专利名称：基于冠状病毒主蛋白酶切割的表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及基因工程领域，更具体地说，本发明涉及包含冠状病毒主蛋白酶特异性切割序列的表达载体及其应用。
背景技术：
现代的生物化学、蛋白质组学的研究，以及工业蛋白质产品的生产都要求大量、高效地获取所需的蛋白质原料。过去，人们从大自然中提取和分离蛋白质。但是，能从自然界中获取的蛋白质量相当有限，分离纯化困难，工艺复杂，且成本高昂，其蛋白质产量远不能满足人们的需求。进入基因工程时代以后，为了解决这一供需之间的矛盾，人们开发了各类原核、真核的体外表达系统。
谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase，GST)基因融合系统就是其中之一(GST Gene Fusion System，Third Edition，Revision 2，Amersham Pharmacia Biotech Inc.)。该系统包括三个主要部分pGEX质粒载体，两个GST纯化模块和GST检测模块，并使用一系列带有特异性识别位点的蛋白酶作为辅助。GST基因融合系统的质粒载体具有启动子、多克隆位点以及用以切割的特异性蛋白酶的识别位点。此特异性识别位点紧邻pGEX质粒上的多克隆位点，并处于其上游。
在大肠杆菌中表达的具有完整酶活性的GST通常是一个26kDa大小的蛋白质。包含完整GST氨基酸序列的融合蛋白同样具有GST酶活性，并依然能形成二聚体。GST融合蛋白可以通过亲和层析得以纯化，然后使用特异性位点蛋白酶将目标蛋白切割下来。GST融合蛋白的检测通常采用比色测定和免疫检测的方式来进行。
目前，常用的从融合蛋白质上切割目标蛋白的酶包括前切割蛋白酶(PreScission Protease，即GST蛋白和人类鼻病毒3C蛋白酶(humanrhinovirus 3C protease)的融合酶)、凝血酶(Thrombin)以及Xa因子(Factor Xa)。
现有的GST融合蛋白表达载体，其配套工具酶识别位点通常只编码6～8个氨基酸，如pGEX-6p-1载体的配套工具酶人类鼻病毒3C蛋白酶识别序列为8个氨基酸，pGEX-4T-1载体的配套工具酶凝血酶的识别序列为6个氨基酸。其中，人类鼻病毒3C蛋白酶还可能会与RNA结合(Anand，K.，Palm，G.J.，Mesters，J.R.，Siddell，S.G.，Ziebuhr，J.& Hilgenfeld，R.(2002)Embo J.，21，3213-24.)，在提纯过程中需考虑除去核酸。
SARS是一种对人类具有巨大威胁的烈性传染病。一种新型的冠状病毒目前已经被确认是严重急性呼吸系统综合征(Severe Acute RespiratorySyndrome，简称为SARS)的元凶，并被命名为SARS冠状病毒(简称为SARS-CoV)。SARS冠状病毒在种属分类上属于“Nidovirales”目、“Coronaviridae”科、“Coronavirus”属。它是冠状病毒家族中新出现的一个变种，全长29,736bp(Urbani Strain)。
根据血清学分类，冠状病毒家族(冠状病毒属)共包括四种类型(Group)。I型包括猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissiblegastroenteritis virus，简称为TGEV)、人冠状病毒(human coronavirus，简称为HCoV)毒株229E、猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectiousperitonitis virus，简称为FIPV)等；II型包括牛冠状病毒(Bovinecoronavirus，简称为BCoV)、鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus，简称为MHV)等；III型目前只包括三种病毒，其中一种被称为禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，简称为AIBV)；SARS-CoV则属于IV型。各类冠状病毒对人、畜的生命健康有巨大威胁。
冠状病毒，例如SARS-CoV和AIBV，在转录复制过程中会编码两条多蛋白片段，称为pp1a和pp1ab。冠状病毒的主蛋白酶能对这些片段进行切割，释放出活性片段，从而使病毒进行自我复制。在长期的进化过程中，被切割的底物与主蛋白酶进行着相互选择，使底物序列与冠状病毒主蛋白酶的结构相互适应，且底物序列具有相当高的保守性。
