专利名称：一种新的重组人干扰素α2b的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物蛋白的分裂纯化方法，更具体地说，涉及一种新的重组人干扰素α2b的分离纯化方法。
背景技术：
重组人干扰素α2b具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用。干扰素与细胞表面受体结合诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞内繁殖，提高免疫功能，包括增强巨噬细胞的吞噬功能、增强淋巴细胞对靶细胞的细胞毒性和天然杀伤性细胞的功能。
文献报道的重组人干扰素α2b的纯化方法主要有两大类，亲和层析法和非亲和层析法。亲和层析法得到的重组人干扰素α2b的纯度一般达96％以上，回收率也一般达60％(阎玉清，王晓沁，巫爱珍等.人干扰素α2b生产工艺的研究.生物工程学报，1996，12(1)232271)，但其缺点是亲和层析柱价格昂贵，使用次数有限，清洗、再生和保存烦琐，载量也不适合大规模生产，所以难以应用到工业化生产规模；另一方面，在纯化过程中鼠IgG易从亲和层析上脱落，导致异源蛋白的污染，而非亲和层析方法则可避免上述缺点，从而大大降低成本。
目前工业化生产的重组人干扰素α2b多以不溶性包涵体形式表达。不溶性包涵体的形成有两个主要原因(1)重组人干扰素α2b在大肠杆菌中的高效表达，产量很高，容易相互聚集形成包涵体，(2)含二硫键的重组人干扰素α2b在大肠杆菌胞浆中表达，因处在还原状态的细胞环境中，重组人干扰素α2b会形成错误的二硫键，导致形成沉淀。
所以，在工业化生产重组人干扰素α2b的过程中，需要在裂解、溶解后，经过变性、复性的过程才能得到与天然构象相似的结构，因此纯化工艺必须摸索出恰当的条件，保证表达的重组人干扰素α2b恢复到天然构象。
为此目的，现有的工业化生产重组人干扰素α2b的工艺都是采用盐析与超滤脱盐、盐浓度梯度洗脱与透析等流程，它们普遍存在的问题是(1)复性效率低传统的稀释复性法对样品几十倍、甚至上百倍的稀释会使样品的体积急剧增大，给后续的分离纯化带来很大的困难，而且复性过程中需要较大的复性容器；透析法耗时较长，而且要多次更换透析溶液。这两种方法的共同缺点是蛋白质在复性过程中会发生聚集而产生大量沉淀，复性效率低，通常蛋白质的活性回收率只有5-20％，而且复性后的蛋白质溶液中含有大量的杂蛋白，需要进行进一步的分离纯化；(2)工艺路线烦琐，生产周期长在传统的重组蛋白质分离纯化工艺中，大多采用经典的软凝胶分离介质，由于这种介质的颗粒较大，分离效率较差，因此常常需要采用多种不同模式的色谱操作联用对目标蛋白质进行纯化，才能得到纯度符合一定标准的目标蛋白质。另外，这种色谱介质的耐压性很差，只能在流速较低的情况下进行操作，分离纯化时间较长；分离纯化步骤多和分离时间长使得蛋白质的质量回收率和活性回收率很低；而且在传统的重组蛋白质生产工艺中，蛋白质的复性和纯化是生产过程中两个独立的单元操作，也在很大程度上制约着生产效率；(3)生产成本高，设备投资大由于复性和分离纯化分别单独进行，而且分离纯化步骤多，每一步都需要有与之配套的设备，致使设备投资大，生产成本高，随着生产规模的增加，这种弊端会愈来愈严重。
发明内容
本发明提供了一种新的重组人干扰素α2b的分离纯化方法，其包括下述步骤(1)破碎发酵完毕的重组人干扰素α2b大肠杆菌工程菌，离心得沉淀；(2)将沉淀按1∶5-20(重量/体积)比例加入4M尿素/TE溶液，离心得沉淀；
(3)将沉淀按1∶5-25(重量/体积)比例加入Tris-HCl溶液，离心得沉淀；(4)将沉淀按1∶2-10(重量/体积)加入8M盐酸胍+DTT裂解液，离心，取上清液，测蛋白含量；(5)将上清液倒入H3BO3溶液中搅拌均匀，稀释后的溶液蛋白含量为0.15-0.08mg/ml，复性，得复性液；(6)向复性液中缓慢滴加6M HCl，调PH2.0-3.0，离心，收集上清液，缓慢滴加6M NaOH(体积/体积)，调PH 7.8-8.0；(7)将硫酸铵粉末缓慢加入上清液中，溶解后过滤，取滤液；(8)依次进行疏水柱M1柱层析、CM-Sepharose柱层析、疏水柱M2柱层析和S-100分子筛层析。
