专利名称：逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法。
背景技术：
柿科(the family Ebenaceae)柿属植物，全世界总共有240多种，它们主要广泛地分布于热带有亚热带地区，温带偶有分布。我国大约有56种，产于西南部至东南部，北至辽宁(侯宽昭编，中国种子植物科属词典，第二版，北京科技出版社，1984，159)。此发明所用柿叶，是柿树的干燥叶，其味苦、酸、涩，性凉，具有清肺止咳、凉血、降血压之功效。主要用于咳喘、肺气肿、各种内出血、高血压等病症。现代研究表明，柿叶含有丰富的黄酮类、鞣质、树脂、维生素C、内脂香豆素类、挥发油及熊果酸、齐墩果酸等三萜酸，世界各地的柿叶都含有丰富的熊果酸及其衍生物(Row L.Ramachandra et al，IndianJournal of chemistry，1969，7204-206；Mallavadhani U.V.et al，Biochemical Systematics and Ecology，1998，26941-942；Mallavadhani U.V.et al，Pharmaceutical Biology，2001，39(1)20-24；Mallavadhani U.V.et al，Biochemical Systematics and Ecology，1998，26941-942；陈光等，中国药物化学杂志，2000，10(4)298-299；陈光等，2005，36(1)26-28)。
柿叶中熊果酸及其衍生物具有广泛的用途，如用于医药，化妆品等。熊果酸可以抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗氧化等作用(Somova L.I.et al，Journalof Ethnopharmacology，2003，84299-305)，且它对多种致癌细胞具有细胞毒、诱导分化及抗血管形成作用，其防癌抗癌作用已引起重视，成为现代肿瘤药研究的新热点(Chiang Lien-Chai et al，The American Journal of ChineseMedicine，2003，31(1)37-46；夏国豪等，国外医学肿瘤学分册，2002，29(6)420-422)，熊果酸也有可能成为抗HIV的潜在药物(QuéréLuc et al，Biochemicai and Biophysical Research Communications1996，227484-488)。柿叶熊果酸的衍生物也具有消炎(Kusakari Takeshi et al，日本专利，JP 2004010531 A2 20040115)(Maria del Carmen Recio et al，PlantaMedica，1995，619-12.)以及能抑制人体内嗜中性粒细胞中过氧化物的产生，使之具有潜在的药用价值(Chen Guang et al，Clinica Chimica Acta2002，32011-16)，等等。现有文献报道采用柱层析及高效液相色谱的方法分离，但纯度不高，回收率很低。高速逆流色谱(High-speed countercurrentchromatography，HSCCC)是近些年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色说分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的各种问题如样品易被吸附、损耗和变性，使用其它液相色谱法进行制备量分离时，其分配效率会明显降低，溶剂消耗量大，HSCCC保证较高峰形分辨度，分离量大、样品无损失、损失收率高、分离环境缓和，节约溶剂。逆流色谱仪能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法。
方法的步骤如下1)采用烷烃∶脂肪酯∶脂肪醇∶水的体积比为1-10∶1-20∶1-10∶1-10的溶剂系统；柿叶的提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；2)按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开；3)用上相作固定相，下相作流动相或用下相作固定相，上相作流动相；用上相作为固定相，充满整个逆流色谱仪中的色谱柱子，调整主机正转，转速为200-2000rmp，以1.0-10.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内进行洗脱；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；用下相作为固定相，充满整个逆流色谱柱子，调整主机正转，转速为200-2000rmp，以1.0-10.0mL/min的流速将上相流动相从柱子的尾端泵入柱内进行洗脱；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；4)根据检测器的谱图或薄层层析检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。
所述的烷烃为正己烷、异己烷、正戊烷、异戊烷、正庚烷、异庚烷、正辛烷、异辛烷或石油醚的一种或几种的混合物。脂肪酯为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯或乙酸正丁酯的一种或几种的混合物。脂肪醇为乙醇或甲醇的一种或两种的混合物。
熊果酸衍生物为3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸或3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸中任一种或几种。
泵入柱内进行洗脱为等梯度洗脱或逐渐改变配比进行梯度洗脱。薄层层析检测采用正相硅胶薄层层析板，展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮的体积比为4-8∶2-6∶1-3、甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸的体积比为12∶4∶0.5、苯∶酸乙酯∶乙酸的体积比为12∶4∶0.5。逆流色谱仪是分析型、半制备型或制备型。
本发明的优点是所用柿叶在我国分布广泛，往往被当作废料扔掉或烧掉，因此本发明柿叶原料易得；所用各种化学试剂都很常见，容易大批量购买；本分离过程能连续进行，操作简便，效率高，熊果酸及其衍生物纯度大于98％；与柱层析等色谱方法比较，它不用任何固态的支持物或载体，因此不存在固态载体所造成的样品吸附损耗、玷污和变性等问题，是一种经济的从柿叶粗提物中分离制备高纯度熊果酸及其衍生物的方法；能直接进大量的柿叶粗提物或合成混合物；适合于各种型号的逆流色谱仪分离制备熊果酸及其衍生物。
具体实施例方式
实施例1采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶6∶4∶2(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的乙酸乙酯提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料，(柿叶的乙酸乙酯提取物的提取方法见专利申请号为CN200410025770.8的发明专利申请)；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相作为固定相，充满整个柱子，调整主机正转，转速为450rmp，以5.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶2)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6m，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例2