发明内容
本发明部分地基于如下发现，即SARS-CoV以及AIBV主蛋白酶所切割的底物序列特异性很高，而且相当保守。
因此，本发明一方面提供了一种表达载体，其中包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。所述核苷酸序列所编码的特异性切割位点可用于对亲和层析后的融合蛋白质的切割，以获得高纯度的目标蛋白；也可用于向目标蛋白中引入特异性切割位点，从而实现对目标蛋白的定点切割。
在本发明的一些优选实施方式中，所述表达载体中还可以包含编码亲和标签的基因，例如GST基因、His-Tag基因、麦芽糖结合蛋白(MaltoseBinding Protein)基因和硫氧还蛋白基因(thioredoxin)，以便于利用亲和层析方便地纯化包含目标蛋白的融合蛋白。在本发明的一种特别优选的实施方式中，所述表达载体中包含GST基因。
本发明另一方面提供了一种制备重组蛋白的方法，该方法包括1)将目标蛋白基因克隆到本发明所提供的表达载体中，所述表达载体中包含编码SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；2)利用步骤1)中所获得的表达载体转化宿主细胞；3)培养步骤2)中所获得的宿主细胞；4)通过亲和层析，从步骤3)中所获得的细胞中分离纯化出包含目标蛋白的重组融合蛋白；5)利用禽传染性支气管炎病毒主蛋白酶或SARS冠状病毒主蛋白酶对步骤4)中所获得的重组融合蛋白进行切割，得到目标蛋白。这种方法利用禽传染性支气管炎病毒主蛋白酶或SARS冠状病毒主蛋白酶作为工具酶，一步纯化获得高纯度的目标蛋白。
本发明又一方面提供了一种试剂盒，其中包含本发明所提供的表达载体以及一种工具酶，所述表达载体中包含编码SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，所述工具酶选自由禽传染性支气管炎病毒主蛋白酶和SARS冠状病毒主蛋白酶所构成的组。
本发明再一方面提供了一种向目标蛋白中引入特异性切割位点的方法，该方法包括向包含该目标蛋白编码基因的表达载体中，引入一段核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
利用本发明所述的载体和方法进行重组蛋白的表达，具有高效、稳定的特点。在一个优选实施例中，用1升细菌悬浮培养物表达钙结合蛋白Calbindin D28k，通过GST亲和层析一步纯化，并按～0.1mg/ml胶的量加入AIBV主蛋白酶于4℃切割20小时左右可获得70～80mg CalbindinD28k。作为配套工具酶的禽传染性支气管炎病毒主蛋白酶和SARS冠状病毒主蛋白酶，不仅具有高效酶活，而且未有和RNA结合的报道，使用方便、简单。其识别位点包含约11个氨基酸，识别特异性高。
附图不一定是成比例的，其目的仅仅在于更好地解释本发明，以便于读者理解。将附图与具体实施方式
结合在一起考虑，可以更好地理解本发明。
图1是pGSTM载体的结构示意图。该载体通过对现有的GST融合蛋白表达载体pGEX-6p-1进行改造，在GST位点下游引入编码TSAVLQSGFRK氨基酸序列的DNA序列替换掉原有的酶切位点而得到。除TSAVLQSGFRK的编码序列外，该载体还具有其它必要的基因元件，包括氨苄青霉素标签Ampr、启动子序列lac Iq、GST蛋白编码区、复制起始位点pBR322 ori以及若干限制性内切酶的切割位点。
图2是pGSTM载体的核苷酸序列。
图3A显示了经过重组表达、亲和层析得到的SARS-CoV主蛋白酶的SDS-PAGE结果。泳道1为分子量标记；2为亲和层析后得到的SARS-CoV主蛋白酶。
图3B显示了经过重组表达，亲和层析得到的AIBV主蛋白酶SDS-PAGE结果。泳道1为AIBV主蛋白酶，泳道2为分子量标记。
图4显示了利用基于pGEX-6p-1的pGSTM质粒载体重组表达和纯化Calbindin D28k蛋白质过程中各阶段蛋白质组分的SDS-PAGE结果。泳道1为大肠杆菌诱导表达前的总蛋白；2为大肠杆菌诱导表达后的总蛋白；3为破菌以后的上清液；4为破菌以后离心下来的沉淀；5为分子量标记；6为经亲和层析并加入SARS-CoV主蛋白酶切割后获得的Calbindin D28k蛋白质。
图5显示了利用基于pGEX-6p-1的pGSTM质粒载体经过重组表达、亲和层析和AIBV主蛋白酶切割后得到的Calbindin D28k蛋白质的SDS-PAGE结果。泳道1为Calbindin D28k蛋白，泳道2为分子量标记。
具体实施例方式
