将以下器官称重并进行细菌计数肾肝肺淋巴结总损害将所有器官的组织保存在中性磷酸盐水溶液缓冲的4％甲醛溶液中。淋巴器官低温保存。所有组织均进行组织病理学检测。
在3只猴的实验中获得的进一步结果猴429(对照组)将雌性猴(5.66kg)静脉内注射大肠杆菌086(10E10CFU/kg)。在该小组1991年进行的一个剂量滴定研究中，这个细菌剂量在开始输注后8小时内诱导致命的休克。输注时间为2小时。在完成2小时的输注后立即静脉内施用Baytril。
大肠杆菌输注(静脉内；9mg/kg)在注射大肠杆菌后，通过不知哪只猴接受NMPF处理的兽医对猴进行观测。临床观测如下呕吐，脉搏无法检测，心律失常，ECG异常心室扩张/心代偿失调迹象(QPS波延长，期外收缩)，血液凝固时间降低及强迫呼吸。另外，心率波动大(30-150次/分钟)，收缩压和舒张压均下降(35/20mmHg)及血氧浓度降低(80-70％)。在开始输注大肠杆菌7小时后，实验猴开始吐血及排便并抽搐。在最后的检查后，兽医未许可让这个猴苏醒。在这个时间点，将对照猴安乐死。之后，进行尸检并原位检测内脏器官。病理学者发现许多内出血。
猴459(NMPF)。将雌猴(5.44kg)静脉内注射大肠杆菌086(10E10CFU/kg)。在该小组1991年进行的一个剂量滴定研究中，这个细菌剂量在开始输注后8小时内诱导致命的休克。输注时间为2小时。在开始输注大肠杆菌30分钟后，以单一药丸注射方式静脉内注射NMPF。在完成2小时大肠杆菌(静脉内注射；9mg/kg)输注后，立即静脉内施用Baytril。在注射大肠杆菌后，将该猴也由不知道哪只猴接受NMPF处理的兽医进行观测。临床观测结果如下正常脉搏，心音正常，正常ECG，较高心率但稳定(180次/分钟)，无低血压(75/30mmHg)，正常血氧浓度(95-85％)，肺呼吸音正常，正常充盈。在开始输注大肠杆菌后7小时，该猴的临床状况稳定。在最后测试后，兽医允许让该猴苏醒，因为其状况稳定。然而，为能在对照猴与NMPF处理猴之间对比血液学和免疫学参数，在这个时间点将NMPF处理的猴459也安乐死。之后进行尸检，并在原位检测内脏器官。病理学者未发现肉眼可见的内出血。
猴427(NMPF)将雌性猴(4.84kg)静脉内注射大肠杆菌086(10E10CFU/kg)。在该小组1991年进行的一个剂量滴定研究中，这个细菌剂量在开始输注后8小时内诱导致命休克。输注时间为2小时。在开始输注大肠杆菌后30分钟，静脉内注射NMPF。在完成2小时的大肠杆菌输注后(静脉内注射；9mg/kg)立即静脉内施用Baytril。在注射大肠杆菌后，将该猴也由不知道哪只猴接受NMPF处理的兽医进行观测。临床观测结果如下正常脉搏，心音正常，正常ECG，心率较高但稳定(160次/分钟)，无低血压(70/30mmHg)，正常血氧浓度(95-90％)，肺呼吸音正常，正常充盈。在开始输注大肠杆菌后7小时，该猴的临床状况稳定。在最后测试后，兽医允许让该猴苏醒，因为其状况稳定。猴迅速苏醒，保持警惕，水肿缓慢消失。
病理学报告的概括评论为对比评估病理学报告，特殊重点放在实验中在大约7小时安乐死或死亡的两只猴(429和459)的那些示出明显研究相关的改变的器官上。
在动物429中肝脏损伤最严重，表现为多病灶明显的(接近全部)肝小叶坏死区域，有嗜中性粒细胞-有粒白细胞分界。这个动物示出多病灶急性肝细胞坏死，肝细胞分裂和窦周隙白细胞增多。
相反，与动物429上述变化相比动物459未示出明显的肝细胞损害，尽管肝细胞混浊肿胀非常充分地表明肝细胞膜功能(细胞膜以及亚细胞区室膜如内质网和高尔基复合体)有损害。然而，能量依赖性膜转运中的异常最后可能是暂时现象。
对上述动物的肝脏组织的病理解剖学特征加以概括，猕猴459示出相对最小的变化。
在动物429中，胃粘膜示出明显的急性弥漫性出血，认为与内毒素血症相关。另外，动物429在腹腔子宫病灶周围有急性出血。在动物459中无相应发现存在。
另一只动物中无相应发现存在。
