专利名称：诊断前列腺癌的方法
技术领域：
本发明涉及诊断前列腺癌的方法。
背景技术：
前列腺癌(PRC)是男性中最常见的恶性肿瘤之一并表现出显著的全世界健康问题。在美国，它是第二个最常见的癌症死亡原因(1)。在发达国家，随着西方式饮食的流行和年长人口的增加，PRC的发生率与日俱增。由于采用西方生活方式，在日本死于这个疾病的患者也在增加(2)。目前，PRC的诊断基于血清前列腺特异性抗原(PSA)的水平增加。早期诊断可提供治疗手术的机会。通常用根治性前列腺切除术治疗器官局限的PRC患者，他们中大约70％可以治愈(3，4)。大多数晚期或复发的疾病患者用雄激素脱离疗法(androgen ablation therapy)治疗，因为PRC的生长最初是雄激素依赖性的。尽管这些患者中大多数最初对雄激素脱离疗法起反应，但是该疾病最后发展为雄激素非依赖性PRC，在这个时候，肿瘤不再对雄激素脱离疗法起反应。治疗PRC一个最严重的临床问题是这种雄激素非依赖性PRC对任何其它疗法不起反应，以及雄激素非依赖性生长的机制和建立除雄激素脱离疗法之外抗PRC的新疗法对于PRC的处理是个紧急的问题。
另一方面，前列腺上皮内瘤形成(prostatic intraepithelial neoplasmia)(PIN)是特定类型的最小损害，据信它是PRC的前身(McNeal & Bostwich，1986)。PIN被认为是低级和高级形式之间的连续体，高级PIN被认为是浸润癌的直接前身。高级PIN和PRC常常同时存在并且它们享有类似的染色体和基因改变(Qian et al.，1999)。然而，PIN发展和PIN至PRC进展的机制仍然不清楚。因此，PINs表达谱的基因组范围分析是了解分子致癌作用和进展以及PRC预防策略的必要步骤。
cDNA微阵列技术能够获得正常和恶性细胞中基因表达的综合谱，并比较恶性和相应正常细胞中的基因表达(Okabe et al.，Cancer Res 612129-37(2001)；Kitahara et al.，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene214120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 627012-7(2002))。这个方法能够揭露癌细胞的复杂性质，并有助于了解致癌作用机制。肿瘤中下调基因的鉴定可以引出更精确和确定的个体癌症诊断，和开发新的治疗目标(Bienzand Clevers，Cell 103311-20(2000))。为了从基因组范围的观点揭开肿瘤下面的机制，和发现诊断和发展新治疗药物的靶分子，本发明人已经使用23040个基因的cDNA微阵列分析了肿瘤细胞的表达谱(Okabe et al.Cancer Res612129-37(2001)；Kitahara et al.，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 627012-7(2002))。
设计揭示致癌作用机制的研究促进了抗肿瘤试剂分子目标的鉴定。例如，最初开发用于抑制Ras相关生长信号途径的法尼基转移酶(farnexyltransferase)(FTIs)抑制剂(该途径的激活依赖于翻译后法尼基化(farnesylation))已有效治疗动物模型中的Ras依赖性肿瘤(He et al.，Cell99335-45(1999))。已经进行了使用抗癌药物和抗HER2单克隆抗体的联合在人类中的临床试验，曲脱单抗(trastuzumab)，来拮抗原癌基因受体HER2/neu；并且已经获得了改善的临床反应和乳腺癌患者的总体幸存(Lin etal.，Cancer Res 616345-9(2001))。已经开发了选择性灭活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂STI-571来治疗慢性粒细胞性白血病，其中bcr-abl酪氨酸激酶的组成激活在白细胞转变中起着关键作用。这些类型的试剂设计抑制特殊基因产物的致癌活性(Fujita et al.，Cancer Res 617722-6(2001))。因此，癌细胞中通常上调的基因产物可以作为开发新的抗癌试剂的潜在目标。
已经证明CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)识别来源于MHC I类分子上存在的肿瘤相关抗原(TAAs)的表位肽，并溶解肿瘤细胞。自从发现TAAs第一个实例MAGE家族，使用免疫方法已经发现很多其它TAAs(Boon，Int JCancer 54177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 2541643-7(1991)；Brichard et al.，JExp Med 178489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180347-52(1994))。一些已发现的TAAs现在处于作为免疫疗法目标的临床开发阶段。迄今为止发现的TAAs包括MAGE(van der Bruggen et al.，Science 2541643-7(1991))，gp100(Kawakami et al.，J Exp Med 180347-52(1994))，SART(Shichijo et al.，J Exp Med 187277-88(1998))，和NY-ESO-1(Chen et al.，Proc Natl Acad SciUSA 941914-8(1997))。另一方面，已证明在肿瘤细胞中特别过度表达的基因产物被公认为诱导细胞免疫反应的目标。这种基因产物包括p53(Umanoet al.，Brit J Cancer 841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka et al.，Brit J Cancer8494-9(2001))，CEA(Nukaya et al.，Int J Cancer 8092-7(1999))，等等。
尽管关于TAAs的基础和临床研究有重大的发展(Rosenbeg et al.，NatureMed 4321-7(1998)；Mukherji et al.，Proc Natl Acad Sci USA 928078-82(1995)；Hu et al.，Cancer Res 562479-83(1996))，但是仅有限数量的治疗腺癌包括结肠直肠癌的候选TAAs有效。癌细胞中丰富表达，同时其表达限于癌细胞的TAAs将是免疫治疗目标的有望候选者。此外，诱导有效和特异性抗肿瘤免疫反应的新TAAs预期会助长在各种类型癌症中肽疫苗策略的临床使用Science 2541643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180347-52(1994)；Shichijo et al.，J ExpMed 187277-88(1998)；Chen et al.，Proc Natl Acad Sci USA 941914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 881442-5(1996)；Butterfield et al.，Cancer Res 593134-42(1999)；Vissers et al.，Cancer Res 595554-9(1999)；van der Burg et al.，J Immunol 1563308-14(1996)；Tanaka et al.，Cancer Res 574465-8(1997)；Fujie et al.，Int J Cancer 80169-72(1999)；Kikuchi et al.，Int J Cancer 81459-66(1999)；Oiso et al.，Int J Cancer 81387-94(1999))。
已经重复报道了来自某些健康供体的肽刺激外周血单个核细胞(PBMCs)产生对肽起反应的显著水平的IFN-γ，但是在51Cr释放试验中很少发挥限于HLA-A24或-A0201方式的抗肿瘤细胞的细胞毒性Cance Res 603550-8(2000)；Nishizaka et al.，Cancer Res 604830-7(2000)；Tamura et al.，Jpn J Cancer Res 92762-7(2001))。然而，HLA-A24和HLA-A0201都是日本人以及高加索人中普及的HLA等位基因之一(Date et al.，Tissue Antigens4793-101(1996)；Kondo et al.，J Immunol 1554307-12(1995)；Kubo et al.，JImmunol 1523913-24(1994)；Imanishi et al.，Proceeding of the eleventhInternational Hictocompatibility Workshop and Conference Oxford UniversityPress，Oxford，1065(1992)；Williams et al.，Tissue Antigen 49129(1997))。因此，这些HLAs呈递的癌瘤抗原肽可能对日本人和高加索人的癌瘤治疗特别有用。此外，众所周知低亲合力CTL的体外诱导通常由使用高浓度肽在抗原呈递细胞(APCs)上产生高水平特异性肽/MHC复合物而引起，该复合物将有效活化这些CTL(Alexander-Miller et al.，Proc Natl Acad Sci USA 934102-7(1996))。
发明概述本发明是基于PRC或PIN相关基因表达模式的发现。在PRC和PIN之一或二者中差异表达的基因这里统一称作“PRC核酸”或“PRC多核苷酸”以及相应编码的多肽称为“PRC多肽”或“PRC蛋白”。
因此，本发明涉及诊断或确定受试者的PRC和PIN之一或二者的倾向性的方法，通过确定从患者获得的生物样品如组织样品中PRC相关基因的表达水平来完成。PRC相关基因是指以从PRC或PIN细胞获得的细胞与正常细胞相比表达水平不同为特征的基因。正常细胞是从前列腺组织获得的细胞。PRC相关基因包括例如PRC1-692。例如该基因的表达水平与基因的正常对照水平相比增加或降低表明受试者罹患PRC和PIN之一或二者或存在发生PRC和PIN之一或二者的风险。
正常对照细胞是指在正常健康的个体或已知没有罹患PRC和PIN的人群中检测到的基因表达水平。对照水平是来源于单一参照人群或来自许多表达模式的单一表达模式。例如，对照水平可以是以前测试细胞的表达模式数据库。正常个体是没有PRC和PIN临床症状的个体。
与正常对照水平相比，测试样品中检测到的PRC1-88，296-321，458-537水平增加表明受试者(样品来自他们)罹患或存在发生PRC或PIN中至少一种的风险。相反，与正常对照水平相比，测试样品中检测到的89-295，322-457，538-692水平降低表明所述受试者罹患或存在发生PRC和PIN中之一或二者的风险。
可供选择地，样品中一组(panel)PRC相关基因的表达与相同基因的组的PRC对照水平相比。PRC对照水平是指罹患PRC和PIN之一或二者的人群中发现的PRC相关基因的表达谱。
与对照水平相比，基因表达增加或降低10％、25％、50％。可交替地，与对照水平相比，基因表达增加或降低1、2、5或更多倍。通过例如在阵列上检测PRC相关基因探针与来源于患者的组织样品的基因转录物杂交来确定表达。
来源于患者的组织样品是来自测试受试者的任何组织，例如，已知或怀疑具有PRC或PIN的患者。例如，该组织含有上皮细胞。例如，该组织是前列腺组织的上皮细胞。