为了更加详细地解释本发明，下面将结合附图给出本发明的具体实施例。这些具体实施方式
仅仅是出于解释和说明的目的，不应该被理解为是对本发明范围的限制。在对这些具体实施方式
进行描述时，没有对公知的实验方法、仪器、试剂和材料等进行详细的描述，以避免喧宾夺主、淡化了本发明的主要内容。
为了表述上的方便，在本文中有时将禽传染性支气管炎病毒主蛋白酶和SARS冠状病毒主蛋白酶合称为“冠状病毒主蛋白酶”。
为得到本发明的表达载体，一种优选的实施方式是采用PCR的方法来引入编码冠状病毒主蛋白酶的底物序列的核苷酸序列，例如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。本领域技术人员还可以采用定点突变等本领域已知的其他方法来引入所述核苷酸序列。
适用于本发明的起始表达载体包括各种原核表达载体以及真核表达载体，可以根据目标蛋白的特点进行选择。例如，人酪氨酸酶在大肠杆菌中表达时，会遇到不能糖基化的问题，此时可能需要选择真核表达载体；对于大部分的细菌蛋白质，使用原核表达载体通常就能取得较好的效果。
本发明所提供的新型表达载体，可用于进行目标重组蛋白的表达纯化。在本发明的表达载体中加入亲和标签，可以通过亲和层析来纯化目标蛋白，使纯化过程特别简单。一种具体的实施方式是，首先将目标蛋白基因通过PCR扩增出来，将扩增产物与经过酶切处理的表达载体连接起来，得到能够表达包含目标蛋白与GST的融合蛋白的载体。然后将这种载体转入大肠杆菌宿主细胞，经过筛选后，培养带有目的基因的大肠杆菌；经过细菌富集，破碎后上亲和层析柱，经过洗脱后，其它杂蛋白流出柱外，包含GST和目标蛋白的融合蛋白留在柱内，然后用冠状病毒主蛋白酶进行柱内切割，最后得到纯化的目标蛋白。
实施例1 基于pGEX-6p-1的pGSTM表达载体的构建首先，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增pGEX-6p-1载体(购自Pharmacia公司)654～945位的区域，引入冠状病毒主蛋白酶特异性的11个氨基酸切点TSAVLQSGFRK(包含于下游引物中)。其中，以pGEX-6p-1载体为模版，上游引物为5′-TTCGAAGATCGTTTATGTCATAAA-3′，下游引物为5′-GGATCCTTTCCTAAAACCACTCTGCAGAACTGCACTAGTATCC，在Ex Taq DNA聚合酶(购自TaKaRa公司)作用下进行基因片段扩增。总共进行35次扩增循环，每次循环包括95℃变性30秒，50℃复性45秒，72℃延伸60秒。
将回收后的扩增产物，按照标准方法，用T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接到pMD18-T上，然后分别用Bstb I和BamH I在65℃和37℃酶切，最后将目的片段连接到用上述限制性内切酶处理的pGEX-6p-1载体中，构建得到表达质粒pGSTM(4990bp)。其结构如图1所示，其核苷酸序列如图2以及SEQ ID NO3所示。
实施例2 SARS-CoV主蛋白酶和AIBV主蛋白酶的表达与纯化按照标准方法，将SARS-CoV主蛋白酶或AIBV主蛋白酶基因扩增后连接到质粒载体pGEX-4T-1(购自Pharmacia公司)，然后转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自Novagen公司)，之后用单克隆接种，并在含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的大肠杆菌菌液中，保持37℃培养至OD600为0.6左右，加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mmol/L，16℃诱导过夜后，5000rmp离心10分钟收集细胞。用缓冲液(10mmol/Lβ-巯基乙醇，1mmol/L PMSF，1×PBS)将细胞重悬，冰浴超声破碎细胞，15000rpm离心30分钟后，用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达，并用谷胱甘肽琼脂糖4B(Glutathione Sepharose 4B)凝胶进行亲和层析(GST Gene FusionSystem，Third Edition，Revision 2，Pharmacia Biotech Inc.)，制备得到SARS-CoV主蛋白酶或AIBV主蛋白酶。
按照本实施例重组纯化再经亲和层析得到的SARS-CoV主蛋白酶，其SDS-PAGE结果如图3A所示。参照分子量标记1，可以确定泳道2所显示的SARS-CoV主蛋白酶大小符合预期值。
