专利名称：用作免疫调节剂和抗癌药的卤代雷公藤内酯醇衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用作免疫抑制剂、抗炎剂和抗癌药的化合物。
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背景技术：
免疫抑制剂广泛地用于治疗自身免疫性疾病以及用于治疗或预防移植物排斥，包括治疗移植物抗宿主疾病(GVHD)。常见的免疫抑制剂包含硫唑嘌呤、皮质类固醇、环磷酰胺、氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、长春新碱和环孢霉素A。总的来说，这些药品中没有一种是完全有效的，并且大多数受到严重毒性的限制。例如，广泛使用的环孢霉素A对肾具有明显的毒性。此外，进行有效治疗所需的剂量可能会使患者对各种机会性入侵物感染的敏感性增加。
已经鉴定出从中药植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)(TW)中衍生的许多化合物具有免疫抑制活性，例如，可用于治疗自身免疫性疾病和用于治疗或预防移植物排斥，包括治疗移植物抗宿主疾病(GVHD)。也有报道说雷公藤内酯醇和某些衍生物及其前药显示出抗癌活性。例如参见Kupchan et al.，1972，1977，以及共有的美国专利6,620,843(2003年9月)，它们作为参考并入本文。
一般情况下，发现雷公藤内酯醇衍生物本身的生物活性小于天然的雷公藤内酯醇。然而，相对于天然的雷公藤内酯醇，这些化合物在诸如药物动力学或生物分布方面往往表现良好，这是由于它们在脂质或水溶性方面的差异和/或作为前药的活性造成的。例如参见，Jung etal.，美国专利5,972,998和6,004,999，Kupchan et al.，美国专利4,005,108，Lipsky et al.，美国专利5,294,443和Qian et al.，美国专利5,430,054，以及共有的美国专利6,150,539(雷公藤内酯醇前药具有很高的水溶性)、5,962,516(免疫抑制化合物和方法)、5,843,452(免疫疗法组合物和方法)、5,759,550(用于抑制异种移植物排斥的方法)、5,663,335(免疫抑制化合物和方法)和5,648,376(免疫抑制的二萜化合物)，以及其中被引用的参考文献。
发明概述一方面，本发明提供了可用于免疫抑制、消炎和抗癌治疗的化合物。这些化合物是以结构式I表示的雷公藤内酯醇衍生物
其中CR1R2选自CHOH、C＝O、CHF、CF2或C(CF3)OH；CR6和CR13选自CH、COH或CF；CR7R8、CR9R10和CR11R12选自CH2、CHOH、C＝O、CHF或CF2；CR3R4R5选自CH3、CH2OH、C＝O、COOH、CH2F、CHF2或CF3；其中在R1-R13中至少有一个包含氟；在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有两个并优选至多有一个包含氟或氧；另外，当CR1R2是CHOH时，CR3R4R5不是CH2F。
优选地，关于CR7R8的立体化学是当CR7R8是CHOH时，具有β-羟基构型，当CR7R8是CHF时，具有α-氟构型。相似地，关于CR9R10的立体化学优选为当CR9R10是CHOH时，具有β-羟基构型，并且当CR9R10是CHF时，具有α-氟构型。
在结构式I的优选实施方案中，CR1R2是CHF，具有α-氟构型。
优选实施方案也包含如下那些化合物，其中选自CR1R2、CR3R4R5、CR6、CR7R8、CRR9R10或CR11R12的碳中心中刚好有一个包含氟。更优选地，在CR1R2、CR6、CR7R8、CR9R10和CR11R12中刚好有一个包含氟。
在可选的实施方案中，只有CR1R2包含氟。相应地，在这些实施例中CR1R2选自CF2、CHF或C(CF3)OH。关于CR1R2的立体化学优选是当CR1R2是C(CF3)OH时，具有β-羟基构型，当CR1R2是CHF时，具有α-氟构型。
在结构式I的其它可选实施方案中，CR9R10或CR3R4R5包含氟，并且CR1R2包含氧；优选CR1R2是C＝O，或者更优选是CHOH(β-羟基)。在这些实施方案中，例如，CR9R10选自CF2或CHF(优选α-氟)，或者CR3R4R5选自CHF2或CF3。
在结构式I进一步选择的实施方案中，CR7R8或CR11R12包含氟，并且CR1R2包含氧；优选CR1R2是C＝O，或者更优选是CHOH(β-羟基)。在这些实施方案中，例如，CR7R8选自CF2或CHF(优选α-氟)，或者CR11R12选自CF2或CHF。
在其它方面，本发明提供了用于影响免疫抑制的方法以及诱导细胞内细胞凋亡的方法，从而可有效地用于抗类风湿性治疗，特别是抗癌治疗。所述方法包括将有效量的、本文所述的具有结构式I的化合物分别给药到需要这种治疗的患者或与所述细胞接触。此外，本发明包括具有结构式I的化合物在制备可影响免疫抑制或可诱导细胞内细胞凋亡药物的用途。典型地，该化合物提供了药学可接受载体。所述方法和用途的特定实施方案可以采用本文描述的关于结构式I的任何特定实施方案。
当结合附图来阅读本发明的下列详细描述时，本发明的上述和其它目的及特征将会变得更加明显。
图1显示出与雷公藤内酯醇(指定为PG490)相比较，本发明化合物14-脱氧-1-α-氟-雷公藤内酯醇(指定为PG763)在Jurkat细胞内的细胞毒素影响(实施例2)；图2显示出与雷公藤内酯醇相比较，本发明化合物(PG763)在Jurkat细胞内对IL-2产物的抑制(实施例4)；图3A-B显示出与雷公藤内酯醇相比较，通过对比化合物14-α-羟基雷公藤内酯醇(即epitriptolide；指定为PG524)和14-β-(甲硫基)甲基雷公藤内酯醇(指定为PG691)在Jurkat细胞内剂量依赖性诱导的细胞凋亡(实施例3)；以及图4A-B显示出与雷公藤内酯醇相比较，通过对比化合物14-α-羟基雷公藤内酯醇(即epitriptolide)和14-β-(甲硫基)甲基雷公藤内酯醇在Jurkat细胞内对IL-2产物的抑制(实施例4)。