本发明也提供了PRC1-692中两个或更多基因表达水平的PRC参照表达谱。可供选择地，本发明提供了PRC1-88、PRC89-295、PRC296-321、PRC322-457、PRC458-537或PRC538-692中两个或更多表达水平的PRC参照表达谱。
本发明进一步提供了鉴定抑制或提高PRC相关基因，例如PRC1-692的表达或活性的试剂的方法，通过表达PRC相关基因的测试细胞接触测试试剂并确定PRC相关基因的表达水平。测试细胞是上皮细胞，例如前列腺组织的上皮细胞。与所述基因的正常对照水平相比，水平降低表明该测试试剂是PRC相关基因的抑制剂并减少PRC和PIN之一或二者的症状。可供选择地，与基因的正常对照水平或活性相比，水平或活性增加表明所述测试试剂是PRC相关基因表达或功能的增强剂并减少PRC和PIN之一或二者的症状，如PRC 89-295、PRC 322-457、PRC 538-692。
本发明也提供了含有结合两个或更多PRC核酸序列或结合该核酸序列编码的基因产物的检测试剂的试剂盒。也提供了结合两个或更多PRC核酸的核酸阵列。
治疗方法包括治疗或预防受试者的PRC和PIN之一或二者的方法，通过给受试者施用反义组合物。该反义组合物降低特定目的基因的表达，如反义组合物含有核苷酸，该核苷酸与选自PRC 1-88、296-321、458-537组成的组的序列互补。另一个方法包括给受试者施用小干扰RNA(siRNA)组合物的步骤。siRNA组合物降低选自PRC 1-88、296-321、458-537组成的组的核酸表达。在又一个方法中，治疗或预防受试者的PRC和PIN之一或二者是通过给受试者施用核酶组合物而进行的。该核酸特异性核酶组合物降低选自PRC 1-88、296-321、458-537组成的组的核酸表达。其它治疗方法包括给受试者施用增加PRC 89-295、322-457、538-692表达或PRC 89-295、322-457、538-692编码多肽的活性的化合物的方法。此外，通过给予PRC89-295、322-457、538-692编码的蛋白可以治疗PRC和PIN之一或二者。该蛋白可以直接给予患者，或可供选择地，可以在导入患者之后体内表达，例如，通过给予携带感兴趣的下调标志基因的表达载体或宿主细胞。本领域已知感兴趣基因体内表达的合适机制。
本发明也包括疫苗和接种方法。例如，治疗或预防受试者的PRC和PIN之一或二者的方法通过给受试者施用含有选自PRC 1-88、296-321、458-537组成的组的核酸所编码多肽或这种多肽的免疫活性片段的疫苗来进行。免疫活性片段是长度比全长天然存在蛋白短并且诱导免疫反应的多肽。例如，长度至少8个残基并刺激免疫细胞例如T细胞或B细胞的免疫活性片段。通过检测细胞增生、细胞因子(如IL-2)的产生或抗体的产生来测定免疫细胞刺激。
除非另外定义，这里使用的所有专业和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的具有相同意思。尽管相似或等同于本文所描述的方法和材料可以用于实施或检测本发明，但是合适的方法和材料在下面描述。这里提及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献的全部内容引入作为参考。在冲突的情况下，用本说明书，包括定义来解释。此外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的且没有限制的意思。
这里描述的方法的一个优点是在发现明显的临床症状之前鉴定疾病。通过下列详细的说明书和权利要求书，本发明的其它特征和优点将很明显。
附图简述
图1是DNA琼脂糖凝胶照片，显示了使用由扩增的RNA制备的cDNA，通过半定量RT-PCR检测的代表性的5个基因和β-肌动蛋白的表达。注释了基因符号。T和N分别表示8个患者中每个患者的肿瘤和正常情况。
发明详述本发明部分基于PRC或PIN患者的上皮细胞中多个核酸序列表达模式的改变的发现。使用综合的cDNA微阵列系统鉴定基因表达的差异。
cDNA微阵列是鉴定基因的有效工具，可适用于治疗目的的新分子目标的开发(Ishiguro et al.，2002；Yagyu et al.，2002)。使用基因组信息和新技术，现在关于PRC的基础研究近来发展迅速，但是研究组织不均一的人PRCs中的最大困难是不能分离用于分子分析的纯样品。大多数以前的研究使用大块癌组织，没有消除非癌细胞的污染，包括来自如PINs的良性损害的基质细胞、微脉管系统细胞、纤维肌细胞、炎性细胞及其它上皮细胞。然而，激光显微解剖(laser microdissection)允许我们克服这些障碍并能够进行PRC和PINs细胞的纯细胞群的精确估计(Emmert-Buck et al.，1996)。而且，我们比较了每种情况下癌细胞与其作为对照的相应正常上皮细胞的基因表达。这个步骤防止基因表达的个体影响数据。这个研究是关于PRCs和PINs，结合LMM精确表达谱的首次报道。这个数据将提供前列腺癌发生的重要信息并将对鉴定候选基因有很大好处，该候选基因的产物可以是治疗和预防PRC的药物设计的靶。
使用提供23,040个基因的cDNA微阵列与激光显微解剖联合分析来自20个PRCs和10个PINs的癌细胞的基因表达谱。通过比较诊断为PRC的患者的癌细胞和用激光显微解剖纯粹选择的正常上皮细胞之间的表达模式，在PRC和PIN细胞中鉴定出88个基因通常上调，和在PRC和PIN细胞中鉴定出207个基因通常下调。在PRC细胞中鉴定出26个基因通常上调，和在PRC细胞中鉴定出136个基因通常下调。在PIN细胞中鉴定出80个基因通常上调，和在PIN细胞中鉴定出155个基因通常下调。此外，选择具有检测患者血清或唾液中的癌相关蛋白潜力的候选分子标记，并发现了开发人PRC或PIN中信号抑制策略的一些潜在目标。
这里鉴定的基因差异表达用于诊断目的，作为PRC或PIN的标记并且作为基因目标，改变其表达以治疗或减轻PRC或PIN的症状。
表3-8总结了在PRC和PIN患者之一或二者中表达水平受到调节的基因(即增加或降低)，这里统一称作“PRC相关基因”、“PRC核酸”或“PRC多核苷酸”，以及相应编码的多肽称为“PRC多肽”或“PRC蛋白”。除非另外指出，“PRC”意思是指这里公开的任何序列。(例如PRC 1-692)。以前已经描述的基因与数据库登记号一起提供。
通过测定细胞样品中各种基因的表达，诊断PRC和PIN。类似地，通过测定响应各种试剂的这些基因的表达，可以鉴定治疗PRC和PIN之一或二者的试剂。
本发明包括确定(例如，测定)表3-8中所列的至少一个，并直至全部PRC序列的表达。使用通过GeneBankTM数据库入口提供的已知序列的序列信息，用本领域普通技术人员熟知的技术检测并测定了PRC相关基因。例如，序列数据库入口内相当于PRC序列的序列用于构建如在Northern印迹杂交分析中检测PRC RNA序列的探针。探针包括参照序列的至少10、20、50、100、200个核苷酸。作为另一个实例，该序列可用于构建如在基于扩增的检测方法中特异性扩增PRC核酸的引物，如基于反转录的聚合酶链式反应。
测试细胞群中，如来源于患者组织样品中的一个或多个PRC相关基因的表达水平接着与参照群体中一些基因的表达水平相比较。参照细胞群包括对比参数已知的一个或多个细胞，即PRC细胞或非PRC细胞。
与参照细胞群相比，测试细胞群的基因表达模式是否表明PRC或PIN或其倾向性依赖于对照细胞群的组成。例如，如果参照细胞群由非PRC细胞组成，测试细胞群和参照细胞群的类似基因表达模式表明测试细胞群是非PRC。相反地，如果参照细胞群由PRC细胞组成，测试细胞群和参照细胞群之间的类似基因表达谱表明测试细胞群包括PRC细胞。
如果其表达水平与参照细胞群有差异，与参照细胞群中的相应PRC标志基因的表达水平差异在1.0、1.5、2.0、5.0、10.0倍或更高的倍数，则认为测试细胞群中PRC标志基因的表达水平改变了。
测试细胞群和参照细胞群之间的差异基因表达标准化为对照核酸，例如看家基因。例如，对照核酸是已知不依赖PRC或非PRC细胞状态而改变的核酸。测试和参照核酸中对照核酸的表达水平可用于标准化被对比的群体中的信号水平。对照基因包括β-肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶或核糖体蛋白P1。
测试细胞群与多个参照细胞群相对比。多个参照群中每一个的已知参数可能不同。因此，测试细胞群可以与已知含有例如PRC细胞的第二个参照细胞群，以及与已知含有例如非PRC细胞(正常细胞)的第二个参照细胞群相比。测试细胞包括在来自已知含有或怀疑含有PRC细胞的受试者的组织类型或细胞样品中。
测试细胞是从身体组织或身体流体获得的，如生物流体(例如血液或血清)。例如，测试细胞是从组织纯化的。优选，测试细胞群包含上皮细胞。上皮细胞来自已知或怀疑是癌的组织。
参照细胞群中的细胞源自于与测试细胞相似的组织类型。任选，参照细胞群是细胞系，如PRC细胞系(阳性对照)或正常非PRC细胞系(阴性对照)。可供选择地，对照细胞群源自于已知试验参数或条件的细胞的分子信息数据库。
优选受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是例如人、非人灵长目动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。
用本领域已知方法，在蛋白或核酸水平确定本文公开基因的表达。例如，使用特异性识别可用于确定基因表达的一个或多个核酸序列的探针的Northern杂交分析。可供选择地，使用基于反转录的PCR试验测定表达，如使用对差异表达的基因序列特异的引物。也在蛋白水平确定表达，即通过测定这里描述的基因产物编码的多肽水平或其生物活性。这种方法是本领域熟知的，包括例如基于抗体与基因编码的蛋白的免疫测定。基因编码的蛋白的生物活性也是熟知的。
诊断PRC或PIN通过测定测试细胞群(即来源于患者的生物样品)的一个或多个PRC核酸序列的表达水平诊断PRC或PIN。优选，测试细胞群包含上皮细胞，例如从前列腺组织获得的细胞。也计算来自血液或其它身体流体的基因表达，如尿液。其它生物样品也可用于测定蛋白水平。例如，可以通过免疫测定或生物试验测定来源于待诊断的受试者的血液或血清中的蛋白水平。
确定测试细胞或生物样品中一个或多个PRC相关基因的表达，如PRC1-692，并与正常对照表达水平相比。正常对照水平是已知没有罹患PRC的人群中典型发现的PRC相关基因的表达谱。来源于患者的组织样品中PRC相关基因的表达水平增加或降低表明该受试者罹患或存在发生PRC和PIN的风险。例如，与正常对照水平相比，测试群中的PRC1-88、296-321、458-537表达增加表明受试者罹患或存在发生PRC或PIN的风险。相反地，与正常对照水平相比，测试群中的PRC89-295、322-457、538-692表达降低表明受试者罹患或存在发生PRC或PIN的风险。
与正常对照水平相比，当测试群中的一个或多个PRC相关基因改变时，表明受试者罹患或存在发生PRC或PIN的风险。例如，至少1％、5％、25％、50％、60％、80％、90％或更多组(panel)PRC相关基因(PRC 1-88、PRC 296-321、PRC 458-537、PRC 89-295、PRC 322-457或PRC 538-692)改变。
通过定量相当于PRC 1-692的mRNA或其编码的蛋白可以估计具体样品中PRC 1-692的表达水平。本领域技术人员已知mRNA的定量方法。例如，通过Northern印迹或RT-PCR可以估计相当于PRC1-692的mRNAs水平。由于已经报道了PRC1-692的核苷酸序列，所以本领域任何技术人员可以设计定量PRC 1-692的探针或引物的核苷酸序列。