按照本实施例重组纯化再经亲和层析得到的AIBV主蛋白酶，其SDS-PAGE结果如图3B所示。参照分子量标记2，可以确定泳道1所显示的AIBV主蛋白酶大小符合预期值。经检测，1升悬浮培养物最后可获得纯度不低于90～95％，含量～50mg的主蛋白酶。
实施例3 利用基于pGEX-6p-1的pGSTM载体构建表达CalbindinD28k基因的载体用上游引物5’-GGATCCATGGCAGAATCCCACCTG-3’和下游引物5′-CCGCTCGAGCTAGTTATCCCCAGCACA-3′，以含Calbindin D28k基因的pGEX-6p-1质粒为模板扩增Calbindin D28k的基因。按照标准方法，将扩增产物连接到pMD18-T上后，用BamH I和Xho I酶切，然后再将目的基因片段克隆到已用上述限制性内切酶进行了酶切处理的pGSTM载体中，构建得到表达质粒pGSTM-Calbindin D28k。
实施例4 质粒pGSTM-Calbindin D28k的表达纯化及利用AIBV主蛋白酶切割得到Calbindin D28k蛋白按照标准方法，采用SDS-PAGE筛选出过量表达GST-Calbindin D28K重组蛋白的克隆，接着利用如下所述的一步纯化法来纯化得到重组的Calbindin D28k。
首先在含有100mg氨苄青霉素的LB培养基中接种带有GST-Calbindin D28k重组蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)的单菌落，在37℃培养，直到OD600达到0.6。然后加入IPTG使其浓度达到1mmol/L，在16℃培养过夜，来诱导蛋白质的表达。然后将此培养液离心，收集得到的细胞被悬浮在10mmol/L β-巯基乙醇和0.1mmol/L EDTA的1×PBS中，进行冰浴超声破碎。得到的菌液再在4℃以15000rpm离心30分钟。上清液上样至经过1×PBS溶液平衡之后的2mL的GST-谷胱甘肽亲和柱(购自Pharmacia)，再用30倍柱体积的1×PBS洗脱不具亲和性的自由蛋白。最后按0.1mg/mL胶的量加入AIBV主蛋白酶或SARS-CoV主蛋白酶，在4℃酶切20小时后收集目的蛋白，并用SDS-PAGE检测纯度。
用pGSTM载体表达纯化重组蛋白Calbindin D28k过程各步骤中蛋白质组分的SDS-PAGE结果如图4所示。参照分子量标记5，可以发现泳道2所显示的大肠杆菌经诱导表达后总蛋白较之泳道1所显示的诱导表达前有约54kD的蛋白质大量出现。。
经过亲和层析和AIBV主蛋白酶切割之后的SDS-PAGE结果如图5所示。参照分子量标记2，可以确定泳道1显示的目标蛋白Calbindin D-28k的大小符合预期值。经检测，用1升大肠杆菌BL21(DE3)悬浮培养物表达Calbindin D28k，按0.1mg/ml胶的量加入AIBV主蛋白酶，于4℃酶切20小时左右可一步纯化获得70～80mg Calbindin D28k。
上述实施例中所涉及的具体实验方法可以参考Molecular CloningALABORATORY MANUAL(3rd Edition)(J.Sambrook，P.MacCallum，D.Russell，Cold Spring Harber Laboratory Press，2001)以及黄培堂等(2002)译的《分子克隆实验指南》。
本文中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等，均以引用的方式将其全部内容包括在本文中。
应当注意，本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，如果在文中没有特别说明，则本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
本文中所涉及的各种实验用品(包括但不限于化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等)之中，对于那些特殊的或不易获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，在本发明申请日之前，可以通过各种方式(例如购买、自行制备等)很方便地获得。
应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。例如，根据密码子简并原则或碱基互补原则所获得的功能基本相同的核酸分子，以及在对蛋白质功能不起主要作用的位点上进行氨基酸替换所得到的功能基本相同的蛋白质或多肽，均被认为落入了本发明的保护范围。
