专利名称：一种谷胱甘肽－s－转移酶(gst)蛋白亲和层析介质的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域。
背景技术：
基因工程实践中经常使用融合表达进行目标蛋白质的表达、生产，运用最多的融合蛋白是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。谷胱甘肽-S-转移酶本身在大肠杆菌中表达水平极高，而且可溶性性能非常好，这样就可以使得被融合表达的目标蛋白质表达水平高，而且表达产物的溶解性能好，从而较为有效地避免或解决了重组表达产物包涵体的难度。而且借助于谷胱甘肽-S-转移酶对其底物谷胱甘肽具有较高的特异性亲和性的生化特征和性质，研究人员能够利用谷胱甘肽亲和介质方便地进行GST融合表达产物的分离纯化。然而，目前GST蛋白亲和层析介质的制备技术只有国外一些生物制品大公司掌握，价格昂贵，限制了这一系统的进一步应用，尤其对该表达系统在中国的推广应用，特别是基因工程产业化方面的运用造成了成本和价格的障碍。因此摸索一套成熟的具有实用价值的GST蛋白亲和层析介质的制备方法，大大降低GST亲和介质的成本已成为生物工程制药业及基因工程研究人员的急需。这一点对于国内的生物工程制药业及基因工程研究人员尤为重要，因为国内使用的GST蛋白亲和层析介质全部来源于进口。
发明内容
本发明专利需要解决的问题是建立一套成熟的、具有实用价值的GST蛋白亲和层析介质的制备方法，在保证亲和层析介质具有与国外同类产品相似的亲和性能和容量的基础上，大大降低GST亲和介质的成本，使之完全达到和满足实际应用的需要，为基因工程下游过程中重组GST融合蛋白质的制备和纯化提供一个有效、价廉的亲和层析介质。本发明具有重要的实用意义，尤其是对国内的生物工程制药业及基因工程研究人员具有重要的实用价值。
本发明的技术方案是以谷胱甘肽为亲和手臂，以1，4-丁二醇二缩水甘油醚为活化交联剂。首先进行1，4-丁二醇二缩水甘油醚对层析介质的活化反应，然后对活化后的层析介质进行充分洗涤；然后再加入谷胱甘肽进行偶联反应，再进行反应中止和进一步的洗涤。用制备好的GST蛋白亲和层析介质进行分离含有GST蛋白的特异性吸附和分离纯化性能的测试，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和蛋白质定量分析方法分析GST蛋白亲和层析介质纯化蛋白质的纯度和吸附容量。
本发明对GST蛋白亲和层析介质制备方法进行了一系列摸索和优化研究，其研究和实施方案如下1.GST蛋白亲和层析介质制备方法的摸索和优化以Sepharose 4B为介质，谷胱甘肽为亲和手臂，分别研究和优化以1，4-丁二醇二缩水甘油醚或环氧氯丙烷为活化交联剂，在不同反应条件下，例如活化剂的选择，活化反应时间，活化反应温度，活化剂与层析介质用量的比例，活化反应的pH值，偶联反应的时间等，制备谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和介质。
2.GST及含有GST结构域的融合蛋白的分离纯化将上述制备的GST蛋白亲和层析介质装层析柱。在大肠杆菌中高效表达GST及GST融合蛋白后，经离心、裂解细胞等处理，将裂解上清用上述制备的GST蛋白亲和层析介质做成的亲和层析柱进行靶蛋白的分离纯化，用1mmol谷胱甘肽(pH8.0)洗脱，得到含靶蛋白的洗脱液，纯化得到的含靶蛋白的洗脱液直接进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
3.GST蛋白亲和层析介质的性能测试GST蛋白洗脱液用经典的Bradford法测定其蛋白质浓度，计算每毫升柱体积亲和层析介质吸附GST及含有GST结构域的融合蛋白量。