发明详述I.雷公藤内酯醇衍生物为了实现本发明公开的目的，使用以下编号方案对雷公藤内酯醇和雷公藤内酯醇衍生物进行编号 如本文进一步描述的，本发明化合物为通过将雷公藤内酯醇C1、C2、C5、C14、C15、C16和/或C19位，优选C2、C14或C16位的一个或多个羟基或氢原子用卤素原子，优选氯或氟，并且最优选氟，进行取代而得到的衍生物。更具体地，本发明化合物用以下结构式I表示 其中CR1R2选自CHOH、C＝O、CHF、CF2或C(CF3)OH；CR6和CR13选自CH、COH或CF；CR7R8、CR9R10和CR11R12选自CH2、CHOH、C＝O、CHF或CF2；CR3R4R5选自CH3、CH2OH、C＝O、COOH、CH2F、CHF2或CF3；其中，在R1-R13中至少有一个包含氟；在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有两个并优选至多有一个包含氟或氧，和；当CR1R2是CHOH时，CR3R4R5不是CH2F。
优选地，关于CR7R8和CR9R10的立体化学是CHOH具有β-羟基构型，CHF具有α-氟构型。
在结构式I的优选实施方案中，CR1R2是CHF(α)。(如本文使用的，符号“CHX(α)”或“CHX(β)”分别表示非氢取代基X具有α或β构型)。更优选地，在这些实施方案中，仅CR1R2包含氟。仍然更优选地，在这些实施方案中，仅CR9R10和/或CR3R4R5包含氧；例如，CR9R10和/或CR3R4R5中的一个或两个，优选一个，是CHOH(对于CR9R10，优选CHOH(β))。可供选择地，在这些实施方案中，CR3R4R5、CR6、R7R8、CR9R10、CR11R12和CR13都不包含氧。
结构式I的优选实施方案也包含这些化合物，它们的选自CR1R2、CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10或CR11R12中的碳中心刚好包含一个氟。更优选地，CR1R2、CR7R8、CR9R10和CR11R12中刚好有一个包含氟。优选地，在这些实施方案中，仅CR9R10和/或CR3R4R5包含氧；例如CR9R10和/或CR3R4R5中的一个或两个，优选一个，是CHOH(对于CR9R10，优选CHOH(β))。可供选择地，在这些实施方案中，CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13都不包含氧。
在结构式I的挑选出来的实施方案中，仅CR1R2包含氟。相应地，CR1R2选自CF2、CHF或C(CF3)OH。优选地，CR1R2的立体化学是C(CF3)OH为C(α-CF3)β-OH，或者CHF为CH(α-F)。
在结构式I的其它可选实施方案中，CR9R10或CR3R4R5包含氟并且CR1R2包含氧；优选CR1R2为C＝O，或者更优选为CHOH(β-羟基)。在这些实施方案中，CR9R10为CF2或CHF(优选α-氟)，CR3R4R5优选为CHF2或CF3。
在结构式I进一步可选择的实施方案中，CR7R8或CR11R12包含氟并且CR1R2包含氧；优选CR1R2为C＝O，或者更优选为CHOH(β-羟基)。在这些实施方案中，CR7R8为CF2或CHF(优选α-氟)，CR11R12为CF2或CHF。
本发明还包括与结构式I的化合物相似的化合物，其中，氟用不同的卤素原子如氯、溴或碘特别是氯取代；例如，14-脱氧-14α-氯雷公藤内酯醇。这种化合物其它可选择的和优选的实施方案对应于以上所描述的具有结构式I的氟代化合物。
A.制备本发明化合物可以从雷公藤内酯醇或其羟基化衍生物制备。后者包括雷公藤羟内酯(2-羟基雷公藤内酯醇)或16-羟基雷公藤内酯醇，它们和雷公藤内酯醇一起，可以从中药植物雷公藤(TW)的根木质部获得或从其它已知来源获得。在中国福建省以及其它华南省份发现了TW植物；TW植物原料通常可在中国得到，或从美国经商业渠道购得。用于获得雷公藤内酯醇、雷公藤羟内酯和16-羟基雷公藤内酯醇的方法为本领域已知的，并且在例如Kupchan et al.(1972，1977)；Lipsky et al.(1994)；Pu et al.(1990)；和Ma et al.(1992)中进行了描述。
雷公藤内酯醇的5-羟基衍生物可以通过二氧化硒氧化雷公藤内酯醇而制得，如在共有的美国临时申请系列号为60/532,702中所描述的。简而言之，在典型的制备方法中，雷公藤内酯醇和约2.2当量的二氧化硒溶在二氧杂环乙烷中，该溶液在约90℃下，N2中搅拌72小时。
如L.Ning et al.(Tetrahedron 59(23)4209-4213，2003)所描述的，用短刺小克银汉霉菌(Cunninghamella blakesleana)培育雷公藤内酯醇得到上述羟基衍生物和1β-羟基雷公藤内酯醇、triptolidenol(15-羟基雷公藤内酯醇)、19α-羟基雷公藤内酯醇和19β-羟基雷公藤内酯醇。采用标准方法分离上述产品，即用乙酸乙酯提取过滤的培养液，浓缩并将残留物进行硅胶色谱。
具有结构式I的化合物可以通过雷公藤内酯醇、其羟基衍生物或其氧化衍生物制备得到，通过将C1、C2、C5、C14、C15、C16和/或C19位上的羟基或含氧基与氟化剂反应，在所述碳上分别形成CHF或CF2基团。