也可以根据基因编码蛋白的活性或量分析PRC 1-692的表达水平。确定PRC 1-692蛋白的量的方法在下面显示。例如，免疫测定方法对确定生物材料中的蛋白有用。任何生物材料可用于确定蛋白或其活性。例如，分析血液样品来估计血清标记编码的蛋白。另一方面，根据每个待分析蛋白的活性可以选择确定PRC 1-692编码蛋白的活性的合适方法。
在本发明中，也提供了诊断PRC或PIN的诊断试剂。本发明的诊断试剂包含与本发明的多核苷酸或多肽结合的化合物。优选，与PRC 1-692的多核苷酸杂交的寡核苷酸，或与PRC 1-692的多肽结合的抗体可以用作这种化合物。
在本发明中，PRC 1-692对诊断PRC和PIN之一或二者有用。在本发明中，PRC 1-295对诊断PRC和PIN都有用。PRC 296-457作为PRC特异性标记对诊断PRC也有用。此外，PRC 458-692作为PIN特异性标记对诊断PIN有用。
鉴定抑制或提高PRC相关基因表达的试剂抑制PRC相关基因的表达或活性的试剂是通过使表达PRC相关上调基因(PRC-associafed upregulated gene)的测试细胞群接触测试试剂并确定PRC相关基因的表达水平而鉴定的。与正常对照水平相比(或与不存在测试试剂下的水平相比)，在试剂存在下表达降低表明该试剂是PRC相关上调基因的抑制剂并对抑制PRC或PIN有用。
可供选择地，提高PRC相关下调基因的表达或活性的试剂是通过使表达PRC相关基因的测试细胞群接触测试试剂并确定PRC相关下调基因(PRC-associated down regulated gene)的表达水平或活性而鉴定的。与PRC相关基因的正常对照表达水平或活性相比，表达或活性增加表明测试试剂增加PRC相关下调基因的表达或活性。
测试细胞群是表达PRC相关基因的任何细胞。例如，测试细胞群含有上皮细胞，如来源于前列腺的细胞。例如，测试细胞是来源于PRC细胞的无限增殖细胞系。可供选择地，测试细胞是已经被PRC相关基因转染或已经被与报道基因可操作连接的来自PRC相关基因的调节序列(如启动子序列)转染的细胞。
估计对受试者PRC或PIN治疗的功效这里鉴定的差异表达的PRC相关基因也允许监测PRC和PIN之一或二者的治疗过程。在这个方法中，测试细胞群是受到PRC或PIN治疗的受试者提供的。如果期望，测试细胞群是在治疗之前、治疗期间或之后的各个时间点从受试者获得的。然后确定细胞群中一个或多个PRC相关基因的表达并与包括PRC状态已知的细胞的参照细胞群相比。参照细胞没有接受治疗。
如果参照细胞群含有非PRC细胞，那么测试细胞群和参照细胞群中的PRC相关基因之间表达的相似性表明治疗有效。然而，测试群和正常对照参照细胞群中的PRC相关基因之间表达的差异表明临床结果或预后较不利。
“有效”是指该治疗引起受试者中病理性上调基因表达降低，病理性下调基因表达增加或PRC的大小、流行(prevalence)或转移潜力降低。当预防性应用治疗时，“有效”是指该治疗延迟或预防PRC或PIN形成，或延迟、预防或减轻临床PRC或PIN的症状。使用标准临床方案进行前列腺肿瘤的估计。
联合任何已知方法确定诊断或治疗PRC和PIN之一或二者的有效性。例如通过鉴定症状异常诊断PRC，如泌尿道症状如排尿开始或停止困难、排尿困难、尿频或血尿。
选择适于特定个体的治疗PRC或PIN的治疗试剂个体基因组成的差异可导致他们代谢各种药物的相对能力的差异。在受试者中代谢作为PRC或PIN抑制剂的试剂可以通过诱导受试者细胞从PRC状态特征性的基因表达模式变为非PRC状态特征性的基因表达模式来证明其本身。因此，为了确定试剂在受试者中是否是合适的PRC或PIN抑制剂，这里公开的差异表达的PRC相关基因允许从所选受试者的测试细胞群中检测推定的治疗或预防抑制剂。
为了鉴定PRC或PIN抑制剂，也就是说适于特定受试者的抑制剂，来自受试者的测试细胞群接触治疗试剂，然后确定一个或多个PRC 1-692基因的表达。
测试细胞群含有表达PRC相关基因的PRC或PIN细胞。优选，测试细胞是上皮细胞。例如测试细胞群在候选试剂存在下培养，测定测试样品的基因表达模式并与一个或多个参照谱相比，所述参照谱如PRC参照表达谱或非PRC参照表达谱。
测试细胞群相对于含有PRC的参照细胞群，PRC 1-88、PRC 296-321、PRC 458-537中的一个或多个表达降低或PRC 89-295、PRC 322-457、PRC538-692中的一个或多个表达增加是该试剂是治疗试剂的表现。
测试试剂可以是任何化合物或组合物。例如，测试试剂是免疫调节剂。
鉴定治疗试剂的筛选试验这里公开的差异表达基因还可以用于鉴定治疗PRC或PIN的候选治疗试剂。该方法基于筛选候选治疗试剂以确定它是否使PRC状态特征性的PRC 1-692表达谱转变为非PRC状态的指示模式。
在本发明中，PRC 1-692对筛选治疗或预防PRC和PIN之一或二者的治疗试剂有用。PRC 1-295用于治疗或预防PRC和PIN之一或二者的治疗试剂的筛选。PRC 296-457也用作筛选治疗或预防PRC的治疗试剂的特异性标记。此外，PRC 458-692用作筛选治疗或预防PIN或预防PRC的治疗试剂的PIN特异性标记。
在该方法中，细胞接触测试试剂或测试试剂的组合(连续地或先后地sequentially or consequentially)并测定细胞中一个或多个PRC 1-692。测试群中PRC相关基因的表达谱与没有接触测试试剂的参照细胞群中PRC相关基因的表达水平进行比较。
有效刺激表达不足的基因表达，或抑制过度表达基因表达的试剂被认为可引起临床益处。进一步检测这种化合物预防动物或测试受试者的PRC的能力。
在进一步的实施方案中，本发明提供了筛选候选试剂的方法，该候选试剂是治疗或预防PRC和PIN之一或二者的潜在目标。如上详细讨论的，通过控制标志基因的表达水平或活性，可以控制PRC和PIN之一或二者的起病和进展。因此，治疗或预防PRC和PIN之一或二者的潜在目标的候选试剂可以通过使用标志基因的表达水平和活性作为指标的筛选来鉴定。在本发明的上下文中，这种筛选可以包括例如下列步骤a)测试化合物接触选自PRC 1-692组成的组的核酸所编码的多肽；b)检测该多肽和测试化合物之间的结合活性；和c)选择结合该多肽的化合物。
可供选择地，本发明的筛选方法可以包括下列步骤
a)候选化合物接触表达一个或多个标志基因的细胞，其中一个或多个标志基因选自PRC 1-692组成的组；和b)选择降低选自PRC 1-88、296-321、458-537组成的组的一个或多个标志基因表达水平，或提高选自PRC 89-295、322-457、538-692组成的组的一个或多个标志基因表达水平的化合物。
表达标志基因的细胞包括例如由PRC建立的细胞系；这种细胞可以用于本发明的上述筛选。
可供选择地，本发明的筛选方法可以包括下列步骤a)测试化合物接触选自PRC 1-692组成的组的核酸所编码的多肽；b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和c)选择与不存在测试化合物时检测的生物活性相比，抑制选自PRC1-88、296-321、458-537组成的组的核酸所编码多肽的生物活性，或与不存在测试化合物时检测的生物活性相比，提高选自PRC 89-295、322-457、538-692组成的组的核酸所编码多肽的生物活性的化合物。
筛选所需的蛋白可以得自重组蛋白，使用标志基因的核苷酸序列获得。基于标志基因的信息，本领域技术人员可以选择任何生物活性的蛋白作为基于所选择生物活性的筛选和测定方法的指标。
可供选择地，本发明的筛选方法可以包括下列步骤a)候选化合物接触细胞，该细胞中已经导入了包含一个或多个标志基因的转录调节区和在转录调节区控制下表达的报道基因的载体，其中一个或多个标志基因选自PRC 1-692组成的组b)测定所述报道基因的活性；和c)选择当与对照相比，所述标志基因是选自PRC 1-88、296-321、458-537组成的组的被上调的标志基因时，降低所述报道基因表达水平，或当与对照相比，所述标志基因是选自PRC 89-295、322-457、538-692组成的组的被下调的标志基因时，提高所述报道基因表达水平的化合物。
本领域熟知合适的报道基因和宿主细胞。筛选所需的报道构建体可以使用标志基因的转录调节区来制备。当本领域技术人员已知标志基因的转录调节区时，可以使用以前的序列信息制备报道构建体。当标志基因的转录调节区仍未鉴定时，可以基于标志基因的核苷酸序列信息从基因组文库中分离出含有转录调节区的核苷酸部分。
通过筛选所分离的化合物是抑制标志基因所编码蛋白的活性的药物候选者并可以应用于PRC或PIN的治疗或预防。
此外，其中抑制标志基因所编码蛋白活性的化合物的一部分结构是通过添加、缺失和/或取代转变而来的化合物也包括在本发明筛选方法可获得的化合物中。
当本发明方法分离的化合物作为人和其它哺乳动物的药物给予时，所述哺乳动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、猴子、狒狒和黑猩猩，该分离化合物可以直接给予或可以用已知药物制备方法配制成试剂形式。例如，根据需要，药物可以口服，作为糖衣片剂、胶囊、酏剂和微胶囊，或非口服的制剂，以无菌注射液或含水或任何其它药学可接受液体的悬浮液形式。例如，化合物可以与药学可接受载体或介质混合，具体地说，无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、增香剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂、等等，以普遍接受的药物实施过程需要的单位剂量形式。这些制剂中活性成分的量构成可得的指示范围内合适的剂量。
可以与片剂和胶囊混合的添加剂实例是，粘合剂如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂如结晶纤维素；膨松剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精；和增香剂如胡椒薄荷、Gaultheria adenothrix油和樱桃(cherry)。当单位剂量形式是胶囊时，液体载体，如油，也可以进一步包括在上述成分中。注射用无菌复方制剂(composite)可以在正常药物实施过程后使用媒介物如用来注射的蒸馏水来配制。
生理盐水、葡萄糖及其它等渗液体包括助剂，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠，可以用作注射水溶液。这些可以与合适的增溶剂联合使用，如醇类，具体地说乙醇，多元醇如丙二醇和聚乙二醇，非离子型表面活性剂，如吐温85(TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油可以用作油质液体，并可以与苯甲酸苄酯或苯甲醇联合作为增溶剂，并可以与缓冲液，如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液；镇痛剂，如盐酸普鲁卡因；稳定剂，如苯甲醇和苯酚；和抗氧化剂一起配制。制备的注射液可以填充入合适的安瓿。
可以采用本领域技术人员熟知方法给患者施用本发明的药物组合物，例如作为动脉内、静脉内或经皮注射液以及作为鼻内、经支气管、肌内或口服给药。给药剂量和方法根据患者体重和年龄和给药方法变化；然而，本领域技术人员可以常规选择合适的给药方法。如果所述化合物可由DNA编码，该DNA可以插入基因治疗的载体和该载体给予患者进行治疗。给药剂量和方法根据患者的体重、年龄和症状而变化，但是本领域技术人员可以适当地选择它们。
例如，尽管与本发明蛋白结合并调节其活性的化合物的剂量依赖于症状，但是当口服给予正常成年(体重60kg)时，该剂量是每天大约0.1mg至大约100mg，优选每天大约1.0mg至大约50mg等等，优选每天大约1.0mg至大约20mg。