本发明的特色是我们以1，4-丁二醇二缩水甘油醚为活化剂，尝试改变了合成反应中的不同参数和条件，反应制备了谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和介质，并对其性能进行比较，从中我们确定GST亲和介质的最佳合成条件。最近，彭方等人报道，用环氧氯丙烷为活化剂，在适当的条件下可以制得效果良好的GST融合蛋白亲和层析介质(彭方、杨锐、李文鑫，生物化学与生物物理进展，2002，29362)。因此，我们还比较了分别用1，4-丁二醇二缩水甘油醚和环氧氯丙烷为活化剂制备的亲和介质吸附GST的效率，发现在相同条件下，用1，4-丁二醇二缩水甘油醚制备的亲和介质的吸附量远大于用环氧氯丙烷为活化试剂所制备的亲和介质。
本发明专利同已有的商业化的GST亲和介质不同之处在于本发明研究制备的GST亲和层析介质分离GST蛋白和含有GST结构域的融合蛋白的性能是比较好的，其亲和性能和容量与相应商品化介质的性能相近。但国外生物公司的商品化GST亲和层析介质价格为$184/10ml，约￥180元/ml，本文报道的GST亲和层析介质成本仅为￥7～8元/ml，降低了二十倍之多。因此，本发明的技术将极大地降低GST融合表达体系的实用成本，值得在基因工程和分子生物学等研究领域推广。
四
图1.不同合成反应参数对谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和介质亲和吸附能力的影响。
a.活化时间；b.活化温度；c.1，4-丁二醇二缩水甘油醚用量；d.反应的pH；e.反应时间；f.不同连接化合物比较1，4-丁二醇二缩水甘油醚和环氧氯丙烷。
图2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析GST蛋白及其纯化结果1.分子量标准蛋白质；2.表达GST的大肠杆菌细胞菌体总蛋白；3.表达GST的大肠杆菌细胞裂解后的沉淀部分；4.表达GST的大肠杆菌细胞裂解后的上清部分；5.GST亲和介质柱层析的穿过组分；6.GST亲和介质柱层析的洗脱组分。
图3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析GST-FADD蛋白及其纯化结果1.分子量标准蛋白质；2.表达GST-FADD蛋白的大肠杆菌细胞裂解后的上清部分；
3.GST亲和介质柱层析的穿过组分；4.GST亲和介质柱层析的洗脱组分。
五具体实施例方式1.介质的活化取10ml Sepharose 4B于G-3漏斗中抽去保护液，用100ml0.5mol/L NaCl溶液淋洗，再用100ml蒸馏水洗4次，转移到100ml锥形瓶内。加7ml 1mol/l NaOH溶液(内含NaBH4 2mg/ml)，少量1，4-丁二醇二缩水甘油醚，缓慢震荡反应。
2.洗涤滤干溶液，用蒸馏水充分洗涤至pH7.0左右，再用20ml 0.1mol/LpH9.5 NaHCO3-Na2CO3缓冲液淋洗，抽干备用。
3.偶联反应加入磷酸缓冲液20ml，谷胱甘肽溶液10ml(0.5g还原型谷胱甘肽溶于水中，用KOH调pH至7.0，定容至10ml)，37℃振摇。
4.偶联反应后处理滤干溶液，用100ml蒸馏水洗涤，加入100ml 1mol/L乙醇胺终止反应。再分别用100ml磷酸缓冲液、乙酸钠溶液(0.1mol/L乙酸钠，0.5mol/L氯化钠，pH4.5)、Tris-HCl溶液(0.1mol/L Tris，0.5mol/L氯化钠，pH8.0)、磷酸缓冲液分别淋洗，重复一次。加入10ml磷酸缓冲液于4℃保存。
5.亲和介质合成条件的优化分析按照图1中的说明改变亲和介质合成条件，制备GST蛋白亲和层析介质。测定其吸附容量并进行比较。
6.GST蛋白亲和层析介质用于分离含有GST结构域的蛋白质的性能测试pTORG(中国发明专利申请号01127171.X)在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达GST蛋白后，经离心、裂解细胞等处理，将裂解上清用上述制备的GST蛋白亲和层析介质做成的亲和层析柱进行靶蛋白的分离纯化，纯化得到的含靶蛋白的洗脱液直接进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