在三只动物之间对比性评估肾上腺未示出明显差别。双方动物的肾上腺均呈现多发病灶，播散皮质嗜中性粒细胞-有粒白细胞浸润。
概括评论组织损害在动物429中最严重，而动物459示出在定量上和定性上均只是轻微组织改变。
基因组实验ANNEMIEKPM1 T-细胞系得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，在37℃及在5％CO2中培养。维持这些细胞并在RPMI 1640，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，及抗生素青霉素和链霉素中培养。为进行基因组实验，将细胞(2×106/ml)在6孔平板中与2ml体积的植物凝集素(PHA，10μg/ml)和IL-2(200IU/ml)或者PHA、IL-2和肽LQGV(10mg/ml)温育。培养4小时后，将10×106个细胞洗涤并针对基因芯片探针阵列实验进行制备。根据厂商指导进行基因芯片表达分析(Expression Analysis，Technical Manual，Affymetrix Genechip)。以下主要步骤概括了基因芯片表达分析1)靶制备，2)靶杂交，3)设立实验和应用流体学工作站，4)探针阵列洗涤和染色，5)探针阵列扫描，及6)数据分析。
结果基因组实验基因芯片表达分析表明由于在存在PHA/IL-2的情况下用LQGV处理PM1(T细胞系)细胞4小时，导致负调节至少120个基因，与对照PM1细胞(仅用PHA/IL-2刺激)相比多2倍。另外，在肽处理的细胞中至少6个基因被正调节，与对照细胞相比多2倍。
在基因组实验中鉴别了由于LQGV处理所致负调节的基因。以下给出了这些基因的改变倍数和登记号或描述。
21.2M1150710.1U223769.7 X688369.3 M979358.7 D300377.5 U289646.7 U10564；L239596.5 W290306.1 U089975.7 M979355.6 Y006385.3 Ras样蛋白Tc21；X834924.8 AJ002428
4.7 Ras相关蛋白Rap 1b4.6 AL0801194.5 AF047448；D14710；X59618；D28364；AA4778984.4 L19161；U48736；L43821；Ras样蛋白Tc21；U223764.3 U182714.2 Fk506结合蛋白，Alt.Splice 2；J056144.1 U08316；W28732；Y006384 AF0005453.8 U089973.6 X03484；M32886；M282093.5 L34075；J040883.4 L19161；D28423；AA442560；X982483.3 AB020670；W28869；Z12830；AL0215463.2 U78082；X742623.1 M64174；AI862521；W275173 D13988；AL080119；M33336；L75847；M21154；AA675900；M979362 U16720；M33336；U50079；U16720；X87212；AI740522；M21154；X007372.1 AF034956；Ras抑制剂Inf；M27749；Ras样蛋白质Tc4；X92106；D88674；H15872；L07541；V01512；L23959；C-Ki-Ras P21和Smg P21的刺激性Gdp/Gtp交换蛋白；L13943；X78925；U787332.2 L07540；AF040958；D00596；AI659108；AF042083；W289072.3 AF073362；J04423；D59253；M21154；原癌基因C-Myc；W267872.4 L12002；M55536；S75881；S75881；AF050110；M866672.5 U17743；U90549；U31382；S81916；M64595；丝氨酸羟甲基转移酶；U88629；U72518；L14595；AB014584；AI924594；U68111；AI924594；AL009179；AF091077；M28211；Z85986；AB019435；U39318；X78711；Y09443；Z822002.6 X69549锌指蛋白，Kruppel-Like；D883572.7 D10656；M28211