当非肠道给药时，以注射液形式给予正常成年(体重60kg)，尽管根据患者、靶器官、症状和给药方法有一些不同，但是每天大约0.01mg至大约30mg，优选每天大约0.1至大约20mg和更优选每天大约0.1至大约10mg的剂量静脉内常规注射。而且，在其它动物的情况下，可能给予转换成60kg体重的量。
评估PRC或PIN受试者的预后也提供了评估PRC或PIN受试者预后的方法，通过比较测试细胞群中一个或多个PRC相关基因的表达和来源于患者的参照细胞群中基因的表达的疾病阶段谱。通过比较测试细胞群和参照细胞群中一个或多个PRC相关基因的基因表达，或通过比较来源于受试者的测试细胞群中基因随时间的表达模式，可以评估受试者的预后。
与正常对照相比，PRC 89-295、PRC 322-457、PRC 538-692中一个或多个表达降低，或与正常对照相比，PRC 1-88、PRC 296-321、PRC 458-537中一个或多个表达增加表明预后较差。PRC 89-295、PRC 322-457、PRC538-692中一个或多个表达增加，和PRC 1-88、PRC 296-321、PRC 458-537表达降低表明受试者的预后较好。
试剂盒本发明也包括PRC检测试剂，例如核酸或抗体，所述核酸特异性结合或鉴定一个或多个PRC核酸如寡核苷酸序列，与PRC核酸的一部分互补，所述抗体与PRC核酸编码蛋白结合的抗体。这些试剂共同包装在试剂盒形式中。这些试剂包装在单独的容器中，如核酸或抗体(与固相介质结合或与使它们与介质结合的试剂分开包装)、对照试剂(阳性和/或阴性)，和/或可检测标记。实施该检测的说明(例如书面文字、磁带、VCR、CD-ROM等等)包括在试剂盒中。试剂盒的检测格式是本领域已知的Northern杂交或夹心ELISA。
例如，PRC检测试剂固定在固相介质如多孔条带材料(porous strip)上以形成至少一个PRC检测部位。多孔条带材料的检测区可以包括含有核酸的许多部位。测试条带也可以含有阴性和/或阳性对照的部位。可供选择地，对照部位位于与测试条带分离的带上。任选，不同的检测部位可以含有不同量的固定核酸，即第一个检测部位量较高和随后部位的量较小。添加测试样品后，显示可检测信号的部位数目提供了样品中存在的PRC量的定量指示。检测部位可以是设置为任何合适可检测形状并且典型的是跨越测试条带宽度的条或点的形状。
可供选择地，试剂盒含有包含一个或多个核酸序列的核酸基质阵列(substrate array)。阵列上的核酸特异性鉴定PRC 1-692代表的一个或多个核酸。PRC 1-692代表的核酸中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40或50或更多的表达依靠与阵列测试带或片(chip)结合的水平而鉴定。基质阵列可以支撑在例如固相基质上，如美国专利5,744,305中所述的“片”。
阵列和多元本发明也包括包含一个或多个核酸的核酸基质阵列。阵列上的核酸特异性结合PRC 1-692代表的一个或多个核酸序列。通过检测与阵列结合的核酸鉴定PRC 1-692代表的核酸中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40或50或更多的表达水平。
本发明也包括分离的多元(plurality)核酸(即两个或更多核酸的混合物)。这些核酸处于液相或固相中，如固定在固相支持体如硝酸纤维膜上。所述多元包括PRC 1-692代表的一个或多个核酸。在各种实施方案中，多元包括PRC 1-692代表的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40或50或更多核酸。
抑制PRC或PIN的方法本发明提供了治疗或减轻受试者PRC或PIN症状的方法，通过降低PRC 1-88、PRC 296-321、PRC 458-537的表达或活性，或增加PRC 89-295、PRC 322-457、PRC 538-692的表达或活性。治疗化合物预防或治疗性给予罹患或存在发生PRC或PIN风险(或对PRC或PIN敏感)的受试者。使用标准临床方法，或通过检测(如PRC 1-692)表达或活性的异常水平来鉴定这种受试者。治疗试剂包括细胞周期调节、细胞增殖和蛋白激酶活性的抑制剂。
在本发明中，PRC 1-692作为分子目标对治疗或预防PRC和PIN之一或二者有用。PRC 1-295对治疗或预防PRC和PIN都有用。PRC 296-457作为分子目标也对治疗或预防PRC有用。此外，PRC 458-692对治疗或预防PIN和最终预防PRC有用。
治疗方法包括增加PRC或PIN细胞中的相对于PRC或PIN细胞所来源的组织类型相同的正常细胞来说表达降低的基因(“低表达基因”)的一个或多个产物的表达，或功能，或二者都增加。在这些方法中，用有效量的化合物治疗受试者，该化合物增加受试者中一个或多个低表达基因的量。给药可以全身或局部。治疗化合物包括低表达基因的多肽产物，或其生物学活性片段，编码低表达基因并具有允许在PRC或PIN细胞中表达的表达控制元件的核酸；例如增加PRC或PIN细胞内源的这种基因表达水平(即上调低表达基因表达)的试剂。给予这种化合物可作用于受试者的前列腺细胞中异常低表达基因并改善受试者的临床病症。
该方法也包括降低表达异常增加的基因(“过表达基因”)的一个或多个基因产物的表达，或功能，或二者都降低。可通过本领域已知的几种方法中任何一种来抑制表达。例如，通过给受试者施用抑制或拮抗过表达基因表达的核酸而抑制表达，如反义寡核苷酸或小干扰RNA可破坏过表达基因的表达。
可供选择地，通过给予结合或否则抑制基因产物功能的化合物来抑制过表达基因的一个或多个基因产物的功能。例如，该化合物是与过表达基因产物结合的抗体。
如上指出，对应于PRC 1-88、296-321、458-537的核苷酸序列的反义核酸可用于降低PRC 1-88、296-321、458-537的表达水平。对应于PRC和PIN中之一或二者中上调的PRC 1-88、296-321、458-537的反义核酸对治疗PRC和PIN之一或二者有用。具体地说，本发明的反义核酸可以通过结合PRC 1-88、296-321、458-537或其相应的mRNAs，由此抑制这些基因的转录或翻译，促进mRNAs降解，和/或抑制选自PRC 1-88、296-321、458-537组成的组的核酸所编码蛋白的表达，最后抑制蛋白的功能来起作用。这里使用的术语“反义核酸”既包括与靶序列完全互补又包括具有一个或多个核苷酸错配的核苷酸，只要反义核酸可以与靶序列特异性杂交。例如，本发明的反义核酸包括具有至少70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高同源性的多核苷酸，跨越至少15个连续的核苷酸。本领域已知的算法可以用于确定同源性。
本发明的反义核酸衍生物作用于产生标志基因所编码蛋白的细胞，通过结合编码蛋白的DNAs或mRNAs，抑制它们的转录或翻译，促进mRNAs降解和抑制蛋白的表达，由此导致蛋白功能的抑制。
本发明的反义核酸衍生物可以制成外用制剂，如擦剂或膏剂，通过与相对于衍生物而言是非活性的合适基材混合。
而且，需要时，所述衍生物可以配制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、脂质体胶囊、注射液、溶液、滴鼻剂和冷冻干燥剂，通过添加赋形剂、等渗剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、镇痛剂等等。这些可以遵循已知方法制备。
反义核酸衍生物通过直接应用于患病部位上或注射到血管中使得它将达到患病部位而给予患者。反义核酸固定介质还可以用于增加持久性和膜渗透性。实例是脂质体、聚L-赖氨酸、脂质、胆固醇、lipofectin或这些的衍生物。
本发明的反义核酸衍生物的剂量可以根据患者的情况适当调节并以期望量使用。例如，可以给予0.1至100mg/kg的剂量范围，优选0.1至50mg/kg。
本发明的反义核酸抑制本发明蛋白的表达并因此对抑制本发明蛋白的生物活性有用。而且，包含本发明反义核酸的表达抑制剂有用，因为它们可以抑制本发明蛋白的生物活性。
本发明的反义核酸包括修饰的寡核苷酸。例如，硫醇化(thioated)的核苷酸可以用于为寡核苷酸提供核酸酶抗性。
而且，抗标志基因的siRNA可用于降低标志基因的表达水平。术语“siRNA”是指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用siRNA导入细胞的标准技术，包括其中DNA是RNA转录的模板的方法。在本发明的上下文中，siRNA包含正义核酸序列和抗上调的标志基因的反义核酸序列，所述上调的标志基因如PRC 1-88、296-321、458-537。构建siRNA使得单一转录物兼备来自靶基因的正义和互补反义序列，如发夹。
该方法用于改变细胞中上调基因的表达，如由于细胞恶性转化所致的基因上调。siRNA与靶细胞中相当于PRC 1-88、296-321、458-537之一的转录物的结合导致该细胞的蛋白质产量减少。寡核苷酸的长度是至少10个核苷酸并可以长如天然存在的转录物。优选，该寡核苷酸长度是19-25个核苷酸。最优选，该寡核苷酸长度少于75、50、25个核苷酸。
使用可从Ambion网址(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)获得的siRNA设计计算机程序设计siRNAs的核苷酸序列。根据下列方案，计算机程序选择siRNA合成的核苷酸序列。
siRNA靶部位的选择1.从目标转录物的起始密码子AUG开始，扫描下游的AA二核苷酸序列。记录每个AA的存在和3′邻近的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶部位。Tuschl等推荐反对设计siRNA接近5′和3′非翻译区(UTRs)和接近起始密码子的区域(75个碱基内)，因为这些可能富含调节蛋白结合部位。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能妨碍siRNA核酸内切酶复合体的结合。
2.将潜在的靶部位和人的基因组数据库进行比较，并排除考虑与其它编码序列具有显著同源性的任何靶序列。可以使用BLAST进行同源性检索，它可以在NCBI服务器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/找到。
3.选择用于合成的合格靶序列。在Ambion中，沿着用于估计的基因长度可以选择优选的几个靶序列。
本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明多肽的表达并因此对抑制本发明多肽的生物活性有用。而且，包含本发明反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂有用，因为它们可以抑制本发明多肽的生物活性。因此，包含本发明反义寡核苷酸或siRNA的组合物对治疗PRC或PIN有用。
可供选择地，通过给予结合或否则抑制基因产物功能的化合物来抑制过表达基因的一个或多个基因产物的功能。例如，该化合物是与过表达基因产物结合的抗体。