采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶6∶5∶2(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的二氯甲烷提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在半制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用下相作为固定相，充满整个柱子，调整主机正转，转速为750rmp，以3.0mL/min的流速将上相流动相从柱子的尾端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸＝12∶4∶0.5)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝7∶3(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例3采用石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶6∶4∶2(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的丙酮提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在分析型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为2000rmp，以1.0mL/min的流速将流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为苯乙酸乙酯∶乙酸＝12∶4∶0.5)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝9∶1(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例4采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝4∶7∶4∶3(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的二氯甲烷提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为500rmp，以5.0mL/min的流速将流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝8∶6∶3)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝7∶3(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例5采用正庚烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶7∶5∶2(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的三氯甲烷提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为550rmp，以5.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝8∶6∶3)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例6采用正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水＝3∶5∶4∶2(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的二氯乙烷提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为400rmp，以5.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶2∶1)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例7采用环己烷∶乙酸丙酯∶甲醇∶水＝5∶6∶4∶2(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的四氯甲烷提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为450rmp，以5.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶2)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例8采用正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水＝1∶1∶2∶1(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的乙酸乙酯提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为550rmp，以4.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶2)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝7.8∶2.2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例9
采用正辛烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶6∶4∶2(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的乙酸乙酯提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为450rmp，以3.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶2)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例10采用正己烷∶乙酸丁酯∶甲醇∶水＝3∶7∶4∶2(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的乙酸乙酯提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用下相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为600rmp，以10.0mL/min的流速将上相流动相从柱子的尾端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝5∶3∶2)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例11采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶1∶2∶1(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的乙酸乙酯提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为550rmp，以5.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝5∶2∶2)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例12采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶1∶1∶1(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的乙酸乙酯提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为550rmp，以5.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝5∶2∶2)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例13采用正己烷和正庚烷1∶1的混合物、乙酸乙酯、甲醇和乙醇的1∶1混合物、水体积比为3∶6∶4∶2(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的乙酸乙酯提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用下相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为200rmp，以2.0mL/min的流速将上相流动相从柱子的尾端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶1)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例14采用异己烷和正辛烷1∶1的混合物、乙酸乙酯和乙酸正丁酯1∶1的混合物、乙醇、水体积比为3∶7∶5∶2(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的乙酸乙酯提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为550rmp，以5.