2.8 W27594；X05360；V00568；L248042.9 L05624。
由于LQGV处理所致正调节的基因的鉴别。以下描述的是基因的改变倍数和登记号或描述。
4.9 AF0433243.3 L080962.1 AL031681；X878382.2 AW024285；D38524；L389352.5 L127112.6 AF0260292.8 X70683。
进一步应用实例使用本发明信号传导分子的不同疾病发病机理中包含的不同受体-胞内信号传导途径的例子如下LPS刺激抗原呈递细胞(如DC，巨噬细胞，单核细胞)，通过不同的Toll样受体激活不同的信号传导途径，包括MAPK途径，ERK，JNK和p38途径。这些途径直接或间接使各种转录因子磷酸化及激活，所述转录因子包括Elk-1，c-Jun，c-Fos，ATF-1，ATF-2，SRF和CREB。另外，LPS激活MyD88、IRAK及TRAF6的IKK途径。TAK1-TAB2与MEKK1-ECSIT复合物使IKKb磷酸化，其随之磷酸化IkBs。随后的IkBs降解使NFκB/Rel复合物如p50/p65核转位。另外，P13K-Akt途径通过未知的激酶使p65磷酸化和激活。一些途径也可以通过其它受体信号传导分子调节，如激素/生长因子受体酪氨酸激酶(PKC/Ras/IRS途径)及细胞因子受体(JAK/STAT途径)。在用T细胞系进行的基因组实验中，一些基因表现为被所用肽(LQGV)负调节或正调节。现在清楚T细胞中其它肽及其它类型细胞中的相同及其它肽相似地负调节或正调节一些转录因子和信号传导分子。在DC和受精卵实验中，NMPF具有调节生长因子(GM-CSF，VEGF)及LPS信号传导的能力。与NF-κB及相关转录因子调节异常相关的一些疾病是动脉硬化，哮喘，关节炎，炭疽热，恶病质，癌症，糖尿病，甲状腺疾病综合征，AIDS，炎症性肠病，中风，(脓毒病)脓毒性休克，炎症，神经病理学疾病，自身免疫性疾病，血栓症，心血管疾病，心理疾病，手术后抑郁，伤口愈合，烧伤愈合及神经变性疾病。
PKC通过刺激例如AP-1和NF-κB而在T细胞激活中发挥关键作用，其通过Vav/Rac途径选择性改变T细胞突触的位置。PKC参与许多免疫学和非免疫学疾病，这从内科医学的标准教材中清楚得知(例如参与代谢疾病，癌症，血管发生，免疫介导的病变，糖尿病等)。
LPS和神经酰胺诱导不同的多聚体受体复合物，包括CD14，CD11b，Fc-gRIII，CD36，TAPA，DAF和TLR4。这种信号转导途径解释了高胆固醇血症和高血脂中单核细胞功能的变化。
氧化的低密度脂蛋白导致动脉硬化，一定浓度的氧化的低密度脂蛋白通过信号转导途径诱导巨噬细胞程序死亡。这些途径参与各种血管病变如动脉硬化，血栓症等。
细菌DNA被先天免疫系统的细胞识别。这种识别需要内体成熟并引起NF-κB和MAPK途径激活。近年来已经示出信号传导需要Toll样受体9(TLR9)及信号传导衔接蛋白MyD88。在病毒感染期间dsRNA的识别似乎依赖于dsRNA依赖性蛋白激酶PKR的胞内识别。TLRs在免疫系统中发挥关键作用，而且它们在桥接及平衡先天免疫和获得性免疫中起重要作用。这些受体或其下游信号传导途径的调节对治疗各种免疫学病变很重要，所述病变如感染，癌症，免疫介导的疾病，自身免疫性疾病，某些具有免疫学成分的代谢疾病，血管病变，炎症疾病等。
在类风湿性滑膜炎中，生长因子PDGF-AA对NF-κB及促炎细胞因子起作用；PDGF-AA增强NF-κB活性及IL-1b，IL-8和MIP-1a的mRNA表达。因此，PDGF-AA在炎症进展以及RA中滑膜细胞增殖中起重要作用。