在参考文献如Chemistry of Organic Fluorine CompoundsII(editorsM.Hudlicky和A.E.Pavlath；ACS Monograph 187，1995)和Organofluorine ChemistryPrinciples and Commercial Applications(editorsR.E.Banks，B.E.Smart和J.C.Tatlow；Plenum Press，1994)中对这些氟化剂进行了描述。例如，适合于将羟基(C-OH)转化为C-F的试剂包含HF-胺络合物，如HF-吡啶(Olah′s试剂)或HF-2，4，6-三甲基吡啶、四氟化硫(SF4)和各种SF4衍生物，包括(二乙基氨基)三氟化硫(DAST)、(二甲基氨基)三氟化硫(甲基-DAST)、吗啉啉代三氟化硫(morph-DAST)和[双(2-甲氧基乙基)氨基]三氟化硫(Deoxo-FluorTM)。羟基可以首先转化为离去基团如三氟甲基磺酸根，其随后被亲核氟化物试剂如三(二甲基氨基)硫(三甲硅烷基)二氟化物(TAS-F)、4-正丁基铵二氟三苯基硅酸盐或无机盐如KF、CsF或Bu4NF取代。这些反应通常会发生立体化学转化，如以下说明的。
例如，如在实施例1中所描述的，在C14位具有β-羟基的天然的雷公藤内酯醇，可通过与DAST反应而转化为14-脱氧-1-α-氟雷公藤内酯醇(本文指定为PG763)。可供选择地，epitriptolide(14-α-雷公藤内酯醇，本文指定为对比化合物PG524)可用于制备14-脱氧-14-β-氟雷公藤内酯醇。
类似地，雷公藤羟内酯(在C14和C2位具有β-羟基)可以转化为14-脱氧-2α，14α-二氟雷公藤内酯醇。如果使用有限量的氟化剂，该化合物可作为与-α-氟雷公藤内酯醇的混合物而得到(参见下文)。
16-羟基雷公藤内酯醇与化学计量量的或过量的氟化剂反应生成14-脱氧-14α，16-二氟雷公藤内酯醇，如以下所示。
如以上所列举的，四氟化硫及其衍生物也是最常用的氟化剂，用于将氧代基团(例如醛或酮)转化为偕二氟化物。同样适合的试剂为2，2-二氟-1，3-二甲基咪唑啉(DFI)。
在雷公藤内酯醇C2、C14和/或C16位的氧代基团可通过将一个或多个羟基氧化为酮或醛基而形成。在参考文献如M.Hudlicky，Oxidations in Organic Chemistry(ACS Monograph Series 186，1990)，R.C.Larock，Comprehensive Organic Transformations(第2版，Wiley，1999)，或J.March，Advanced Organic Chemistry(第4版，Wiley，1992)中描述了氧化剂以及适用于选择性氧化醇的方法。应当避免强酸性或强碱性条件。如果需要的，可采用，例如HPLC将所需产品与任何副产品分离。
例如，雷公藤内酯醇C14位的仲醇可采用例如三氧化铬-吡啶络合物、CrO2Cl2/氧化铝或相应的氧化剂，从而氧化为酮(生成已知的化合物雷藤酮)。例如，与DAST反应生成14-脱氧-14，14-二氟雷公藤内酯醇，如下所示。
雷公藤羟内酯的两种仲醇(2-羟基雷公藤内酯醇)也可以均采用所述氧化剂氧化为酮。与DAST或另一种适当的试剂反应生成如下所示的四氟化合物。当所用的试剂量有限时，也可以获得2，2-二氟化合物，如下所示。
可供选择地，在温和的条件下，采用化学计量量的如上指出的氧化剂，可以将雷公藤羟内酯C2位的位阻较小的醇选择性地氧化为酮。为了氧化16-羟基雷公藤内酯醇的仲醇和伯醇，优选采用不会进一步将产物醛氧化的试剂，例如DMSO、氯铬酸吡啶(Corey′试剂)或硝酸铵铈，以生成酮-醛中间体。酮醛与DAST或其它合适的试剂反应生成以下所示的四氟化合物。同样，当氟化剂的用量有限时，也可以获得14-氧-16，16-二氟化合物，如下所示。
采用试剂如RuCl2(PPh3)3、(Me3SiO)2/催化的RuCl2(PPh3)3、DMSO/ClCOCOCl/Et3N或DMSO/吡啶.SO3/i-Pr2NEt(参见上面引用的Larock)，也可以选择性地氧化16-羟基雷公藤内酯醇的伯醇。该醛随后可转化为16，16-二氟雷公藤内酯醇，如下所示。
C16位的伯羟甲基(-CH2OH)也可以通过先氧化为羧酸，然后与SF4反应从而转化为三氟甲基，如以下的反应历程所示
可以在C14位或另外含有仲或伯羟基的中心，例如Cl、C2、C16或C19位，通过先氧化为酮，接着与三氟甲基三甲基硅烷反应，从而引入三氟甲基基团。如以下的反应历程所示 类似的化合物通常可采用类似方法制备，其中，氟用不同的卤素原子取代。将C-OH转化为C-X的方法为本领域已知的，其中X为Cl、Br或I。用于制备氯化物的试剂包括例如SOCl2或PCl5、POCl3等。同样，推荐的路径为将羟基转化为离去基团如甲苯磺酸盐或三氟甲基磺酸根，随后与卤化物试剂反应。例如参见，Larock，ComprehensiveOrganic Transformations(VCH，New York，1989)，p.360。也可以用与SF4类似的方式使用PCl5，以便从醛或酮形成偕二氯化物。
B.生物活性如上所述，雷公藤内酯醇的多种衍生物和类似物为本领域已知的，并且许多是可药用的。相对于天然的雷公藤内酯醇，这些化合物由于在脂质或水中溶解性的变化和/或作为前药等方面的活性，经常可以表现出药物动力学或生物分布等方面的优势。然而，总的来说，这些衍生物和类似物本身的生物活性小于天然的雷公藤内酯醇。