7.亲和介质用于分离GST-FADD融合蛋白的性能测试同6.进行GST-FADD融合蛋白的表达和纯化，并进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
8.亲和介质吸附容量的定量分析GST蛋白洗脱液用Bradford检测法测其蛋白质浓度，计算每毫升柱体积的蛋白质吸附量。
通过比较，我们可以确定，最佳合成条件为用1，4-丁二醇二缩水甘油醚为活化试剂，10ml sepharose 4B介质体系中，加入2ml 1，4-丁二醇二缩水甘油醚于37℃下活化5小时。洗涤后于pH7.4的磷酸缓冲液中与谷胱甘肽反应24小时。该条件下制备的亲和介质每毫升吸附GST蛋白4.2-6mg，远大于用环氧氯丙烷为活化试剂所制备的亲和介质。Pharmacia公司相应产品GSH-Sepharose 4B的吸附能力为每毫升亲和介质吸附GST蛋白5mg。本研究制备的GST亲和层析介质与相应商品化介质性能相近，反应条件温和可控，比较合适。其价格比国外公司的同类商品降低了二十倍之多。由于目前商品GST亲和介质的昂贵价格和在生物化学和分子生物学、生物工程、生物工程制药产业研究与开发中的广泛应用，本发明研制的GST亲和介质的合成工艺和方法具有广阔的实用前景。
权利要求
1.一种GST亲和层析介质的制备方法，其特征是以1，4-丁二醇二缩水甘油醚为活化剂，合成偶联有谷胱甘肽的亲和层析介质。
2.根据权利要求1所述的GST亲和层析介质的制备方法，其特征是以1，4-丁二醇二缩水甘油醚为活化剂。
3.根据权利要求1所述的GST亲和层析介质的制备方法，其特征是1，4-丁二醇二缩水甘油醚的活化反应时间为2-5小时。
4.根据权利要求1所述的GST亲和层析介质的制备方法，其特征是1，4-丁二醇二缩水甘油醚的活化反应温度为28-37℃。
5.根据权利要求1所述的GST亲和层析介质的制备方法，其特征是1，4-丁二醇二缩水甘油醚∶层析介质的体积比为2-7∶10。
6.根据权利要求1所述的GST亲和层析介质的制备方法，其特征是1，4-丁二醇二缩水甘油醚活化反应的pH值为7.4-9.5。
7.根据权利要求1所述的GST亲和层析介质的制备方法，其特征是谷胱甘肽的偶联反应时间为24-72小时。
8.根据权利要求1所述的GST亲和层析介质的制备方法制备获得的GST亲和层析介质的应用是作为亲和层析介质，用于含有分离纯化GST和含有GST结构域的蛋白质，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域。本发明以谷胱甘肽为亲和手臂，以1，4－丁二醇二缩水甘油醚为活化交联剂。通过对层析介质的活化、洗涤、谷胱甘肽偶联反应、反应中止和洗涤，制备了GST蛋白亲和层析介质。对制备条件和工艺进行了优化。用制备好的GST蛋白亲和层析介质进行分离含有GST蛋白的特异性吸附和分离纯化性能的测试，用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和蛋白质定量分析方法分析GST蛋白亲和层析介质纯化蛋白质的纯度和吸附容量。结果表明用本发明方法制得的亲和介质具有很高的特异性和纯化效率，其亲和吸附能力远高于用环氧氯丙烷为活化剂制备的亲和介质，与相应国外商品化介质的性能相近，具有高效、价廉的特点，能够作为亲和层析介质用于GST及GST融合蛋白质的分离纯化，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究，在生物工程领域具有良好的实用前景。
文档编号C07K1/14GK1715403SQ20041004115
公开日2006年1月4日 申请日期2004年7月2日 优先权日2004年7月2日
发明者华子春 申请人:华子春