树突细胞(DC)激活是诱导免疫应答的关键。通过LPS诱导的DC激活可以分成两个独立的过程首先是成熟，导致MHC及共刺激分子正调节，其次，从生长因子除去后的立即细胞程序死亡中获救(存活)。LPS诱导NF-κB转录因子。抑制NF-κB激活能在MHC及共刺激分子正调节方面阻断DC成熟。另外，LPS激活胞外信号调节的激酶(ERK)，对激活ERK的激酶MEK1的特异性抑制消除了LPS防止细胞程序死亡的能力，但不抑制DC成熟或NF-κB核转位。这示出ERK和NF-κB调节LPS诱导的DC激活的不同方面。我们的DC数据和NF-κB数据还示出在有或无LPS的情况下，NMPF肽对DC成熟及增殖的各种作用。NMPF肽调节这些途径而且是调节DC功能和免疫调节的新手段。这开辟了治疗免疫疾病的新途径，尤其治疗免疫系统不平衡(DC1-DC2，Th1-Th2，调节细胞等)的那些病变。
DC介导NK细胞激活，其可导致肿瘤生长被抑制。DC细胞及其它抗原呈递细胞(如巨噬细胞，B细胞)在免疫系统中起关键作用，而且它们在桥接和平衡先天免疫和获得性免疫中也起重要作用。这些细胞或其下游信号传导途径的调节对治疗各种免疫学病变很重要，所述病变如感染，癌症，免疫介导的疾病，自身免疫性疾病，具有免疫学成分的某些代谢疾病，血管病变，炎症疾病等。在文献中还有这样的证据，即肥大细胞在通过释放炎性细胞因子及在通过肥大细胞上TLR识别感染因素后补充中性粒细胞而发挥先天免疫性中起重要作用。
在鼠巨噬细胞中，肺结核分枝杆菌感染通过JAK途径激活STAT1，STAT1的激活也许是参与IFN-γ诱导的MHC II型抑制的主要转录因子。
通过TLR识别甘露糖结合凝集素(MBL)影响应答感染的多种免疫机制并参与先天免疫。先天和获得性免疫之间的平衡对平衡免疫系统至关重要，免疫系统的调节异常导致不同的疾病谱，如炎症疾病，自身免疫性疾病，感染性疾病，妊娠相关的疾病(如流产和子痫前期)，糖尿病，动脉硬化及其它代谢疾病。
核因子-κB(NFκB)对参与心肌缺血-再灌注损伤的多种基因的转录至关重要。临床核实验研究已经示出心肌缺血-再灌注损伤通过在心肌梗塞，动脉硬化，肠局部缺血，出血性休克肺部损伤及脑梗塞等疾病中的经典及替代途径导致TLR和补体系统激活。
过氧化物酶体增殖因子激活的受体(PPARs)是配体激活的转录因子，其调节脂质和脂蛋白代谢，葡萄糖动态平衡，影响细胞增殖，分化和细胞程序死亡及调节炎症应答。PPARα在肝脏，肌，肾和心脏中高度表达，在此其刺激脂肪酸的β氧化降解。PPARγ在小肠和脂肪组织中优势表达，在此其触发脂肪细胞分化并促进脂质贮存。近年来还报道了PPARα和PPARγ在血管壁细胞中表达，如单核细胞/巨噬细胞，内皮细胞和平滑肌细胞。降血脂药fibrates及抗糖尿病药物glitazones分别是PPARα和PPARγ的合成配体。另外，脂肪酸衍生物和类花生酸是天然的PPAR配体PPARα由白三烯B4激活，而前列腺素J2以及氧化的LDL的一些成分如9-和13-HODE是PPARγ配体。这些观测提示PPARs的一种潜在作用，其不仅参与代谢而且还参与炎症控制并因此参与相关的疾病如动脉硬化。最近示出PPAR激活因子抑制炎症应答基因(如IL-2，IL-6，IL-8，TNFα和金属蛋白酶)的激活，这通过负面干扰血管壁细胞中NF-κB，STAT和AP-1信号传导途径而进行。另外，PPARs还可控制动脉粥样硬化斑的细胞中的脂质代谢。PPARs还参与各种免疫学及非免疫学疾病，这从内科医学的标准教材中可清楚获知(例如参与代谢疾病，癌症，血管发生，免疫介导的病变，糖尿病等)。
如上所述，核受体PPARg在脂肪生成，脂质贮存中很重要并参与动脉硬化。虽然在脂肪组织中表达，但这个受体也在巨噬细胞和结肠中表达。另外，PPARg参与许多进程如癌症和炎症。另外，微生物通过其关联受体(典型为TLR)而具有调节PPARg依赖性代谢功能的能力，由此表明消化道中微生物菌群与代谢控制之间复杂的相互影响。