特别是，本领域通常认为在14位，优选14β位，氢供体基团的存在对于维持雷公藤内酯醇衍生物的生物活性是重要的。例如参见本文图3A-B和4A-B中的比较数据。如图3A和4A所示，14-α-雷公藤内酯醇在C14位具有α-羟基立体化学，同时具有免疫抑制和细胞凋亡活性，其活性明显弱于雷公藤内酯醇(在免疫抑制分析中，功效大约小30倍；在细胞凋亡分析中，功效小25倍)。在C14位具有14β立体化学并具有负电取代基但不是氢供体基团的化合物中，即14β-(甲硫基)甲基雷公藤内酯醇，可以看到相对于雷公藤内酯醇，生物活性下降较大(图3B和4B)(在免疫抑制分析中，大约小60倍；在细胞凋亡分析中，小40倍)。
因此，鉴于本领域的现状，本发明的14-脱氧-14α-氟化合物(PG763)所具有的非常高的生物活性是惊人的，由于其在14位缺少氢供体基团。如图1-2所示，在评估细胞毒性和IL-2抑制性的分析中，PG763的活性近似等同于雷公藤内酯醇。
因此，14-脱氧-14α-氟化合物为本文公开的结构式I特别优选的实施方案。在特定的实施方案中，化合物为PG763。
II.治疗组合物含有本发明雷公藤内酯醇衍生物的制剂可采用固体、半固体、冻干粉形式，液体剂型，如片剂、胶囊、粉末、持续释放的制剂、溶液、悬浮液、乳浊液、软膏、洗液或气溶胶，优选适用于准确剂量、简单给药的单位剂型。典型地，该组合物包含常规的药学载体或赋形剂，并且还可以包含其它药剂、载体或辅剂。
优选地，该组合物含有约0.5％-75重量％的一种或多种本发明化合物，其余由适当的可药用赋形剂组成。对于口服给药来说，赋形剂包含药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁及其它类似物。如果需要，该组合物还可以含有少量的无毒助剂物质，例如润湿剂、乳化剂或缓冲剂。
该组合物可以经口服、透皮或经非肠道给药到患者，例如，通过静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射。以口服液体制剂使用，可以将该组合物制成溶液、悬浮液、乳液或糖浆，以液体形式或适用于在水或生理盐水中水合的干燥形式给药。对于非肠道给药来说，可注射的非肠道给药组合物典型地含有溶解在适当的静脉注射溶液，例如无菌生理盐水溶液中的雷公藤内酯醇衍生物。
通过将雷公藤内酯醇衍生物(约0.5％-约20％)以及可选的可药用辅剂溶解或分散在药学可接受的载体，例如盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油或乙醇中，形成溶液或悬浮液来制备液体组合物。
该化合物也可以通过吸入给药，采用固体或液体气溶胶颗粒的形式，优选具有可吸入的粒度。该颗粒小到一经吸入即能通过口和喉进入支气管和肺泡。通常，可吸入的粒度为约1-10微米，优选小于约5微米。吸入给药的液体组合物含有分散在含水载体，例如无菌无致热物的盐水溶液或无菌无致热物的水中的活性物质。如果需要，该组合物可以与推进物混合以有助于该组合物的喷雾并形成气溶胶。
制备该剂型的方法是已知的，或者对于本领域技术人员来说是显而易见的；例如参见Remington′s Pharmaceutical Sciences(第19版，Williams & Wilkins，1995)。该给药组合物含有一定有效量的所选化合物，用于影响患者的免疫抑制或靶细胞中的细胞凋亡。
如Panchagnula et al.(2000)所描述的，药学试剂的分配系数或logP可影响其对于各种给药途径的适宜性，包含口服生物利用度。本文描述的化合物通过用氟取代了一个或多个羟基，预期具有比母化合物雷公藤内酯醇更高的logP计算值，从而使它们成为口服利用度更好的候选药物。
III.免疫调节和抗炎治疗如图2所示，具有结构式I的化合物，14-脱氧-1-α-氟雷公藤内酯醇(指定为PG763)，在Jurkat细胞内以剂量依赖性方式抑制IL-2产物(参见实施例4)，其使用的浓度相当于采用雷公藤内酯醇进行的类似分析。因此，本发明包含本发明化合物作为免疫抑制剂的用途，例如辅助用于移植操作或用于自身免疫性疾病的治疗中。
已表明，免疫调节异常存在于多种自身免疫和慢性发炎疾病中，包含全身红斑狼疮、慢性风湿性关节炎、I和II型糖尿病、肠炎、胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、多发性硬化和其它紊乱如克隆病、溃疡性结肠炎、类天疱疮、类肉状瘤病、牛皮癣、鱼鳞癣、格雷夫斯眼病和哮喘。尽管这些症状的潜在发病机理可以明显不同，但它们都具有相同的多种自身抗体和自反应淋巴细胞表现。这种自反应可能部分是由于丧失了体内平衡控制，正常免疫系统在该平衡下运行。
类似地，在从含有成熟淋巴细胞的供体组织源进行骨髓移植或其它造血干细胞移植之后，转移的淋巴细胞将宿主组织抗原识别为外来的。这些细胞变为激活的并对宿主发起可能是致命的进攻(移植物对宿主反应)。此外，器官移植后，宿主淋巴细胞识别器官移植物的外来组织抗原并发动细胞内抗体介导的免疫反应(宿主对移植物反应)，导致移植物受损和排斥。
自身免疫或排斥反应的一种结果就是由发炎细胞及其释放的介体所引起的组织受损。抗炎剂如NSAID主要通过阻断这些介体的影响或分泌而起作用，但不改变疾病的免疫学基础。另一方面，细胞毒素剂，如环磷酰胺以同时阻断正常的和自身免疫反应的非特异性方式起作用。实际上，采用这种非特异性免疫抑制剂治疗的病人，正如他们会死于自身免疫性疾病一样，有可能死于感染。
本发明组合物可用于已证明雷公藤内酯醇及其前药和其它衍生物是有效的那些应用中，例如用于免疫抑制治疗如治疗自身免疫性疾病、预防移植物排斥、治疗或预防移植物抗宿主疾病(GVHD)。例如参见共有的美国专利6,150,539，其作为参考并入本文。雷公藤内酯醇以及本文的衍生物也有效地用于治疗其它炎性疾病例如创伤炎症和男性生育力下降。
该组合物可用于抑制实质器官移植物、组织移植物或来自相互排斥的人供体的细胞移植物的排斥，从而延长了移植物的生存时间和功能，以及受体的生存时间。这种用途将包括，但并非局限于，实质器官移植物(如心脏、肾和肝脏)、组织移植物(如皮肤、肠、胰腺、生殖腺、骨和软骨)和细胞移植物(如来自胰腺、脑和神经组织、肌肉、皮肤、骨、软骨和肝脏的细胞)。