本发明涉及抗体的用途，尤其是抗上调的标志基因所编码蛋白的抗体，或该抗体的片段。这里使用的术语“抗体”涉及具有特异性结构的免疫球蛋白分子，它仅与用于合成该抗体的抗原(即上调的基因产物)或与其密切相关的抗原相互作用(结合)。此外，抗体可以是抗体片段或修饰的抗体，只要它结合标志基因所编码的一个或多个蛋白。例如，抗体片段可以是Fab、F(ab)2、Fv或单链Fv(ScFv)，其中来自H和L链的Fv片段通过合适的接头连接(Huston J.S.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855879-5883(1988))。更具体地说，通过用酶处理抗体，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，可以产生抗体片段。可供选择地，可以构建编码抗体片段的基因，插入表达载体并在合适的宿主细胞中表达(见例如Co M.S.et al.J.Immunol.1522968-2976(1994)；Better M.and Horwitz A.H.Methods Enzymol.178476-496(1989)；Pluckthun A.and Skerra A.Methods Enzymol.178497-515(1989)；Lamoyi E.Methods Enzymol.121652-663(1986)；Rousseaux J.et al.Methods Enzymol.121663-669(1986)；Bird R.E.and Walker B.W.Trends Biotechnol.9132-137(1991))。
抗体可以通过与各种分子结合而被修饰，如聚乙二醇(PEG)。本发明提供了这种修饰抗体。修饰抗体可以通过化学修饰抗体获得。这些修饰方法在本领域是常规的。
可供选择地，可以获得作为嵌合抗体的抗体，在来源于非人抗体的可变区和来源于人抗体恒定区之间，或作为人源化抗体，包含来源于非人抗体的互补决定区(CDR)、来源于人抗体的框架区(FR)，和恒定区。可以使用已知技术制备这种抗体。
针对癌细胞中存在的特定分子改变的癌症疗法已经通过临床发展证实和批准为抗癌药物，如曲妥单抗(trastuzumab)(Herceptin)治疗晚期乳腺癌、甲基化的imatinib(Gleevec)治疗慢性粒细胞性白血病、gefitinib(Iressa)治疗非小细胞性肺癌(NSCLC)和美罗华(rituximab)(抗CD20 mAb)治疗B细胞性淋巴瘤和外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)(Ciardiello F，Tortora G. Anovel approach in the treatment of cancertargeting the epidermal growth factorreceptor.Clin Cancer Res.2001 Oct；7(10)2958-70.Review.；Slamon DJ，Leyland-Jones B，Shak S，Fuchs H，Paton V，Bajamonde A，Fleming T，EiermannW，Wolter J，Pegram M，Baselga J，Norton L. Use of chemotherapy plus amonoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer thatoverexpresses HER2.N Engl J Med.2001 Mar 15；344(11)783-92.；Rehwald U，Schulz H，Reiser M，Sieber M，Staak JO，Morschhauser F，Driessen C，Rudiger T，Muller-Hermelink K，Diehl V，Engert A.Treatment of relapsed CD20+Hodgkinlymphoma with the monoclonal antibody rituximab is effective and welltoleratedresults of a phase 2 trial of the German Hodgkin Lymphoma StudyGroup.Blood.2003 Jan 15；101(2)420-424.；Fang G，Kim CN，Perkins CL，Ramadevi N，Winton E，Wittmann S and Bhalla KN.(2000).Blood，96，2246-2253.)。这些药物临床上有效并且比传统的抗癌剂更好耐受，因为它们仅仅对准转化细胞。因此，这种药物不仅改善癌症患者的幸存和生活质量，而且证实了分子靶癌症疗法的构思。此外，当与其联合使用时，靶药物可以提高标准化学疗法的功效(Gianni L.(2002).Oncology，63Suppl 1，47-56.；Klejman A，Rushen L，Morrione A，Slupianek A and Skors ki T.(2002).Oncogene，21，5868-5876.)。因此，未来的癌症治疗将可能包括常规药物与针对肿瘤细胞不同特征如血管生成和侵润性的特殊靶试剂组合。
这些调节方法回体(exvivo)或体外进行(如通过用试剂培养细胞)或，可供选择地，在体内进行(如将试剂给予受试者)。该方法包括给予蛋白或蛋白组合或核酸分子或核酸分子组合作为抵制差异表达基因的异常表达或活性的疗法。
以基因水平或生物活性增加(相对于没有罹患疾病或紊乱的受试者)为特征的疾病和紊乱可以用拮抗(即降低或抑制)过表达基因活性的疗法来治疗。为治疗或预防性目的可给予拮抗活性的治疗剂。
可以利用的治疗剂包括例如(i)低表达基因或基因的多肽、或其类似物、衍生物、片段、同源物；(ii)过表达基因或基因的抗体；(iii)编码低表达基因或基因的核酸；(iv)反义核酸或“无功能的(dysfunctional)”核酸(即由于一个或多个过表达基因的编码序列内的异源插入)；(v)小干扰RNA(siRNA)；或(vi)调节剂(即改变过表达/低表达多肽及其结合伙伴之间相互作用的抑制剂、激动剂和拮抗剂。利用无功能的反义分子通过同源重组“剔除”多肽的内源功能(见如Capecchi，Science 2441288-12921989)。
以水平或生物活性降低(相对于没有罹患疾病或紊乱的受试者)为特征的疾病和紊乱可以用增加活性的治疗剂(即是激动剂)来治疗。可以以治疗或预防方式给予上调活性的治疗剂。可以利用的治疗剂包括但不限于多肽(或其类似物、衍生物片段或同源物)或增加生物利用率的激动剂。
可以容易地检测水平的增加或降低，通过定量肽和/或RNA，通过获得患者组织样品(如来自活检组织)和体外测定它的RNA或肽水平、表达的肽的结构和/或活性(或表达改变的基因的mRNAs)。本领域内熟知的方法包括但不限于免疫测定(例如用Western印迹分析、免疫沉淀反应随后十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)和/或杂交试验以检测mRNAs表达(例如Northern试验、斑点印迹、原位杂交等)。
在疾病明显的临床症状出现前进行预防给药，使得疾病或紊乱得到预防或可供选择地延迟疾病或紊乱的进展。
治疗方法包括使细胞接触调节差异表达基因的基因产物的一种或多种活性的试剂。调节蛋白活性的试剂包括核酸或蛋白，天然存在的这些蛋白的同源配体、肽、肽模拟物或其它小分子。例如，所述试剂刺激一个或多个差异低表达基因的一种或多种蛋白活性。
本发明也涉及治疗或预防受试者的PRC和PIN之一或二者的方法，包括给所述受试者施用包含选自PRC 1-88、296-321、458-537组成的组的核酸所编码多肽或所述多肽的免疫活性片段，或编码该多肽的多核苷酸或其片段的疫苗。给予该多肽诱导受试者的抗肿瘤免疫。为了诱导抗肿瘤免疫，给予选自PRC 1-88、296-321、458-537组成的组的核酸所编码多肽或所述多肽的免疫活性片段，或该多肽编码的多核苷酸。该多肽或其免疫活性片段可有效作为抗PRC和PIN之一或二者的疫苗。有些情况下，蛋白或其片段可以以与T细胞受体(TCR)结合的形式给予或由抗原呈递细胞(APC)呈递，如巨噬细胞、树状细胞(DC)或B细胞。由于DC强烈的抗原呈递能力，利用DC是APCs中最优选的。
在本发明中，抗PRC和PIN之一或二者的疫苗涉及接种给动物时具有诱导抗肿瘤免疫的功能的物质。根据本发明，选自PRC 1-88、296-321、458-537组成的组的核酸所编码的多肽或其片段提示是可以诱导抗表达PRC 1-88、296-321、458-537的PRC和PIN细胞之一或二者的有效和特异性免疫应答的HLA-A24或HLA-A*0201限制性的表位肽。因此，本发明也包括使用该多肽诱导抗肿瘤免疫的方法。通常，抗肿瘤免疫包括免疫反应如下-诱导抗肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，-诱导识别肿瘤的抗体，和-诱导抗肿瘤细胞因子产生。
因此，当将某一蛋白接种给动物可诱导出这些免疫反应中任何一种时，可确定该蛋白具有抗肿瘤免疫诱导作用。蛋白诱导的抗肿瘤免疫可以通过观察在抗该蛋白宿主中的体内或体外免疫系统反应来检测。
例如，本领域熟知检测诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法。进入活体的外来物质在抗原呈递细胞(APCs)作用下被呈递给T细胞和B细胞。对APC呈递的抗原起反应的T细胞由于受该抗原刺激，以抗原特异性方式分化成为细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTLs)，然后增殖(这称为T细胞激活)。因此，可以通过APC将肽呈递给T细胞，并检测CTL诱导来评价某些肽诱导的CTL。此外，APC具有激活CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀伤淋巴细胞的作用。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗肿瘤免疫中也很重要，因此可以使用这些细胞的激活作用作为指示剂评价肽的抗肿瘤免疫的激活作用。
本领域熟知使用树状细胞(DCs)作为APC评价CTL诱导活性的方法。DC是APCs中具有最强CTL诱导活动的代表性APC。在这个方法中，使测试多肽最初接触DC，然后这个DC接触T细胞。接触DC后检测具有抗该细胞的细胞毒性作用的T细胞证明测试多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。可以检测CTL抗肿瘤活性，例如，使用51Cr标记的肿瘤细胞溶解作为指示。可供选择地，也熟知使用3H-胸腺嘧啶核苷摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指示评价肿瘤细胞损害程度的方法。
除了DC，外周血单个核细胞(PBMCs)也可以用作APC。报道了通过在GM-CSF和IL-4存在下培养PBMC可以提高CTL的诱导。类似地，已经证明通过在钥孔血蓝蛋白(KLH)和IL-7存在下培养PBMC可诱导CTL。
用这些方法证实具有CTL诱导活性的测试多肽是具有DC激活作用和随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导抗肿瘤细胞的CTL的多肽可有效作为抗肿瘤疫苗。此外，通过接触多肽获得诱导抗肿瘤CTL能力的APC也可用作抗肿瘤的疫苗。此外，由于APC呈递多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可以用作抗肿瘤疫苗。这种使用由于APC和CTL的抗肿瘤免疫治疗肿瘤的方法称作细胞免疫疗法。
通常，当使用多肽进行细胞免疫疗法时，通过具有不同结构的多个多肽组合以及它们与DC接触来增加CTL诱导的效率是已知的。因此，当用蛋白片段刺激DC时，使用多种类型片段的混合物是有利的。
可供选择地，可以通过观察诱导的抗肿瘤抗体产生来证实多肽诱导的抗肿瘤免疫。例如，当用多肽免疫的实验动物中诱导出抗多肽的抗体，以及当那些抗体抑制肿瘤细胞生长时，可以确定该多肽具有诱导抗肿瘤免疫的能力。
给予本发明的疫苗可诱导抗肿瘤免疫，抗肿瘤免疫的诱导能够治疗和预防PRC和PIN之一或二者。抗癌疗法或预防癌症发生包括任何步骤，如抑制癌细胞的生长，使癌退化和抑制癌症的发生。癌症的个体死亡率降低、血液中肿瘤标志物降低、癌症伴发的可检测症状减轻等等也包括在癌症的治疗或预防中。优选这种治疗和预防效果具有统计学显著性。例如，在观察中，在5％或更低的显著性水平，其中该水平是抗细胞增殖疾病的疫苗的治疗或预防效果与没有给予疫苗的对照相比的。例如，Student′s t检验、Mann-Whitney u检验或ANOVA可以用于统计分析。