在上述的方法中，在步骤(5)中优选地分两步达到最终浓度，首先将上清液在H3BO3溶液中稀释至蛋白含量为2-10mg/ml，然后再在H3BO3溶液中稀释至蛋白含量为0.15-0.08mg/ml。
在上述的方法中，在步骤(5)中，复性优选地是在2-10℃静置10-24小时。
在上述的方法中，在步骤(8)中，疏水柱M1柱层析优选地如下进行将疏水凝胶均匀装入处理好的柱内，用1M硫酸铵平衡液平衡5-15个柱体积后上样；用1M硫酸铵溶液洗脱1-5个柱体积至基线平衡后，再用0.5M硫酸铵洗脱液洗脱，收集洗脱峰。
在上述的方法中，在步骤(8)中，CM-Sepharose柱层析优选地如下进行将CM-Sepharose凝胶均匀装入处理好的柱内，用25mM AAB平衡液平衡5-15个柱体积后上样；更换25mMAAB(300mM NaCl)缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
在上述的方法中，在步骤(8)中，疏水柱M2柱层析优选地如下进行将疏水凝胶均匀装入处理好的柱内，用1M(NH4)2SO4平衡液平衡5-15个柱体积后上样；用1M硫酸铵溶液洗脱1-5个柱体积至基线平衡后，再用0.5M硫酸铵洗脱液洗脱，收集洗脱峰。
在上述的方法中，在步骤(8)中，S-100分子筛层析优选地如下进行将S-100凝胶均匀装入处理好的柱内，用0.1M PB缓冲液平衡1-5个柱体积，至流出液pH7.2±0.1后上样；用0.1M PB缓冲液洗脱，收集活性峰。
在步骤(8)的柱层析纯化步骤中，(a)疏水柱M1柱层析可以去除未正确折叠的干扰素α2b及干扰素α2b多聚体，复性率超过30％；(b)CM-Sepharose柱层析可以去除热原质；(c)疏水柱M2柱层析可以浓缩样品并有复性作用，重组人干扰素α2b尽可能地接近了天然干扰素α2b的构象；(d)S-100柱层析可以更换缓冲系统，去除干扰素α2b多聚体。
本工艺减少了纯化步骤，进行纯化过程的集成，使工艺流程顺畅，无迂回，生产配置无瓶颈。本工艺CM、疏水柱M2、S-100可以在一天内完成上样洗脱的过程。疏水柱层析可以采用扩张床技术，为大规模自动化生产的再放大提供了可能。
本工艺采用疏水层析技术，柱胶便宜，柱胶清洗、再生容易，载量大，细菌或细胞裂解液可直接上样，不需预处理，在国际上已成为一种大规模自动化首选的纯化工艺。
具体实施例方式
下面以实施例进一步解释本发明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。
实施例1初制干扰素1、TE洗菌将菌体取出，置流水中迅速溶化，加入预冷的TE溶液，搅匀，4℃ 4000转/分离心20分钟，弃上清留沉淀。
2、超声破菌将悬浊菌液置冰浴环境中，1分钟/次，间隔1分钟，超声25-30次。显微镜检查，破菌率应大于98％。按工程菌重量1∶5(重量/体积)比例加入预冷的TE溶液，搅匀，4℃，10000转/分，离心20分钟，弃上清，称沉淀重量。
3、尿素溶解沉淀按1∶10(重量/体积)比例加入预冷的4M尿素/TE溶液，吹打均匀，4℃ 10000转/分离心25分钟，弃上清留沉淀，称沉淀重量。
4、Tris-HCl洗涤沉淀按1∶15(重量/体积)比例加入预冷的Tris-HCl溶液，吹打均匀后4℃ 10000转/分离心30分钟，弃上清留沉淀，称沉淀重量。
5、盐酸胍裂解沉淀按1∶10(重量/体积)加入8M盐酸胍+DTT裂解液，室温裂解2小时。取裂解后菌液18000转/分离心30分钟，弃沉淀，取上清，记录体积，取样测蛋白含量。
6、硼酸复性6.1首次稀释将5获得的上清液入装有H3BO3溶液的不锈钢桶中，搅拌均匀，稀释后的溶液蛋白含量为4mg/ml。
6.2二次稀释将6.1溶液倒入装有H3BO3溶液的不锈钢桶中，搅拌均匀，稀释后的溶液蛋白含量为0.1mg/ml。放置2-8℃冰箱复性过夜。
7、调PH值，离心将复性液边搅拌边缓慢滴加6M HCl，调PH2.0-3.0，于2-8℃放置2小时后，以18000转/分连续离心，蠕动泵流速(400ml/min，)收集的上清液边搅拌边缓慢滴加6M NaOH(体积/体积)调PH 7.8-8.0。