该组合物也有效地用于抑制异种移植物(种间)排斥，即预防来自非人动物的实质器官移植物、组织移植物或细胞移植物的排斥，不论其是在构成上或生物工程上(遗传可控制的)能够表达人基因、RNA、蛋白质、肽或其它非天生的异种分子，或是生物工程上不能表达动物的天生基因、RNA、蛋白质、肽缺乏表达或其它正常表达的分子。本发明也包含如上所述组合物用于延长来自于非人动物的这种实质器官移植物、组织移植物或细胞移植物的生存时间的用途，。
本发明也包括治疗自身免疫性疾病或具有自身免疫表现的疾病的方法，如艾迪生病、自身免疫溶血性贫血、自身免疫甲状腺、克隆病、糖尿病(I型)、格雷夫斯病、吉-巴综合征、全身红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、多发性硬化、重症肌无力、牛皮癣、原发性胆汁性肝硬变、风湿性关节炎和葡萄膜炎、哮喘、动脉硬化症、甲状腺炎、过敏性脑脊髓炎、肾小球肾炎和各种过敏症。
其它用途可以包括治疗和预防发炎和高增生的皮肤疾病以及皮肤表现免疫介导的疾病，如牛皮癣、遗传过敏皮炎、天疱疮、风疹、皮肤嗜酸细胞增多、粉刺和秃头斑；各种眼病，如结膜炎、葡萄膜炎、角膜炎，以及类肉状瘤病；粘液和血管发炎，如胃溃疡、由缺血性疾病和血栓症引起的脉管损伤、缺血性肠病、发炎性肠病和坏死的小肠结肠炎；肠炎/敏感症，如腹腔疾病和溃疡性结肠炎；肾病，如间质肾炎、古德帕斯丘综合征、溶血性尿毒症综合征和糖尿病肾病；造血疾病，如突发性血小板减少紫癜和自身免疫溶血性贫血；皮肤病，如皮肌炎和皮肤T细胞淋巴瘤；血循环疾病，如动脉硬化和动脉硬化症；肾病，如缺血性急性肾机能不全和慢性肾机能不全；和贝赫切特病。
本发明的组合物和方法也有效地用于治疗炎症，如具有内源性和外源性表现的哮喘，例如，支气管哮喘、过敏性哮喘、内源性哮喘、外源性哮喘和灰尘哮喘，特别是慢性或习惯性哮喘(例如，晚年哮喘和气道高度响应)。所述组合物和方法也可以用于治疗其它炎性病症，包含外伤性发炎、莱姆关节炎疾病中的发炎、慢性支气管炎(慢性传染性肺病)、慢性窦炎与急性呼吸窘迫综合征相关的脓毒病和肺部类肉状瘤病。对于治疗呼吸症状如哮喘，所述组合物优选通过吸入给药，但任何常规的给药途径也是可用的。
在治疗自身免疫症状时，以足以减轻症状并改善患者舒适度的剂量对患者定期给药，例如每周1-2次服用该组合物。特别是对于治疗风湿性关节炎，该组合物可以通过静脉内注射或直接注射入感染的关节中。可以在患者的疾病症状发生后的几周内，以至少24小时的间隔对患者重复治疗。给药剂量范围优选为1-25mg/kg患者体重/天，较低的剂量优选用于非肠道给药，较高的剂量优选经口服给药。按照本领域的已知方法，通过常规试验可以确定最佳剂量。
对于移植物排斥治疗，该方法尤其包含治疗心脏、肾、肝脏、细胞和骨髓移植物的排斥，并且还可用于治疗GVHD。对于急性移植物排斥，治疗通常是在移植手术前不久或手术后不久，在围手术期(perioperatively)开始，并且实施每天给药方案，持续进行至少几周的治疗。在治疗期间，可以通过例如，包含同种移植淋巴细胞的混合淋巴细胞反应或通过对移植组织进行活组织切片检查，定期对患者的免疫抑制水平进行检测。
此外，该组合物还可以通过长期给药来预防移植物排斥或治疗晚期移植物排斥急性发作。如上所述，给药剂量优选为1-25mg/kg患者体重/天，较低的剂量优选经非肠道给药，较高的剂量优选经口服给药。根据患者的反应以及治疗期间患者抵抗感染的能力，该剂量可以适当增加或减少。
在治疗或预防源于向匹配的或不匹配的骨髓、脾细胞、胎组织、脐带血或固定的或其它采集的干细胞受体移植引起的移植物抗宿主疾病时，该疾病剂量优选0.25-2mg/kg体重/天，并优选0.5-1mg/kg/天，经口服或经非肠道给药。
本发明的范围也包含具有结构式I的化合物和一个或多个常规的免疫抑制剂的结合治疗。处于本发明范围内的这些免疫抑制剂包含，但不局限于，IMUREK(硫唑嘌呤钠)、brequinar钠、SPANIDIN(gusperimus三盐酸化物，也称脱氧精液蛋白)、mizoribine(也称布雷青霉素)、细胞CEPT(mycophenolate mofetil)、NEORAL(环孢霉素A；市场上以商标为SANDIMMUNE的不同制剂销售)、PROGRAF(血流谱，也称FK-506)，RAPIMMUNE(sirolimus，也称雷帕霉素)、leflunomide(也称HWA-486)、ZENAPAX、肾上腺皮质激素，如氢化泼尼松及其衍生物；抗体如正交克隆(OKT3)，和antithymyocyte球蛋白如胸腺球蛋白。当与另一种用于如上所述免疫抑制治疗的免疫抑制药物同时给药时，该化合物还可有效地用作增强剂。因此，可以以远远低于单独给药该化合物时的量对上述常规的免疫抑制药物进行给药(例如标准剂量的20％-50％)。可供选择的给药量是使本发明化合物和免疫抑制药物以该量给药所得到的免疫抑制效果比以相同剂量单独使用该药物或本发明化合物所得免疫抑制效果要好。典型地，免疫抑制药物和增效剂以常规的时间间隔给药至少2周。
本发明的组合物也可以与常规的一种或多种抗炎药一起给药，其中，该药物或药物的给药量本身对于诱导适当的抑制或抑制发炎无效。