上面提及的具有免疫活性的蛋白或编码该蛋白的载体可以与佐剂组合。佐剂是指当与具有免疫活性的蛋白一起(或先后)给予时，提高抗该蛋白的免疫反应的化合物。佐剂的实例包括霍乱毒素、沙门氏菌毒素、明矾等等，但不限于这些。此外，本发明的疫苗可以与药学可接受载体适当组合。这种载体的实例是无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等等。此外，根据需要，该疫苗可以含有稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂等等。该疫苗全身或局部给予。疫苗给药可以通过单次给予或多次给予加强进行。
当使用APC或CTL作为本发明的疫苗，例如可以用回体方法治疗或预防肿瘤。更具体地说，收集接受治疗或预防的受试者的PBMCs，该细胞回体接触多肽，随后诱导APC或CTL，该细胞可以给予受试者。通过编码该多肽的载体回体导入PBMCs也可以诱导APC。体外诱导的APC或CTL在给药前可以体外克隆。通过克隆和培养具有高活性破坏靶细胞的细胞，可以更有效地进行细胞免疫疗法。此外，以这种方式分离的APC和CTL可以用于细胞免疫疗法，不仅抗该细胞所来源的个体，而且抗来自其他个体的类似肿瘤类型。
此外，提供了包含药物有效量的本发明多肽的治疗或预防细胞增生性疾病的药物组合物，如癌症。该药物组合物可以用于产生抗肿瘤免疫。
抑制PRC或PIN的药物组合物药物制剂包括适于口腔、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、阴道或肠胃外(包括肌内、皮下和静脉内)给药，或适于吸入或吹入给药的那些。优选静脉内给药。任选该制剂以分开的剂量单位包装。
适于口服的药物制剂，包括胶囊、扁囊剂或片剂，每种含有预定量的活性成分。制剂也包括粉剂、粒剂或溶液、悬浮液或乳剂。活性成分任选作为丸剂、干药糖剂或糊剂给予。口服给药的片剂和胶囊可以含有常规的赋形剂如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂。片剂可以通过任选与一个或多个配方的成分压缩或铸模而制备。压制的片剂可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式的活性成分如粉剂或粒剂而制备，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可以通过在合适的机器中将与惰性液体稀释剂润湿的粉剂化合物的混合物铸模而制备。可以根据本领域熟知方法包裹片剂。口服液体制剂可以是例如含水或油的悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂的形式，或可以作为使用之前用水或其它合适载体重建的干燥产品存在。这种液体制剂可以含有常规的添加剂如悬浮剂、乳化剂、非水载体(可以包括食用油类)或防腐剂。可以任选配制片剂，使得其中提供慢或控制释放的活性成分。片剂的包装可以含有本月每天服用的一个片剂。
肠胃外给药的制剂包括含水和无水的无菌注射液，它可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使该制剂与预定接受者的血液等渗的溶质；和含水和无水的无菌悬浮液，它可以包括悬浮剂和增稠剂。该制剂可以在单位剂量或多剂量容器中存在，例如密封的安瓿和小瓶，可以保存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在使用前立即添加无菌液体载体，例如用于注射液的盐、水。可供选择地，该制剂可以连续输液剂存在。临时注射液和悬浮液可以由前述该种类的无菌粉剂、粒剂和片剂来制备。
直肠给药的制剂包括含标准载体如可可油或聚乙二醇的栓剂。在口腔局部给药的制剂，例如颊或舌下，包括锭剂，在加调味基质如蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶中含有活性成分，和在基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分的软锭剂。对于鼻内给药，本发明的化合物可以用作液体喷雾或可分散性粉剂或滴剂形式。滴剂可以用含水或无水基质配制，也可以含有一个或多个分散剂、增溶剂或悬浮剂。
对于吸入给药，该化合物方便地从吹入器、喷雾器、加压包装或输送气溶胶喷雾剂的其它方便装置中释放出来。加压包装可以包括合适的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压喷雾剂情况下，剂量单位可以提供输送计定量的阀来确定。
可供选择地，对于吸入或吹入给药，该化合物可以采取干粉组合物的形式，例如化合物和合适的粉剂基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉剂组合物可以以单位剂量形式存在，例如，胶囊、弹药筒(cartridge)、明胶或泡状包装(blister pack)，从中粉剂可以在吸入器或吹入器帮助下给予。
其它制剂包括植入装置和粘性贴片；它们释放治疗试剂。
当期望时，可以采用适合提供持续释放活性成分的上述制剂。药物组合物也可以含有其它活性成分如抗微生物剂、免疫抑制剂或防腐剂。
应该理解除了尤其是上述成分外，本发明的制剂可以包括本领域关于所述制剂类型的常规其它试剂，例如，适于口服的制剂可以包括调味剂。
优选的单位剂量制剂是含有如下叙述的有效剂量，或其合适部分的活性成分的制剂。
对于上述的每个条件，该组合物，例如多肽和有机化合物，以每天大约0.1至大约250mg/kg的剂量口服或注射给予。成年人的剂量范围通常是大约5mg至大约17.5g/天，优选大约5mg至大约10g/天，和最优选大约100mg至大约3g/天。以分散单位提供的片剂或其它的单位剂量形式可以方便地含有在这种剂量下有效的量，或作为多个相同的量提供，例如，提供含有大约5mg至大约500mg的多个单位，通常是大约100mg至大约500mg的多个单位。
采用的剂量将依赖于很多因素，包括受试者的年龄和性别，正在治疗的确切紊乱及其严重性。给药途径也可以根据病情及其严重性而变化。
将在下列实施例中进一步描述本发明，它们不限制权利要求中描述的本发明的范围。下列实施例阐明了PRC或PIN细胞中差异表达的基因的鉴定和特征。
实施例1测试样品的制备评价从患病组织(例如来自PRCs的上皮细胞)和正常组织获得的组织以鉴定差异表达的基因或疾病状态，例如PRC。该试验如下进行。
患者、组织样品和激光捕获显微解剖(LCM)包括非癌性前列腺组织的PRC样品是从没有外科手术前治疗经历过根治性前列腺切除术的26名患者获得的。单个病理学家(M.F.)以组织病理学诊断前列腺腺癌或高级PINs。在26个PRC组织中，具有足以进行分析的RNA量和质的20个癌症和10个高级PINs细胞用于微阵列研究。表1详述了肿瘤的临床和病理信息。样品包埋入TissueTek OCT培养基(Sakura)，然后贮藏在-80℃直到使用。用恒冷切片机将冷冻样品顺序分成8μm的切片并用苏木精和伊红染色以限定分析的区域。为了避免癌症和非癌细胞的交叉污染，用EZ Cut LCM系统(SL Microtest GmbH)遵循具有若干改变的制造商的方案制备两群。
表1临床病理特征
(a)T表示前列腺癌。(b)NA未获得
RNA提取和基于T7的RNA扩增从每个激光捕获细胞群提取总RNA放入350μl RLT溶解缓冲液(QIAGEN)中。在室温下，用30单位DNase I(QIAGEN)，在1单位RNase抑制剂(TOYOBO、大阪、日本)存在下处理提取的RNA 30分钟以消除任何污染的基因组DNA。在70℃灭活10分钟后，用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)根据制造商的推荐纯化RNAs，DNase处理的RNAs接受基于T7的RNA扩增。两轮扩增，每个样品产生了50-100μg扩增的RNA(aRNA)。来自每种癌细胞和非癌细胞的2.5μg等份的aRNA分别在Cy5-dCTP和Cy3-dCTP存在下反转录。
cDNA微阵列的制备制备含有从国家生物技术信息中心(NCBI)UniGene数据库o(build#131)选择的23,040个cDNAs的“基因组宽泛”的cDNA微阵列系统。简言之，用从人各种器官分离的poly(A)+RNA作为模板反转录PCR扩增cDNAs；扩增子长度从200至1100bp的范围没有重复或poly(A)序列。用Array Spotter Generation III(Amersham Bioscience)将PCR产物一式两份点在7型载玻片(Amersham Bioscience)上。每个玻片含有52个看家基因，来标准化不同荧光染料的信号强度。
杂交和数据的获得根据前述方案进行杂交和洗涤，除了全部方法用自动玻片处理机(Amersham Biosciences)进行(17)。用ArrayVision计算机程序(AmershamBiosciences)光度测定法计算每个杂交信号的强度并减去背景强度。使用52个看家基因的平均信号对每个Cy3-和Cy5信号强度进行标准化。根据背景波动自动计算每个表达水平的截止值(cut-off value)。当Cy3和Cy5信号强度都比截止值低时，估计那个样品中相应基因的表达缺乏。计算Cy5/Cy3比率作为相对表达比率。对于其它基因，我们用每个样品的原始数据计算了Cy5/Cy3比率。
实施例2PRC相关基因的鉴定当鉴定了PRC和PINs共有的上或下调的基因时，用下列标准分析该基因。最初，选择50％以上病例能够计算相对表达比率的基因和在50％以上病例中被上或下调表达的基因。每个基因的相对表达比率(Cy5/Cy3强度比)分为四类之一(1)上调的(在50％以上信息中表达比率超过3.0)；(2)下调的(在50％以上病例信息中表达比率低于0.33)；(3)表达不变(在50％以上病例信息中表达比率在0.33和3.0之间)；和(4)不表达(或轻微表达，但检测在截止水平以下)。这些种类限定检测一组基因，该基因表达比率的改变在样品中常见以及对某些亚组具有特异性。为了检测在PRC和PIN细胞之一或二者中共同上或下调的候选基因，筛选23，040个基因的总表达模式以选择在分为(1)、(2)或(3)的50％以上PRC病例中存在的表达比率在3.0以上或低于0.33的基因。
此外，当鉴定了PRC或PINs共有的上或下调基因时，用下列标准分析该基因。最初，选择50％以上病例能够计算相对表达比率的基因和在50％以上病例中被上或下调表达的基因。每个基因的相对表达比率(Cy5/Cy3强度比)分为四类之一(5)上调的(在50％以上信息中表达比率超过5.0)；(6)下调的(在50％以上病例信息中表达比率低于0.2)；(7)表达不变(在50％以上病例信息中表达比率在0.2和5.0之间)；和(8)不表达(或轻微表达，但检测在截止水平以下)。这些种类限定检测一组基因，该基因表达比率的改变在样品中常见以及对某些亚组具有特异性。为了检测在PRC和PIN细胞之一或二者中共同上或下调的候选基因，筛选23,040个基因的总表达模式以选择在分为(5)、(6)或(7)的50％以上PRC病例中存在的表达比率在5.0以上或低于0.2的基因。
PRC细胞中临床相关的表达模式的基因的鉴定用cDNA微阵列研究了PRC细胞中大约23,000个基因的表达模式。当Cy5和Cy3信号都在截止值之下时，此单个的数据排除在外。鉴定了在PRC和PINs中表达比率在3.0以上的88个上调基因(见表3)，同时鉴定了表达比率低于0.33的207个下调基因(见表4)。鉴定了在PRC中表达比率在5.0以上的26个上调基因(见表5)，同时鉴定了表达比率低于0.2的136个下调基因(见表6)。