8、盐溶，过滤将硫酸铵粉末缓慢加入7上清液中，边加边搅拌，完全溶解后用滤膜过滤盐溶液，滤液即初制干扰素。
干扰素原液1、疏水柱M1层析将疏水凝胶均匀装入处理好的柱内，用1M硫酸铵平衡液平衡约10个柱体积后上样。加样结束后，用1M硫酸铵溶液洗脱约2个柱体积至基线平衡后，再用0.5M硫酸铵洗脱液洗脱，收集洗脱峰。
2、CM-Sepharose柱层析将CM-Sepharose凝胶均匀装入处理好的柱内，用25mM AAB平衡液平衡约10个柱体积后上样。更换25mMAAB(300mM NaCl)缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
3、疏水柱M2层析将疏水凝胶均匀装入处理好的柱内，用1M(NH4)2SO4平衡液平衡约10个柱体积后上样。加样结束后，用1M硫酸铵溶液洗脱约2个柱体积至基线平衡后，再用0.5M硫酸铵洗脱液收集洗脱峰。
4、S-100分子筛层析将S-100凝胶均匀装入处理好的柱内，用0.1M PB缓冲液平衡约2个柱体积至流出液pH7.2±0.1后上样。用0.1M PB缓冲液，收集活性峰。
通过以上工艺可使重组人干扰素α2b最终产品的纯度≥98％，多聚体含量≤5％，比活性≥2.5×108IU/mg，产量提高15倍。具体鉴别和相关项目检验方法如下。
1、生物学活性测定用细胞病变抑制法，Wish细胞/VSV为检测系统。用国家参考标准品校准。
2、蛋白含量采用Lowry-微量法，使用国家检定所提供的标准蛋白为标准品。
3、比活性测定将原液的蛋白浓度及活性单位数代入下计算待测样品的比活性比活性(IU/mg)＝活性单位数(IU/ml)/蛋白质含量(mg/ml)本品的比活性不低于2.5×108IU/mg蛋白方可判定合格。
4、纯度4.1电泳纯度采用非还原型SDS-PAGE电泳方法，加样量不低于5μg(银染法)或10μg(考马斯亮蓝染色法)，经扫描仪扫描，纯度应不小于98％4.2.高效液相色谱纯度
Waters或其它型号HPLC仪性能、尺寸相应的排阻层析HPLC柱，检测波长280nm，结果应为单一吸收峰，或主峰占总面积98％以上5、分子量测定采用还原型SDS-PAGE电泳方法，加样量不低于5μg(银染法)或10μg(考马斯亮蓝染色法)，加分子量标准蛋白参照物，制品的分子量与理论值比较，误差不超过10％，应为19.2kD±1.92kD。
6、内毒素含量细菌内毒素含量应小于5EU/300万IU。
7、残余外源性DNA含量用固相斑点杂交法，以地高辛标记核酸法测定，其含量应少于100pg/剂量。
8、宿主菌蛋白残留量用ELISA酶标法或其它敏感方法测定，宿主菌蛋白残留量不得超过总蛋白的0.05％9、残余抗生素活性应用微生物学方法测定，使用2号培养基及26003号金黄色葡萄球菌，不应有残余氨苄青霉素活性。
10、等电点测定采用先预聚焦，后加样聚焦方法进行，rhIFN-α2b的等电点在5.7-6.7之间，且批间一致。
11、紫外光谱扫描应有固定的最大吸收值278±3nm，批与批之间应一致。
12、肽图测定(至少每半年测定1次)用CNBr裂解SDS-PAGE电泳，待测样品应符合α2b的图形，或用胰酶裂解C18柱反相色谱分析，批间一致，并与对照品一致。
13、N-末端氨基酸序列(至少每年测定1次)应为(Met)-Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-Hi s-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-(Leu)。
采用上述方法生产的三批产品的相关项目如表1所示。
表1
实施例2本临床试验证明，采用本工艺研制的注射用重组人干扰素α2b的安全性和抗HBV疗效与原工艺生产的产品相当，二者在疗效上无显著性差异，并均具有良好的安全性。