环加氧酶2(COX2)是前列腺素H合酶的一种可诱导同种型，其在炎症期间介导前列腺素合成，而且在结肠肿瘤中选择性过表达，据信其在结肠癌发生中起重要作用。通过炎性细胞因子或缺氧诱导的氧化应激对COX2的诱导可以通过核因子κB(NF-κB)介导。因此，抑制NF-κB可调节COX途径，且NF-κB的这种抑制在涉及COX的疾病中具有治疗用途，所述疾病如炎症，疼痛，癌症(尤其结肠直肠癌)，炎症性肠道疾病等。
正常脑组织中神经元亚群组成型表达功能C5a受体。C5a受体的功能作用表明C5a触发快速激活蛋白激酶C及激活并核转位NF-κB转录因子。另外，发现C5a对未分化的人成神经细胞瘤具有促分裂作用，这是针对C5aR的一种新作用。相反，C5a保护末期分化的人成神经细胞瘤细胞免于淀粉样Aβ肽介导的毒性。这示出正常海马神经元以及未分化的和分化的人成神经细胞瘤细胞均表达功能性C5a受体。这些结果示出神经元C5aR受体在正常神经元发育，神经元稳态及神经炎症病变如Alzheimer′s病中的作用。
补体系统的激活在动脉硬化的发病机理中也起重要作用。促炎细胞因子白细胞介素(IL)-6潜在参与疾病的进展。补体系统通过Gi依赖性途径诱导IL-6从人血管平滑肌细胞(VSMC)中释放，包括产生氧化应激及激活氧化还原敏感性转录因子NF-κB和AP-1。补体系统的调节对许多疾病很重要，如血液病变，感染，一些代谢疾病(糖尿病)，血管病变，移植排斥及相关疾病，自身免疫性疾病及其它免疫学疾病。
不同的转录因子如NF-κB和胞内信号传导分子如不同的激酶也参与多药抗性。因此，有理由相信NMPF肽将有效抗多药抗性。另外，我们的基因组数据示出许多基因和信号传导分子参与肿瘤发生并调节肿瘤转移。另外，因为寡肽对血管发生也有作用，因此这些肽也将用于治疗需要调节血管发生的癌症及相关疾病。
增殖性糖尿病视网膜病(PDR)是后天失明的主要原因之一。PDR的特点是新血管形成(NV)，异常血管发生，其最后可导致严重玻璃体出血和/或视网膜脱落。因为NMPF肽具有血管发生刺激以及抑制作用，并具有调节生长因子(如胰岛素)相关的胞内信号传导能力，因此用某些NMPF肽的药物治疗可改善代谢控制(如葡萄糖)或减弱高血糖症生物化学结果(通过如其中包含醛糖还原酶，蛋白激酶C(PKC)，PPARs的机制)。针对这种代谢控制或糖尿病(II型)，推荐使用NMPF肽LQGV，VLPALP，VLPALPQ，GVLPALPQ，AQG，LAG，LQA，AQGV，VAPALP，VAPALPQ，VLPALPA，LPGC，MTR，MTRV，LQG，CRGVNPVVS。PDR中的血管发生也可以用上述寡肽进行处理。
脓毒性关节炎实验小鼠这个实验中使用NMR1小鼠。在这个实验中每个处理组10只小鼠。
细菌及接种S.aureus LS-1最初分离自自发患有关节炎的NZB/W小鼠的肿胀关节。这个葡萄球菌菌株的一个特点是其产生大量TSST-1，这是具有超级抗原性的外毒素。将该细菌在血琼脂上培养24小时，然后在血琼脂上再培养24小时。将其在含有5％牛血清白蛋白和10％二甲基亚砜(C2H6OS)的PBS(0.13M氯化钠，10mM磷酸钠(pH7.4))中，在-20℃冷冻直至使用。在使用之前，将细菌溶液解冻，在PBS中洗涤，并在PBS中稀释以达到希望的细菌浓度。将小鼠经尾静脉之一接种该细菌(200μl)。从剩余的细菌溶液中产生活细胞计数，系列稀释，然后在血琼脂平板上培养以确定注射的细菌数。在静脉内注射细菌后，将一组小鼠经腹膜内注射PBS进行处理，每周3次共两周，其它组小鼠经腹膜内注射NMPF-6(100μg)进行处理，每周3次共两周。在进行研究的13天期间，测定关节炎严重程度，死亡率和体重降低情况。
临床评估关节炎将所有小鼠单独进一步评估。定期目测检查关节即指/趾和腕关节/踝关节，即至少每两天或三天检查一次。关节炎定义为可见关节红斑和/或至少一个关节肿胀。为评估关节炎的严重程度，使用肉眼可见检查系统针对每个肢体产生0-4点分值进行临床记录(关节炎指数)(0，既无肿胀也无红斑；1，轻微肿胀和/或红斑；2，中等肿胀和红斑；3，明显肿胀和红斑；4，最大肿胀和红斑(垂死的小鼠)。另外，测定关节炎发生频率和体重。