在上调基因中，已经报道了α-甲酰辅酶A消旋酶(AMACR)在PRC中过表达(13)。此外，这些上调元件包括涉及代谢和信号转导途径、转录因子、细胞周期、致癌基因和细胞粘附和细胞骨架中包含的重要基因。它们当中，已经报道了前列腺特异性G蛋白偶联受体(PSGR)-嗅觉受体，51家族，E亚家族，成员2(OR51E2)，和PRC过表达基因1(POV1)作为PRC中过表达的基因(Luo et al.，2002；Cole et al.，1998；Xu et al.，2000)(见表5)。
鉴定了PINs中表达比率在5.0以上的80个上调基因(见表7)，同时鉴定了表达比率低于0.2的155个下调基因(见表8)。
为了证实微阵列分析表明表达的可靠性，进行半定量RT-PCR实验。选择四个上调基因，用半定量RT-PCR测定它们的表达水平。用随机引物(Roche)和Superscript II(Life Technologies，Inc.)将每个样品的3μg等份aRNA反转录为单链cDNAs。稀释每个cDNA混合物，用表2显示的引物组进行随后的PCR扩增。β-肌动蛋白(ACTB)的表达作为内部对照。优化PCR反应的循环次数以确保产物强度在扩增的线性相内。
比较在几乎所有病例信息中过表达的4个上调基因(AMACR、HOXC6、POV1、ABHD2和C20ORF102)的表达水平，结果高度类似于大多数测试病例中微阵列分析的结果(图1)。这些数据证实了我们鉴定在PRC细胞中共同上调基因的策略的可靠性。
表3 前列腺癌和PINs中共同上调的基因
表4 在前列腺癌和PINs中共同下调的基因
表5 20个前列腺癌中共同上调的基因
表6 20个前列腺癌中共同下调的基因
表7 10个PINs中上调基因
表8 在10PINs中下调的基因
表2 半定量RT-PCR实验的引物序列
工业实用性这里描述的通过激光捕获解剖(laser-capture dissection)和基因组宽泛cDNA微阵列获得的PRC和PIN的基因表达分析鉴定了癌症预防和治疗目标的特异基因。根据这些差异表达基因亚组的表达，本发明提供了鉴定或检测PRC和PIN之一或二者的分子诊断标志物。
这里描述的方法也对用于鉴定预防、诊断和治疗PRC和PIN之一或二者的另外分子靶有用。这里报道的数据有助于对PRC的全面理解，促进新诊断策略的发展，和提供了鉴定治疗药物和预防试剂的分子靶的线索。这些信息有助于更深刻理解前列腺肿瘤发生，并提供了开发诊断、治疗和最终预防PRC的新策略的途径。
这里引用的所有专利、专利申请、和出版物的全部内容引入作为参考。此外，尽管已经详细地并参考其具体实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员将显而易见其中可以进行各种改变和修改，而不背离本发明的精神的范围。
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<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>1tcatgatctc cctctaagca cat 23<210>2<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>11ttggcttgac tcaggattta 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>12tggacttggg agaggactgg 20
权利要求
1.一种诊断受试者PRC和PIN之一或二者或发生PRC和PIN之一或二者的倾向性的方法，包括确定来源于患者的生物样品中PRC相关基因的表达水平，其中与所述基因的正常对照水平相比，所述水平的增加或降低表明所述受试者罹患PRC和PIN之一或二者或存在发生PRC和PIN之一或二者的风险。
2.权利要求1的方法，其中所述PRC相关基因选自由PRC 1-88组成的组，其中与正常对照水平相比，所述水平增加表明所述受试者罹患或存在发生PRC和PIN中之一或二者的风险。
3.权利要求2的方法，其中所述增加是比所述正常对照水平高至少10％。
4.权利要求1的方法，其中所述PRC相关基因选自由PRC 89-295组成的组，其中与正常对照水平相比，所述水平降低表明所述受试者罹患或存在发生PRC和PIN中之一或二者的风险。
5.权利要求4的方法，其中所述降低是比所述正常对照水平降低至少10％。
6.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括确定多元PRC相关基因的所述表达水平。
7.权利要求1的方法，其中用选自(a)检测PRC相关基因的mRNA，(b)检测PRC相关基因编码的蛋白，和(c)检测PRC相关基因编码的蛋白的生物活性组成的组的任何一个方法确定表达水平。
8.权利要求1的方法，其中通过检测PRC相关基因探针与所述来源于患者的生物样品中的基因转录物的杂交来确定所述表达水平。
9.权利要求8的方法，其中所述杂交步骤是在DNA阵列上进行。
10.权利要求1的方法，其中所述生物样品包括上皮细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述生物样品包括PRC和PIN细胞之一或二者。
12.权利要求8的方法，其中所述生物样品包括来自PRC或PIN的上皮细胞。
13.一种PRC参照表达谱，包括选自PRC 1-295组成的组的两个或更多个基因的基因表达模式。
14.一种PRC参照表达谱，包括选自PRC 1-88组成的组的两个或更多个基因的基因表达模式。
15.一种PRC参照表达谱，包括选自PRC 89-295组成的组的两个或更多个基因的基因表达模式。
16.一种筛选治疗或预防PRC和PIN之一或二者的化合物的方法，所述方法包括步骤a)测试化合物接触选自PRC 1-295组成的组的核酸所编码的多肽；b)检测该多肽和测试化合物之间的结合活性；和c)选择结合该多肽的化合物。
17.一种筛选治疗或预防PRC和PIN之一或二者的化合物的方法，所述方法包括步骤a)候选化合物接触表达一个或多个标志基因的细胞，其中一个或多个标志基因选自PRC 1-295组成的组；和b)选择降低选自PRC 1-88组成的组的一个或多个标志基因的表达水平的化合物，或提高选自PRC 89-295组成的组的一个或多个标志基因的表达水平的化合物。
18.一种筛选治疗或预防PRC和PIN之一或二者的化合物的方法，所述方法包括步骤a)测试化合物接触选自PRC 1-295组成的组的核酸所编码的多肽；b)检测步骤a)的多肽的生物活性；和c)选择与不存在测试化合物时检测的生物活性相比，抑制选自PRC1-88组成的组的核酸所编码多肽的生物活性的化合物，或与不存在测试化合物时检测的生物活性相比，提高选自PRC 89-295组成的组的核酸所编码多肽的生物活性的化合物。
19.权利要求17的方法，其中所述生物样品包括PRC和PIN细胞之一或二者。
20.一种筛选治疗或预防PRC和PIN之一或二者的化合物的方法，所述方法包括步骤a)候选化合物接触细胞，该细胞中已经导入了包含一个或多个标志基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因的载体，其中一个或多个标志基因选自PRC 1-295组成的组；b)测定所述报道基因的活性；和c)选择当与对照相比，所述标志基因是选自PRC 1-88组成的组的上调标志基因时，降低所述报道基因表达水平的化合物，或当与对照相比，所述标志基因是选自PRC 89-295组成的组的下调标志基因时，提高所述报道基因表达水平的化合物。
21.一种试剂盒，包括结合选自PRC 1-295组成的组的两个或更多核酸序列的检测试剂。
22.一种阵列，包括结合选自PRC 1-295组成的组的两个或更多核酸序列的核酸。
23.一种治疗或预防受试者PRC和PIN之一或二者的方法，包括给所述受试者施用降低选自PRC 1-88组成的组的基因所编码多肽的表达或活性的化合物的步骤。
24.一种治疗或预防受试者PRC和PIN之一或二者的方法，包括给所述受试者施用反义核酸组合物，所述组合物包括与选自PRC 1-88组成的组的编码序列互补的核苷酸序列。
25.一种治疗或预防受试者PRC和PIN之一或二者的方法，包括给所述受试者施用siRNA组合物，其中所述组合物降低选自PRC 1-88组成的组的核酸序列的表达。
26.一种治疗或预防受试者PRC和PIN之一或二者的方法，包括给所述受试者施用药物有效量的结合选自PRC 1-88组成的组的任何一个基因所编码蛋白的抗体或其片段的步骤。
27.一种治疗或预防受试者PRC和PIN之一或二者的方法，包括给所述受试者施用包含选自PRC 1-88组成的组的核酸所编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或编码该多肽的多核苷酸的疫苗。
28.一种治疗或预防受试者PRC和PIN之一或二者的方法，包括给所述受试者施用增加PRC 89-295的表达或活性的化合物。
29.一种治疗或预防受试者PRC和PIN之一或二者的方法，包括给所述受试者施用药物有效量的PRC 89-295组成的组的多核苷酸，或由其编码的多肽。
30.一种治疗或预防受试者PRC和PIN之一或二者的方法，所述方法包括给予用根据权利要求16-20任一项的方法获得的化合物的步骤。
31.一种治疗或预防PRC和PIN之一或二者的组合物，所述组合物包含药物有效量的对抗选自PRC 1-88组成的组的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA作为活性成分，和药学可接受载体。
32.一种治疗或预防受试者PRC和PIN之一或二者的组合物，所述组合物包含药物有效量的结合选自PRC 1-88组成的组的任何一个基因所编码蛋白的抗体或其片段作为活性成分，和药学可接受载体。
33.一种治疗或预防PRC和PIN之一或二者的组合物，所述组合物包含药物有效量的选自PRC 89-295组成的组的多核苷酸，或由其编码的多肽作为活性成分，和药学可接受载体。
34.一种治疗或预防PRC和PIN之一或二者的组合物，所述组合物包含药物有效量的用权利要求16-20任一项的方法所选择的化合物作为活性成分，和药学可接受载体。
35.一种诊断受试者PRC或发生PRC的倾向性的方法，包括确定来源于患者的生物样品中PRC相关基因的表达水平，其中与所述基因的正常对照水平相比，所述水平的增加或降低表明所述受试者罹患或存在发生PRC的风险。
36.权利要求35的方法，其中所述PRC相关基因选自由PRC 296-321组成的组，其中与正常对照水平相比，所述水平增加表明所述受试者罹患或存在发生PRC的风险。
37.权利要求36的方法，其中所述增加是比所述正常对照水平高至少10％。
38.权利要求35的方法，其中所述PRC相关基因选自由PRC 322-457组成的组，其中与正常对照水平相比，所述水平降低表明所述受试者罹患或存在发生PRC的风险。
39.权利要求38的方法，其中所述降低是比所述正常对照水平降低至少10％。
40.权利要求35的方法，其中所述方法进一步包括确定多元PRC相关基因的所述表达水平。
41.权利要求35的方法，其中用选自(a)检测PRC相关基因的mRNA，(b)检测PRC相关基因编码的蛋白，和(c)检测PRC相关基因编码的蛋白的生物活性所组成的组的任何一个方法确定表达水平。
42.权利要求35的方法，其中通过检测PRC相关基因探针与所述来源于患者的生物样品中的基因转录物的杂交来确定所述表达水平。
43.权利要求42的方法，其中所述杂交步骤是在DNA阵列上进行。
44.权利要求35的方法，其中所述生物样品包括上皮细胞。
45.权利要求35的方法，其中所述生物样品包括PRC细胞。