临床方案及数据如下本研究采用多中心、随机双盲、阳性药物平行对照的试验方法，以北京凯因生物技术有限公司原工艺生产的注射用重组人a-2b干扰素作对照，评价该公司采用新工艺研制的注射用重组人α-2b干扰素治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的安全性和有效性。ITT人群为225例，脱落20例，脱落率为8.88％；PP人群为205例，其中完成试验全过程205例(91.71％)，17例仅完成治疗未随访观察。试验组和对照组受试者的基本人口学资料、主要基线值及慢性乙型肝炎病程比较无统计学差异，表明二组之间具有可比性。
研究结果显示治疗24周结束时，PP人群中，新工艺研制的重组人α-2b干扰素组(A组)完全抗病毒应答为3.09％，部分应答45.36％；原工艺生产的重组人α-2b干扰素组(B组)抗病毒完全应答为6.48％，部分应答为36.11％；总应答率A组为48.45％，B组为42.59％，二组无显著性差异。
治疗结束时，PP人群中，A组生化完全应答为44.33％，部分应答16.49％；B组生化完全应答41.12％，部分应答20.56％；总应答率A组为60.82％，B组为61.32％，二组无显著性差异。
随访结束时，PP人群中，A组完全抗病毒应答22.73％，部分应答39.77％；B组抗病毒完全应答19.00％，部分应答42.00％；总应答率A组为62.50％，B组为61.00％，二组无显著性差异。
随访结束时，PP人群中，A组生化完全应答为52.94％，部分应答7.06％；B组生化完全应答38.54％，部分应答16.67％；总应答率A组为60.00％，B组为55.20％，二组无显著性差异。
试验过程中共发生不良医学事件292例次，均为一般性不良医学事件，其中286例次(97.60％)发生在治疗期间(A组132例次，B组154例次)，多发生在接受治疗的头4周内。多数不良医学事件与临床上用α-2b干扰素治疗慢性乙型肝炎患者常见的副作用相似，因此判断其发生与治疗药物有关或可能有关；除4例受试者因不良医学事件自行退出试验外，均未因不良医学事件中断试验，表明试验药物和对照药物均具有良好的安全性。
实施例3本稳定性试验证实，本发明的工艺生产的产品的稳定性符合质量要求。
方法1.稳定性重点考查项目成品的外观、溶解性、澄清度、生物学活性、pH值其它检测项目无菌试验、水分。
(1)成品的外观、溶解性、澄清度测定方法见《中华人民共和国药典》附录IX A、B及《中国生物制品规程》(2)生物学活性测定方法用细胞病变抑制法，Wish细胞/VSV为检测系统。用国家参考标准品校准。
(3)pH值测定方法见《中华人民共和国药典》附录VI H(4)无菌试验见《中国生物制品规程》通则“生物制品无菌试验规程”A项进行。
(5)水分见《中华人民共和国药典》附录VI H2.长期试验见《中华人民共和国药典》附录XIX C“药物稳定性试验指导原则”。供试品于2-8℃及25±2℃放置12个月，每3个月取样一次，分别于0个月、3个月、6个月、9个月、12个月，按稳定性重点考查项目进行检测，12个月后继续考查，分别于18个月、24个月、36个月取样进行检测，将结果与0月比较，对结果进行统计分析。在试验结束时做无菌试验、水分检测，将结果与0月比较。
结果与分析1.测定结果(1)2-8℃条件下生产工艺重大改革后(即本发明的工艺，下同)粉针连续3批生产样品稳定性考查结果见表2。
(2)室温条件(25±2℃)生产工艺重大改革后粉针连续3批生产样品稳定性考察结果见表3。
2.结果分析(1)外观、溶解性、澄清度、pH值、无菌实验等指标变化①连续3批注射用重组人干扰素α2b成品于2-8℃实际存放条件下，12个月后成品外观、溶解性、澄清度、pH值、水分未发现变化，无菌试验均合格。
②连续3批注射用重组人干扰素α2b成品于室温留样存放条件下，12个月后成品外观、溶解性、澄清度、pH值、水分未发现变化，无菌试验均合格。
(2)生物学活性变化生产工艺改革后连续3批成品2-8℃实际存放条件下经12个月后生物学活性较稳定，与改革前粉针对照样品比较无差异，预测生产工艺重大改革后的成品的有效期与改革前冻干粉针效期一致。
结论生产工艺改革后的注射用重组人干扰素α2b在2-8℃实际保存条件下及室温条件下12个月内生物学活性稳定。