结果体重降低在两组之间关于体重降低方面无差别(图66)。
存活直至第10天，观测到关于存活性无明显差别(PBS处理组70％，NMPF处理组80％)。在研究结束时，PBS处理的小鼠存活率为40％，NMPF处理的小鼠存活率为80％(图67)。
关节炎的严重程度测定实验组之间关节炎严重程度的明确(clear-cut)差异。从一开始即可观测到差异，并随着时间而增加。在第10天，PBS处理小鼠中关节炎指数为2.4，NMPF处理小鼠中为1.0。在第13天，PBS处理小鼠中关节炎指数为3.8，NMPF处理小鼠中为0.9(图68)。
关节炎小鼠的发生频率在两组小鼠中观测到在0-6天关节炎的发生频率无差异。之后PBS处理组的关节炎发生频率持续增加(在第天为100％)，但NMPF处理组降低(在第13天为50％)(图69)。
结论是这些结果示出NMPF-6(VLPALP)处理能预防小鼠发生关节炎，甚至明显降低关节炎的严重程度。
破骨细胞发生分析骨再吸收和骨形成之间的精确平衡对保持骨的强度和完整非常重要，其中骨再吸收的破骨细胞和骨形成的成骨细胞起关键作用。事实上，这个称为骨再塑的生理学进程必须严格调节，在病理学病变中观测到该平衡的倾斜有利于破骨细胞导致骨破坏，所述病变如自身免疫性关节炎，牙周炎，(绝经期后)骨质疏松症，Paget′s病及骨肿瘤。
调节破骨细胞分化是了解骨病如自身免疫性关节炎和骨质疏松症的发病机制及治疗的重要方面。RANKL(NF-κB配体的受体激活因子)是破骨细胞发生所必需的肿瘤坏死因子(TNF)家族的一个成员，其所致的过度信号传导据信与这种病变相关。由于基质降解和过度骨丧失所致关节破坏是炎症性骨病的特征，所述骨病如骨质溶解，骨关节炎和类风湿性关节炎。炎性细胞及其分泌产物在炎症部位的聚集吸引破骨细胞及其前体细胞，导致骨成分的进一步破坏。肿瘤坏死因子-α，白细胞介素-1(IL-1)，和RANKL(也称为OPGL和ODF)在炎症部位很丰富，并已知促进破骨细胞补充，分化和激活。破骨细胞分化本质上需要RANK/RANKL途径激活。
RANKL和TNFα在破骨细胞(OC)形成中的作用已经明确确定。为确定NMPF对破骨细胞形成的作用，使用骨髓(BM)细胞和RAW264.7小鼠多核细胞作为多核破骨细胞分化的模型系统。
OC产生及定性OC是通过用重组的可溶RANKL(20ng/ml)和M-CSF(10ng/ml)在有或无NMPF(10μg/mL)的情况下将BM细胞培养7天而产生的。OC也可以通过用RANKL(20ng/ml)在无M-CSF或有TNFα的情况下培养RAW 264.7细胞并用NMPF处理而产生。这两种培养系统均产生大量TRAP+多核细胞，其表达典型的OC标记。使用细胞化学染色，通过量化多核TRAP阳性细胞(多于3个核)的存在情况测定破骨细胞的形成。
结果正如所预期的，我们观测到当细胞与能抑制NF-κB活性的那些肽共温育时，配体(RANKL；MCS-F；TNFα)诱导的破骨细胞发生被明显抑制。如与只接受配体的对照细胞相比多核TRAP阳性细胞数减少所表明的那样，该系列肽抑制破骨细胞形成的能力在BM以及RAW 264.7模型系统中均观测到。
权利要求
1.一种调节基因在细胞中表达的方法，包括提供一种信号传导分子给所述细胞，所述信号传导分子包含一种肽或其功能类似物。
2.权利要求1的方法，其中所述肽选自以下肽或其功能类似物或衍生物LQG，AQG，LQGV，AQGV，LQGA，VLPALP，ALPALP，VAPALP，ALPALPQ，VLPAAPQ，VLPALAQ，LAGV，VLAALP，VLAALP，VLPALA，VLPALPQ，VLAALPQ，VLPALPA，GVLPALP，LQGVLPALPQVVC，LPGCPRGVNPVVS，LPGC，MTRV，MTR，VVC。