通过使用本领域已知的、已经建立的动物模型，可以评价化合物的体内免疫抑制活性。该分析可用于评价免疫抑制化合物的相对功效，并且可以用于估计进行免疫抑制治疗的适当剂量。这些分析包含例如由Ono和Lindsey(1969)所述的完全特征化的同种异体移植物大鼠模型系统，其中，移植的心脏与同种移植物接受动物的腹部大血脉相连，通过心脏在受体动物中搏动的能力测定移植心脏的生存能力。由Wang(1991)和Murase(1993)描述的异种移植物模型，其中受体动物为不同的种系。评估抗GVHD功效的模型包含给正常Fi小鼠注射父母的脾细胞；小鼠产生GVHD综合征，其特征为脾大和免疫抑制(Korngold，1978；Gleichmann，1984)。由个体的脾制备单细胞悬浮液，并在伴刀豆球蛋白A存在和不存在下建立微孔(microwell)培养物以评定致有丝分裂响应的程度。
IV.抗癌治疗如图1所示，具有结构式I的化合物，14-脱氧-1-α-氟雷公藤内酯醇(指定为PG763)以剂量依赖性方式对Jurkat细胞具有细胞毒素(参见实施例2)，浓度相当于采用雷公藤内酯醇进行的类似分析。因此，本发明包含将本发明化合物作为细胞毒素剂的用途，尤其是用于治疗癌症。如这里使用的“癌症”指在哺乳动物特别是人中发现的所有类型的癌症或肿瘤或恶性瘤，包含白血病、肉瘤、癌和黑素瘤。
术语“白血病”泛指血液形成器官的累积性恶性疾病，通常情况下其特征为血液和骨髓内的白细胞及其前体的不正常增生和发育。术语“肉瘤”一般指由象胚胎连接组织一样的物质形成的瘤并且在通常情况下由包埋在纤维或均质体中的紧密填充细胞构成。术语“黑素瘤”指源于皮肤和其它器官的黑素细胞系统的瘤。术语“癌”指上皮细胞的恶性新生长，趋于渗透周围组织并发生转移。
例如，包含的癌症涉及源于生殖组织的细胞(如塞尔托利氏(Sertoli)细胞、生殖细胞、发育中的或更成熟的精原细胞、精细胞或精母细胞和滋养细胞、卵巢的生殖细胞和其它细胞)、淋巴或免疫系统(如霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤)、造血系统和上皮细胞(如皮肤，包含恶性黑素瘤和胃肠道)、实质器官、神经系统如神经胶质瘤(参见Y.X.Zhou et al.，2002)和肌骨骼组织。该化合物可用于治疗各种癌细胞类型，包含但并非局限于，脑包括成神经管细胞瘤、头和颈、胸、结肠、小细胞肺、大细胞肺、甲状腺、睾丸、膀胱、前列腺、肝脏、肾、胰腺、食道、胃、卵巢、子宫颈或淋巴瘤。尤其希望能治疗胸、结肠、肺和前列腺瘤。
可以通过如上所述的常规给药途径将该组合物给药到受癌症和/或白血病折磨的患者。该方法可有效地减缓肿瘤生长、预防肿瘤生长、诱导肿瘤局部衰退以及引起肿瘤完全衰退直至完全消失。该方法也有效地用于预防源于实性肿瘤的转移生长。
本发明组合物可作为单独治疗药来给药，或与其它在患者中无抗癌效果的辅助性或治疗学的治疗一起进行。该方法也包括将本发明组合物与一种或多种常规的抗癌药物或生物蛋白剂一起，以在患者中具有预期抗癌效果的有效量给药。其中，该药物或试剂本身的量对诱导适当的癌症生长抑制无效。这些抗癌药物包含放射菌素D、喜树碱、卡铂、顺铂、环磷酰胺、阿拉伯糖胞苷、道诺霉素、阿霉素、鬼臼乙叉苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、羟基尿素、吉西他滨、药薯、氨甲蝶呤、丝裂霉素C、米拖蒽醌、帕尼特西、泰索帝、替尼泊苷、托泊替康、长春碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺和长春瑞宾。抗癌生物蛋白剂包含肿瘤坏死因子(TNF)、TNF相关细胞凋亡诱发配体(TRAIL)、其它TNF相关或TRAIL相关配体和因子、干扰素、白细胞间介素-2、其它白细胞间介素、其它细胞活素、化学活素和因子、肿瘤相关分子或受体的抗体(如抗-BER2抗体)以及与这些试剂反应或键合的试剂(如受体的TNF上族成员、其它受体、受体拮抗剂和专用于这些试剂的抗体)。
通过采用建立的动物模型，如Fidler et al在美国专利6,620,843中所描述的，可以评价特定组合物的体内抗肿瘤活性。按照临床医生已知的方法，根据疾病的严重性和患者的所有症状等因素来确定临床剂量和治疗计划。
V.其它说明本发明化合物也可以用于治疗某些CNS疾病。谷氨酸盐可实现许多生理学功能，包扩在各种神经学和精神病的病理生理学方面起着重要的作用。在组织缺氧、局部缺血和损伤以及慢性神经变性或神经代谢疾病、阿尔茨海默痴呆、亨延顿疾病和帕金森疾病中已经暗示了谷氨酸盐的兴奋毒性和神经毒性。考虑到已报道的雷公藤内酯醇具有神经保护作用，特别是可预防由谷氨酸盐诱导的细胞死亡(Q.He et al.，2003；X.Wang et al.，2003)，因此本发明化合物有望可对抗谷氨酸盐的神经毒作用并因而可能是一种用于这种疾病的新治疗手段。
来自复原期MS病人的最新证据暗示出脑中谷氨酸盐的动态平衡发生了改变。在MS病人中出现的神经中毒发作可能是造成少突细胞和神经元细胞死亡的原因。在MS病人中，通过使用本发明化合物治疗抗谷氨酸盐受体-介导的兴奋毒性可能具有治疗学含义。其它CNS疾病如吉-巴综合征、梅尼埃病、多神经炎、多发性神经炎、单神经炎和神经根病也可以用本发明化合物治疗。
本发明化合物也可以用于治疗某些肺病。突发性肺纤维化(PF)为一种积累产生裂缝的肺病，其病原未知。PF的特征为细胞内基质和胶原质在肺间质组织中过度错位，并逐渐由疤痕组织取代气泡，其结果是发炎和纤维症。随着疾病的发展，疤痕组织的增加干扰了氧从肺转移到血流的能力。已报导雷公藤内酯醇的14-琥珀酰亚胺酯可阻断博来霉素诱导的PF(G Krishna et al.，2001)。因此，本发明化合物可有效地用于治疗PF。也认为该化合物可治疗其它呼吸疾病，如肉状瘤病、纤维化肺以及突发性间质性肺炎。