表2注射用重组人干扰素α2b重大工艺改革样品2-8℃稳定性试验试验条件2-8℃试验样品注射用重组人干扰素α2b(冻干粉针)，重大工艺改革300万IU/支规格样品生产日期2004年5月包装2ml管制抗生素瓶，丁基抗生素瓶塞，铝塑组合盖
表3注射用重组人干扰素α2b重大工艺改革样品25℃稳定性试验试验条件25±2℃，60％±5％试验样品注射用重组人干扰素α2b(冻干粉针)，300万IU/支规格样品生产日期2000年2月 包装2ml管制抗生素瓶，丁基抗生素瓶塞，铝塑组合盖
权利要求
1.一种新的重组人干扰素α2b的分离纯化方法，其包括下述步骤(1)破碎发酵完毕的重组人干扰素α2b大肠杆菌工程菌，离心得沉淀；(2)将沉淀按1∶5-20(重量/体积)比例加入4M尿素/TE溶液，离心得沉淀；(3)将沉淀按1∶5-25(重量/体积)比例加入Tris-HCl溶液，离心得沉淀；(4)将沉淀按1∶2-10(重量/体积)加入8M盐酸胍+DTT裂解液，离心，取上清液，测蛋白含量；(5)将上清液倒入H3BO3溶液中搅拌均匀，稀释后的溶液蛋白含量为0.15-0.08mg/ml，复性，得复性液；(6)向复性液中缓慢滴加6M HCl，调PH2.0-3.0，离心，收集上清液，缓慢滴加6M NaOH(体积/体积)，调PH7.8-8.0；(7)将硫酸铵粉末缓慢加入上清液中，溶解后过滤，取滤液；(8)依次进行疏水柱M1柱层析、CM-Sepharose柱层析、疏水柱M2柱层析和S-100分子筛层析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中分两步达到最终浓度，首先将上清液在H3BO3溶液中稀释至蛋白含量为2-6mg/ml，然后再在H3BO3溶液中稀释至蛋白含量为0.15-0.08mg/ml。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，复性是在2-10℃静置10-24小时。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(8)中，疏水柱M1柱层析如下进行将疏水凝胶均匀装入处理好的柱内，用1M硫酸铵平衡液平衡5-15个柱体积后上样；用1M硫酸铵溶液洗脱1-5个柱体积至基线平衡后，再用0.5M硫酸铵洗脱液洗脱，收集洗脱峰。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(8)中，CM-Sepharose柱层析如下进行将CM-Sepharose凝胶均匀装入处理好的柱内，用25mM AAB平衡液平衡5-15个柱体积后上样；更换25mMAAB(300mMNaCl)缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(8)中，疏水柱M2柱层析如下进行将疏水凝胶均匀装入处理好的柱内，用1M(NH4)2SO4平衡液平衡5-15个柱体积后上样；用1M硫酸铵溶液洗脱1-5个柱体积至基线平衡后，再用0.5M硫酸铵洗脱液洗脱，收集洗脱峰。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(8)中，S-100分子筛层析如下进行将S-100凝胶均匀装入处理好的柱内，用0.1M PB缓冲液平衡1-5个柱体积，至流出液pH7.2±0.1后上样；用0.1M PB缓冲液洗脱，收集活性峰。
全文摘要
本发明涉及一种新的重组人干扰素α2b的分离纯化方法，其包括下述步骤破碎重组人干扰素α2b大肠杆菌工程菌，尿素溶解，Tris－HCl洗涤，盐酸胍裂解，硼酸复性，调pH值，盐溶，疏水柱M 1柱层析，CM－Sepharose柱层析，疏水柱M2柱层析和S－100分子筛层析。本方法减少了纯化步骤，进行纯化过程的集成，使工艺流程顺畅，无迂回，生产配置无瓶颈，为大规模自动化生产的再放大提供了可能。
文档编号C07K1/00GK1749274SQ200510080478
公开日2006年3月22日 申请日期2005年7月5日 优先权日2005年7月5日
发明者张春丽 申请人:北京凯因生物技术有限公司