3.权利要求1或2的方法，其中所述信号传导分子调节基因转录因子的转位和/或活性。
4.权利要求3的方法，其中所述基因转录因子包含一种NF-κB/Rel蛋白质。
5.一种鉴别或获得一种信号传导分子的方法，所述信号传导分子包含能调节细胞中的基因表达的一种肽或其功能衍生物或类似物，所述方法包括提供一种肽或其衍生物或类似物给所述细胞，并确定基因转录因子的活性和/或核转位。
6.权利要求5的方法，其进一步包括确定所述信号传导分子是否是可透过膜的。
7.权利要求5或6的方法，其中所述基因转录因子包含一种NF-κB/Rel蛋白质。
8.一种鉴别或获得信号传导分子的方法，所述信号传导分子包含能调节细胞中的基因表达的一种肽或其功能衍生物或类似物，所述方法包括提供一种肽或其衍生物或类似物给所述细胞，并确定在所述细胞中表达的至少一个基因的相对正调节和/或负调节。
9.权利要求5，6或7的方法，其进一步包括确定在所述细胞中表达的至少一个基因的正调节和/或负调节。
10.权利要求8或9的方法，其进一步包括确定在所述细胞中表达的多个基因的正调节和/或负调节。
11.一种鉴别或获得一种信号传导分子的方法，所述分子包含能调节细胞中的基因表达的一种肽或其功能衍生物或类似物，所述方法包括提供一种肽或其衍生物或类似物，并确定所述肽或其衍生物或类似物与基因控制相关的一种因子的结合。
12权利要求11的方法，其进一步包括提供多个肽或其衍生物或类似物，并确定至少一个所述肽或其衍生物或类似物与基因控制相关的一种因子的结合。
13.权利要求11或12的方法，其中所述基因控制相关因子包含转录因子。
14.权利要求13的方法，其中所述转录因子包含一种NF-κB-Rel蛋白质。
15.权利要求11-14任一项的方法，其进一步包括提供所述肽或其衍生物或类似物给细胞，并确定基因转录因子在所述细胞中的活性和/或核转位。
16.权利要求11-15任一项的方法，其进一步包括提供所述肽或其衍生物或类似物给细胞，并确定在所述细胞中表达的至少一个基因的相对正调节和/或负调节。
17.一种信号传导分子，其用于调节基因在细胞中的表达并可通过权利要求5-16任一项的方法鉴别或获得。
18.权利要求17的信号传导分子，其选自以下肽或其功能类似物或衍生物LQG，AQG，LQGV，AQGV，LQGA，VLPALP，ALPALP，VAPALP，ALPALPQ，VLPAAPQ，VLPALAQ，LAGV，VLAALP，VLAALP，VLPALA，VLPALPQ，VLAALPQ，VLPALPA，GVLPALP，LQGVLPALPQVVC，LPGCPRGVNPVVS，LPGC，MTRV，MTR，VVC。
19.一种能调节细胞中的基因表达的信号传导分子，其包含至多30个氨基酸的一种肽或其功能类似物或衍生物。
20.权利要求19的信号传导分子，其中所述肽是长度为大约3-15个氨基酸的一种寡肽。
21.一种NF-κB/Rel蛋白质激活抑制剂，其包含权利要求17-20任一项的信号传导分子。
22.权利要求17-20任一项的信号传导分子在生产调节基因表达的药物组合物中的应用。
23.权利要求22的应用，其是通过抑制NκB/Rel蛋白质激活而调节基因表达。
全文摘要
本发明涉及在细胞内调节基因表达，也称为基因控制，特别涉及各种疾病的治疗。本发明提供了一种在细胞中调节基因表达的方法，包括提供信号传导分子给所述细胞，所述信号传导分子包含一种肽或其功能类似物。另外，本发明提供了一种鉴别或获得一种信号传导分子的方法，所述分子包含能在细胞中调节基因表达的一种肽或其功能衍生物或类似物，所述方法包括提供一种肽或其衍生物或类似物给所述细胞，并确定基因转录因子的活性和/或核转位。
文档编号C07K7/06GK1599753SQ02824294
公开日2005年3月23日 申请日期2002年10月4日 优先权日2001年10月4日
发明者尼萨尔·艾哈迈德·卡恩, 罗贝特·本纳 申请人:鹿特丹伊拉兹马斯大学