其它涉及肺并预期用本发明化合物治疗的疾病包含严重的急性呼吸综合征(SARS)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。特别是关于SARS，如以下所指出的，在疾病发展到高峰前减少病毒含量(SARS-CoV)以及采用皮质类固醇治疗的有效性暗示出SARS威胁生命的最严重影响的发展可能源于身体对感染的夸张响应(免疫活动过度)，而不是病毒本身的影响(参见共同未决的和共有的美国临时申请60/483,335，其作为参考并入本文)。皮质类固醇治疗已用于SARS病人以便抑制细胞活素的大量释放，其表现了免疫活动过强阶段的特征，希望在下一阶段停止肺病的进展。皮质类固醇治疗已产生了良好的临床结果，减少了一些主要的SARS症状。然而，存在几种与治疗相关的副作用，并且非常需要更具有选择性的免疫抑制和/或抗炎剂。
实施例下述实施例用于解释本发明，而并非是对本发明的限制。
实施例1.制备14-脱氧-14α-氟雷公藤内酯醇 在N2下，0℃时，向PG490(雷公藤内酯醇，17.3mg，0.048mmol)的二氯甲烷溶液(1.0ml)中加入(二乙基氨基)三氟化硫(DAST，100μl，0.763mmol)。该反应混合物于0℃搅拌2小时后加入饱和NaHCO3溶液(0.8ml)。用3×2ml二氯甲烷萃取该反应混合物。合并的有机层用无水NaSO4干燥并进行真空浓缩。定量获得所需的产物(PG763)。
分析TLCRf＝0.78(乙酸乙酯/己烷/甲醇1∶1∶0.1)。IR(KBr)3031.0，2961.2，2942.4，2873.8，1764.6，1680.9，1449.3，1438.3，1172.2，1098.1，1074.5，1057.0，1047.1，1034.2，1018.2，1005.6，987.3，972.3，923.9，909.0，743.6，586.0，566.0，539.8，527.6cm-1。IHNMR(300MHz，CDCl3)δ＝5.16(d，1H，14-CH)，4.70(q，2H，19-CH2)，3.80(d，1H，11-CH)，3.73(d，1H，7-CH)，3.50(t，1H，12-CH)，2.70(m，1H，5-CH)，2.34(d，1H，2-CHb)，2.27-2.02(m，3H，6-CHb，2-CHa和15-CH)，1.95(m，1H，6-CHa)，1.56(dd，1H，1-CHb)，1.24(m，1H，1-CHa)，1.11(s，3H，20-CH3)，1.10(d，3H，17-CH3)，0.91(d，3H，16-CH3)ppm。
实施例2细胞毒性(MTT)分析将测试化合物溶解在DMSO中，浓度为20mM。在RPMI1640介质(GIBCO，Rockville，MD)中用10％胎牛血清(HyClone Laboratories，Logan，UT)进一步稀释。
在标准的MTT分析中，采用细胞扩增试剂盒I(#1 465 007，RocheDianostics，Mannheim，Germany)测定化合物的细胞毒性。简言之，在每个稀释点，在存在测试化合物的一系列3倍稀释液或含有与测试样品中相同浓度DMSO的介质的情况下，将人T细胞淋巴瘤(Jurkat)细胞(4×105/孔)在96孔的组织培养板上培养24小时。接着，培养物用10μl/孔的MTT试剂补充4小时并随后用0.1ml/孔的溶解剂补充另外的16小时。在ThermoScan微板读数仪(分子设备，Menlo Park，CA)上测定570nm处的光密度(OD570)。数据相对于化合物的浓度表示为OD570值。图1给出了PG763(14-脱氧-1-α-氟雷公藤内酯醇)相对于PG490(雷公藤内酯醇)和介质控制组的结果。
实施例3膜联蛋白V细胞凋亡分析将测试样品在完全组织培养基(RPMI 1640介质，加入5％热变性的胎牛血清、1％HEPES、1％pen/strep、1％谷氨酸盐)中稀释至1mM。将溶液放在微培养板上并制备一系列稀释液从而使最终浓度包含以半对数增加的2-6000nM的范围。从指数增加的Jurkat人T淋巴瘤细胞线(#TIB-152，购自American Type Culture Collection，Manassas，VA)的培养物中收集细胞，离心清洗一次，再次悬浮在完全的组织培养基内，并且进一步稀释到浓度为1×106细胞/ml。将100μ(1×105)l细胞加入到含有100μl稀释化合物的孔中，并且将板在5％CO2保温箱中于37℃下培养。
24小时后，板被离心以使细胞球形化，在PBS中用2％热变性的胎牛血清清洗细胞2次。根据膜联蛋白V分析方法(Bio Vision，Inc.，Mountain View，CA)向每个孔加入500ul结合缓冲液。接着，向每个孔加入5μl膜联蛋白V的荧光素异硫氰酸酯(FITC)共扼物(BioVision，Inc.)，然后在黑暗中培养5分钟。在一些分析中，在该阶段加入propidium碘化物(BioVision，Inc.)以检查坏死的细胞。将孔内的物质单独转移到试管中并采用FACSCalibur流动血细胞计数器(BD免疫血细胞计数系统，San Jose，CA)分析细胞凋亡。对膜联蛋白V结合呈阳性的细胞被视为凋亡的，并以凋亡细胞百分比来计算数据。
将数据以化合物浓度相对于凋亡细胞百分比作图。图3A-B给出了两种14-取代雷公藤内酯醇、14-α-羟基雷公藤内酯醇(也称作epitriptolide；指定为PG524)和14-β-(甲硫基)甲基雷公藤内酯醇(指定PG691)相对于PG490(雷公藤内酯醇)的比较数据。
实施例4IL-2产物分析将测试样品在完全的组织培养基中稀释至1mM。将该溶液放在已用抗CD3抗体涂敷的微型培养板上(用Jurkat细胞刺激IL-2产物)并制备一系列稀释液从而使最终浓度可包含以对数增加的0.001-10,000nM的范围。从指数增加的Jurkat人T细胞线(#TIB-152购自AmericanType Culture Collection，Manassas，VA)的培养物中收集细胞，离心清洗一次，再次悬浮在完全的组织培养基中并稀释到浓度为2×106细胞/ml。将50μl Jurkat细胞(1×105细胞)加入到含有100μl稀释化合物的孔中，向每个孔加入50μl PMA(10ng/ml)并将板在5％CO2保温箱中于37℃培养。24小时后，板被离心以使细胞球形化，从每个孔取出150μl上清液并将样品储存在-20℃。采用Luminex 100(Luminex Corporation，Austin，TX)、抗IL-2捕获抗体结合的Luminex微球以及荧光染料结合的抗IL-2检测抗体分析储存的上清液的IL-2浓度。数据以IL-2的pg/ml表示。