46.权利要求42的方法，其中所述生物样品包括来自PRC的上皮细胞。
47.一种PRC参照表达谱，包括选自PRC 296-457组成的组的两个或更多基因的基因表达模式。
48.一种PRC参照表达谱，包括选自PRC 296-321组成的组的两个或更多基因的基因表达模式。
49.一种PRC参照表达谱，包括选自PRC 322-457组成的组的两个或更多基因的基因表达模式。
50.一种筛选治疗或预防PRC的化合物的方法，所述方法包括步骤a)测试化合物接触选自PRC 296-457组成的组的核酸所编码的多肽；b)检测该多肽和测试化合物之间的结合活性；和c)选择结合该多肽的化合物。
51.一种筛选治疗或预防PRC的化合物的方法，所述方法包括步骤a)候选化合物接触表达一个或多个标志基因的细胞，其中一个或多个标志基因选自PRC 296-457组成的组；和b)选择降低选自PRC 296-321组成的组的一个或多个标志基因的表达水平的化合物，或提高选自PRC 322-457组成的组的一个或多个标志基因的表达水平的化合物。
52.一种筛选治疗或预防PRC的化合物的方法，所述方法包括步骤a)测试化合物接触选自PRC 296-457组成的组的核酸所编码的多肽；b)检测步骤a)的多肽的生物活性；和c)选择与不存在测试化合物时检测的生物活性相比，抑制选自PRC296-321组成的组的核酸所编码多肽的生物活性的化合物，或与不存在测试化合物时检测的生物活性相比，提高选自PRC 322-457组成的组的核酸所编码多肽的生物活性的化合物。
53.权利要求51的方法，其中所述生物样品包括PRC细胞。
54.一种筛选治疗或预防PRC的化合物的方法，所述方法包括步骤a)候选化合物接触细胞，该细胞中已经导入了包含一个或多个标志基因的转录调节区和在转录调节区控制下表达的报道基因的载体，其中一个或多个标志基因选自PRC 296-457组成的组。b)测定所述报道基因的活性；和c)选择当与对照相比，所述标志基因是选自PRC 296-321组成的组的上调标志基因时，降低所述报道基因表达水平的化合物，或当与对照相比，所述标志基因是选自PRC 322-457组成的组的下调标志基因时，提高所述报道基因表达水平的化合物。
55.一种试剂盒，包括结合选自PRC 296-457组成的组的两个或更多核酸序列的检测试剂。
56.一种阵列，包括结合选自PRC 296-457组成的组的两个或更多核酸序列的核酸。
57.一种治疗或预防受试者PRC的方法，包括给所述受试者施用降低选自PRC 296-321组成的组的基因所编码多肽的表达或活性的化合物的步骤。
58.一种治疗或预防受试者PRC的方法，包括给所述受试者施用反义组合物，所述组合物包括与选自PRC 296-321组成的组的编码序列互补的核苷酸序列。
59.一种治疗或预防受试者PRC的方法，包括给所述受试者施用siRNA组合物，其中所述组合物降低选自PRC 296-321组成的组的核酸序列的表达。
60.一种治疗或预防受试者PRC的方法，包括给所述受试者施用药物有效量的结合选自PRC 296-321组成的组的任何一个基因所编码蛋白的抗体或其片段的步骤。
61.一种治疗或预防受试者PRC的方法，包括给所述受试者施用包含选自PRC 296-321组成的组的核酸所编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或编码该多肽的多核苷酸的疫苗。
62.一种治疗或预防受试者PRC的方法，包括给所述受试者施用增加PRC 322-457的表达或活性的化合物。
63.一种治疗或预防受试者PRC的方法，包括给所述受试者施用药物有效量的PRC 322-457组成的组的多核苷酸，或由其编码的多肽。
64.一种治疗或预防受试者PRC的方法，所述方法包括给予根据权利要求50-54任一项的方法获得的化合物的步骤。
65.一种治疗或预防PRC的组合物，所述组合物包含药物有效量的对抗选自PRC 296-321组成的组的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA作为活性成分，和药学可接受载体。
66.一种治疗或预防受试者PRC的组合物，所述组合物包含药物有效量的结合选自PRC 296-321组成的组的任何一个基因所编码蛋白的抗体或其片段作为活性成分，和药学可接受载体。
67.一种治疗或预防PRC的组合物，所述组合物包含药物有效量的选自PRC 322-457组成的组的多核苷酸，或由其编码的多肽作为活性成分，和药学可接受载体。
68.一种治疗或预防PRC的组合物，所述组合物包含药物有效量的用权利要求50-54任一项的方法所选择的化合物作为活性成分，和药学可接受载体。
69.一种诊断受试者PIN或发生PIN的倾向性的方法，包括确定来源于患者的生物样品中PRC相关基因的表达水平，其中与所述基因的正常对照水平相比，所述水平的增加或降低表明所述受试者罹患或存在发生PIN的风险。
70.权利要求69的方法，其中所述PRC相关基因选自由PRC 458-537组成的组，其中与正常对照水平相比，所述水平增加表明所述受试者罹患或存在发生PIN的风险。
71.权利要求70的方法，其中所述增加是比所述正常对照水平高至少10％。
72.权利要求69的方法，其中所述PRC相关基因选自由PRC 538-692组成的组，其中与正常对照水平相比，所述水平降低表明所述受试者罹患或存在发生PIN的风险。
73.权利要求72的方法，其中所述降低是比所述正常对照水平降低至少10％。
74.权利要求69的方法，其中所述方法进一步包括确定多元PRC相关基因的所述表达水平。
75.权利要求69的方法，其中用选自(a)检测PRC相关基因的mRNA，(b)检测PRC相关基因编码的蛋白，和(c)检测PRC相关基因编码的蛋白的生物活性所组成的组的任何一个方法确定表达水平。
76.权利要求69的方法，其中通过检测PRC相关基因探针与所述来源于患者的生物样品中的基因转录物的杂交来确定所述表达水平。
77.权利要求76的方法，其中所述杂交步骤是在DNA阵列上进行。
78.权利要求69的方法，其中所述生物样品包括上皮细胞。
79.权利要求69的方法，其中所述生物样品包括PIN细胞。
80.权利要求76的方法，其中所述生物样品包括来自PIN的上皮细胞。
81.一种PRC参照表达谱，包括选自PRC 458-692组成的组的两个或更多基因的基因表达模式。
82.一种PRC参照表达谱，包括选自PRC 458-537组成的组的两个或更多基因的基因表达模式。
83.一种PRC参照表达谱，包括选自PRC 538-692组成的组的两个或更多基因的基因表达模式。
84.一种筛选治疗或预防PIN或预防PRC的化合物的方法，所述方法包括步骤a)测试化合物接触选自PRC 458-692组成的组的核酸所编码的多肽；b)检测该多肽和测试化合物之间的结合活性；和c)选择结合该多肽的化合物。
85.一种筛选治疗或预防PIN或预防PRC的化合物的方法，所述方法包括步骤a)候选化合物接触表达一个或多个标志基因的细胞，其中一个或多个标志基因选自PRC 458-692组成的组；和b)选择降低选自PRC 458-537组成的组的一个或多个标志基因的表达水平的化合物，或提高选自PRC 538-692组成的组的一个或多个标志基因的表达水平的化合物。
86.一种筛选治疗或预防PIN或预防PRC的化合物的方法，所述方法包括步骤a)测试化合物接触选自PRC 458-692组成的组的核酸所编码的多肽。b)检测步骤a)的多肽的生物活性；和c)选择与不存在测试化合物时检测的生物活性相比，抑制选自PRC458-537组成的组的核酸所编码多肽的生物活性的化合物，或与不存在测试化合物时检测的生物活性相比，提高选自PRC 538-692组成的组的核酸所编码多肽的生物活性的化合物。
87.权利要求85的方法，其中所述生物样品包括PIN细胞。
88.一种筛选治疗或预防PIN或预防PRC的化合物的方法，所述方法包括步骤a)候选化合物接触细胞，该细胞中已经导入了包含一个或多个标志基因的转录调节区和在转录调节区控制下表达的报道基因的载体，其中一个或多个标志基因选自PRC 458-692组成的组；b)测定所述报道基因的活性；和c)选择当与对照相比，所述标志基因是选自PRC 458-537组成的组的上调标志基因时，降低所述报道基因表达水平的化合物，或当与对照相比，所述标志基因是选自PRC 538-692组成的组的下调标志基因时，提高所述报道基因表达水平的化合物。
89.一种试剂盒，包括结合选自PRC 458-692组成的组的两个或更多核酸序列的检测试剂。
90.一种阵列，包括结合选自PRC 458-692组成的组的两个或更多核酸序列的核酸。
91.一种治疗或预防受试者PIN或预防PRC的方法，包括给所述受试者施用降低选自PRC 458-537组成的组的基因所编码多肽的表达或活性的化合物的步骤。
92.一种治疗或预防受试者PIN或预防PRC的方法，包括给所述受试者施用反义组合物，所述组合物包括与选自PRC 458-537组成的组的编码序列互补的核苷酸序列。
93.一种治疗或预防受试者PIN或预防的方法，包括给所述受试者施用siRNA组合物，其中所述组合物降低选自PRC 458-537组成的组的核酸序列的表达。
94.一种治疗或预防受试者PIN或预防PRC的方法，包括给所述受试者施用药物有效量的结合选自PRC 458-537组成的组的任何一个基因所编码蛋白的抗体或其片段的步骤。
95.一种治疗或预防受试者PIN或预防PRC的方法，包括给所述受试者施用包含选自PRC 458-537组成的组的核酸所编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或编码该多肽的多核苷酸的疫苗。
96.一种治疗或预防受试者PIN或预防PRC的方法，包括给所述受试者施用增加PRC 538-692的表达或活性的化合物。
97.一种治疗或预防受试者PIN或预防PRC的方法，包括给所述受试者施用药物有效量的PRC 538-692组成的组的多核苷酸，或由其编码的多肽。
98.一种治疗或预防受试者PIN或预防PRC的方法，所述方法包括给予用根据权利要求84-88任一项的方法获得的化合物的步骤。
99.一种治疗或预防PIN或预防PRC的组合物，所述组合物包含药物有效量的对抗选自PRC 458-537组成的组的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA作为活性成分，和药学可接受载体。
100.一种治疗或预防受试者PIN或预防PRC的组合物，所述组合物包含药物有效量的结合选自PRC 458-537组成的组的任何一个基因所编码蛋白的抗体或其片段作为活性成分，和药学可接受载体。
101.一种治疗或预防PIN或预防PRC的组合物，所述组合物包含药物有效量的选自PRC 538-692组成的组的多核苷酸，或由其编码的多肽作为活性成分，和药学可接受载体。
102.一种治疗或预防PIN或预防PRC的组合物，所述组合物包含药物有效量的用权利要求84-88任一项的方法所选择的化合物作为活性成分，和药学可接受载体。
全文摘要
这里描述了检测和诊断前列腺癌(PRC)或前列腺上皮内瘤形成(PIN)的客观方法。在一个实施方案中，该诊断方法包括确定鉴别PRC或PIN和正常细胞的PRC相关基因的表达水平。本发明进一步提供了筛选治疗试剂的方法，该治疗试剂对治疗或预防PRC和PIN之一或二者有用，治疗PRC和PIN之一或二者的方法，和给受试者接种抗PRC和PIN疫苗方法。
文档编号C07K14/47GK1703523SQ0382550
公开日2005年11月30日 申请日期2003年9月22日 优先权日2002年9月30日
发明者中村佑辅, 片桐丰雅, 中川英刀, 中鹤修一 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司, 国立大学法人东京大学