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶1)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例15采用异戊烷和异辛烷1∶1的混合物、乙酸丙酯和乙酸异丙酯1∶1的混合物、乙醇、水体积比为3∶6∶5∶2(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的乙酸乙酯提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在分析型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用下相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为2000rmp，以5.0mL/min的流速将上相流动相从柱子的尾端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶1)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例16
采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝10∶20∶9∶6(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的乙酸乙酯提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在制备型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为200rmp，以2.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶1)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
实施例17采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝10∶19∶10∶10(v/v/v/v)的溶剂系统；柿叶的乙酸乙酯提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；在分析型HSCCC上进行分离制备熊果酸及其衍生物。首先按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相为固定相存满整个柱子，调整主机正转，转速为2000rmp，以1.0mL/min的流速将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器的谱图及薄层层析方法(展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶1)检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。HPLC检测分析条件色谱柱为Lichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱温25℃，洗脱液为甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm。
权利要求
1.一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于，方法的步骤如下1)采用烷烃∶脂肪酯∶脂肪醇∶水的体积比为1-10∶1-20∶1-10∶1-10的溶剂系统；柿叶的提取物经精制、提纯和结晶除去大部分熊果酸后，滤液蒸干所得固体为原料；2)按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇匀后，静置分层，等平衡一段时间后，将上、下相分开；3)用上相作固定相，下相作流动相或用下相作固定相，上相作流动相；用上相作为固定相，充满整个逆流色谱仪中的色谱柱子，调整主机正转，将下相流动相从柱子的首端泵入柱内进行洗脱，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；用下相作为固定相，充满整个逆流色谱柱子，调整主机正转，将上相流动相从柱子的尾端泵入柱内进行洗脱；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；4)根据检测器的谱图或薄层层析检测，经重结晶分别得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸和3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸)。
2.根据权利要求1所述的一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述的烷烃为正己烷、异己烷、正戊烷、异戊烷、正庚烷、异庚烷、正辛烷、异辛烷或石油醚的一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述的脂肪酯为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯或乙酸正丁酯的一种或几种的混合物。
4.根据权利要求1所述的一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述的脂肪醇为乙醇或甲醇的一种或两种的混合物。
5.根据权利要求1所述的一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于所述的熊果酸衍生物为3α，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸或3β，24-三羟基乌索-12-烯-28-酸中任一种或几种。
6.根据权利要求1所述的一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述的泵入柱内进行洗脱为等梯度洗脱或逐渐改变配比进行梯度洗脱。
7.根据权利要求1所述的一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于所述的薄层层析检测采用正相硅胶薄层层析板，展开剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮的体积比为4-8∶2-6∶1-3、甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸的体积比为12∶4∶0.5、苯∶酸乙酯∶乙酸的体积比为12∶4∶0.5。
8.根据权利要求1所述的一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于所述的逆流色谱仪是分析型、半制备型或制备型。
9.根据权利要求1所述的一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于所述的主机转速为200-2000rmp。
10.根据权利要求1所述的一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于所述的流动相的流速为1.0-10.0mL/min。
全文摘要
本发明公开了一种逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法。方法步骤为1)配制构成固定相、流动相的两相溶剂系统；2)使逆流色谱仪柱子中充满固定相；3)使逆流色谱仪的主机转动；4)将流动相泵入逆流色谱仪柱内；5)由进样阀进入原料，根据检测器谱图或薄层层析方法检测获得熊果酸及其衍生物。本方法适用于对各种途径获得的柿叶粗提物提纯，适用于用各种型号的逆流色谱仪分离制备熊果酸、3α，19α，24－三羟基乌索－12－烯－28－酸、3β，19α，24－三羟基乌索－12－烯－28－酸和3β，24－三羟基乌索－12－烯－28－酸，纯度可达到98％以上，能直接进大量粗品或合成混合物，能达到很好的分离效果。
文档编号C07J63/00GK1733794SQ20051006048
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月25日 优先权日2005年8月25日
发明者何潮洪, 范杰平 申请人:浙江大学