将数据以化合物浓度相对于IL-2浓度作图。图2给出了PG763(14-脱氧-1-α-氟雷公藤内酯醇)相对于PG490(雷公藤内酯醇)和溶剂控制组的结果。图4A-B给出了其它的14-取代雷公藤内酯醇、1-α-羟基雷公藤内酯醇(也称作epitriptolide；指定为PG524)和14-β-(甲硫基)甲基雷公藤内酯醇(指定为PG691)相对于PG490(雷公藤内酯醇)的比较数据。
权利要求
1.具有结构式I的化合物 其中CR1R2选自CHOH、C＝O、CHF、CF2或C(CF3)OH；CR6和CR13选自CH、COH或CF；CR7R8、CR9R10和CR11R12选自CH2、CHOH、C＝O、CHF或CF2；和CR3R4R5选自CH3、CH2OH、C＝O、COOH、CH2F、CHF2或CF3；其中，在R1-R13中至少有一个包含氟；在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有两个包含氟或氧；并且，当CR1R2是CHOH时，CR3R4R5不是CH2F。
2.根据权利要求1的化合物，其中，CR7R8和CR9R10均独立选自CH2、CHOH(β)、C＝O、CHF(α)或CF2。
3.根据权利要求2的化合物，其中，在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有一个包含氟或氧。
4.根据权利要求3的化合物，其中，在CR1R2、CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10和CR11R12中刚好有一个包含氟。
5.根据权利要求4的化合物，其中，在CR1R2、CR6、CR7R8、CR9R10和CR11R12中刚好有一个包含氟。
6.根据权利要求5的化合物，其中，CR1R2包含氟。
7.根据权利要求6的化合物，其中，CR1R2是CF2。
8.根据权利要求6的化合物，其中，CR1R2是CHF(α)。
9.根据权利要求8的化合物，其中，R3-R13都是氢。
10.影响免疫抑制的方法，包括将有效量的、包含在药学可接受的载体中的、具有结构式I的化合物给药到需要这种处理的受试者 其中CR1R2选自CHOH、C＝O、CHF、CF2或C(CF3)OH；CR6和CR13选自CH、COH或CF；CR7R8、CR9R10和CR11R12选自CH2、CHOH、C＝O、CHF或CF2；和CR3R4R5选自CH3、CH2OH、C＝O、COOH、CH2F、CHF2或CF3；其中，在R1-R13中至少有一个包含氟；在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有两个包含氟或氧；并且，当CR1R2是CHOH时，CR3R4R5不是CH2F。
11.根据权利要求10的方法，其中，CR7R8和CR9R10均独立选自CH2、CHOH(β)、C＝O、CHF(α)或CF2。
12.根据权利要求10的方法，其中，在CR1R2、CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10和CR11R12中刚好有一个包含氟。
13.根据权利要求12的方法，其中，CR1R2包含氟。
14.根据权利要求13的方法，其中，CR1R2是CF2。
15.根据权利要求13的方法，其中，CR1R2是CHF(α)。
16.根据权利要求15的方法，其中，R3-R13都是氢。
17.诱导细胞内细胞凋亡的方法，包括将所述细胞与有效量的、具有结构式1的化合物接触 其中CR1R2选自CHOH、C＝O、CHF、CF2或C(CF3)OH；CR6和CR13选自CH、COH或CF；CR7R8、CR9R10和CR11R12选自CH2、CHOH、C＝O、CHF或CF2；和CR3R4R5选自CH3、CH2OH、C＝O、COOH、CH2F、CHF2或CF3；其中，在R1-R13中至少有一个包含氟；在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有两个包含氟或氧；并且，当CR1R2是CHOH时，CR3R4R5不是CH2F。
18.根据权利要求17的方法，其中，CR7R8和CR9R10均单独选自CH2、CHOH(β)、C＝O、CHF(α)或CF2。
19.根据权利要求18的方法，其中，在CR1R2、CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10和CR11R12中刚好有一个包含氟。
20.根据权利要求19的方法，其中，CR1R2包含氟。
21.根据权利要求20的方法，其中，CR1R2是CF2。
22.根据权利要求20的方法，其中，CR1R2是CHF(α)。
23.根据权利要求22的方法，其中，R3-R13都是氢。
全文摘要
本发明涉及具有结构式(I)的化合物，该化合物可用于免疫抑制和诱导细胞死亡(细胞凋亡)。在结构式I中，CR
文档编号C07D407/00GK1753666SQ200480005153
公开日2006年3月29日 申请日期2004年2月25日 优先权日2003年2月25日
发明者D·戴, J·H·马瑟 申请人:美国泛华医药公司