序列表<110>清华大学<120>基于冠状病毒主蛋白酶切割的表达载体及其应用<160>3<210>1<211>11<212>PRT<213>冠状病毒(Coronavirus)<400>1Thr Ser Ala Val Leu Gln Ser Gly Phe Arg Lys1 5 10<210>2<211>33<212>DNA<213>冠状病毒(Coronavirus)<400>2ACTAGTGCAG TTCTGCAGAG TGGTTTTAGG AAA 33<210>3<211>4990<212>DNA<213>人工序列<400>3ACGTTATCGA CTGCACGGTG CACCAATGCT TCTGGCGTCA GGCAGCCATC GGAAGCTGTG60GTATGGCTGT GCAGGTCGTA AATCACTGCA TAATTCGTGT CGCTCAAGGC GCACTCCCGT120TCTGGATAAT GTTTTTTGCG CCGACATCAT AACGGTTCTG GCAAATATTC TGAAATGAGC180TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT GTGAGCGGAT AACAATTTCA240CACAGGAAAC AGTATTCATG TCCCCTATAC TAGGTTATTG GAAAATTAAG GGCCTTGTGC300AACCCACTCG ACTTCTTTTG GAATATCTTG AAGAAAAATA TGAAGAGCAT TTGTATGAGC360
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CACATTTAAT GTTGATGAAA GCTGGCTACA GGAAGGCCAG ACGCGAATTA TTTTTGATGG4980CGTTGGAATT 4990
权利要求
1.一种表达载体，其中包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的表达载体，其中，所述核苷酸序列如SEQ IDNO2所示。
3.如权利要求1或2所述的表达载体，其中，所述表达载体中还包含GST基因和多克隆位点，并且所述核苷酸序列位于GST基因和多克隆位点之间。
4.如权利要求3所述的表达载体，其中，所述表达载体为pGSTM，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
5.如权利要求1或2所述的表达载体，其中，所述载体中还包含编码亲和标签的基因。
6.如权利要求5所述的表达载体，其中，所述亲和标签选自由His-Tag、麦芽糖结合蛋白和硫氧还蛋白所构成的组。
7.一种制备重组蛋白的方法，该方法包括1)将编码目标蛋白的基因克隆到权利要求3-6之一所述的表达载体中；2)利用步骤1)中所获得的表达载体转化宿主细胞；3)培养步骤2)中所获得的宿主细胞；4)通过亲和层析，从步骤3)中所获得的细胞中分离纯化出包含目标蛋白的重组融合蛋白；5)利用禽传染性支气管炎病毒主蛋白酶或SARS冠状病毒主蛋白酶对步骤4)中所获得的重组融合蛋白进行切割，得到目标蛋白。
8.一种试剂盒，其中包含权利要求1-6之一所述的表达载体以及一种工具酶，所述工具酶选自由禽传染性支气管炎病毒主蛋白酶和SARS冠状病毒主蛋白酶所构成的组。
9.一种向目标蛋白中引入特异性切割位点的方法，该方法包括向包含该目标蛋白编码基因的表达载体中，引入一段核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
全文摘要
本发明提供了一种表达载体，其中包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SARS－CoV以及AIBV主蛋白酶所切割的特异性底物序列。本发明的表达载体中还可以包含编码亲和标签的基因，例如GST、His－Tag、麦芽糖结合蛋白和硫氧还蛋白。本发明还提供了一种利用所述表达载体制备重组蛋白的方法，可以利用SARS－CoV以及AIBV主蛋白酶作为工具酶，对亲和层析后的融合蛋白质进行切割，以获得高纯度的目标蛋白。本发明还提供了一种包含本发明的表达载体以及一种工具酶的试剂盒。
文档编号C07K14/00GK1673376SQ200510063088
公开日2005年9月28日 申请日期2005年4月6日 优先权日2004年12月10日
发明者饶子和, 杨海涛, 金英花, 薛晓宇, 杨楷林 申请人:清华大学