专利名称：一种cyp4a11多肽及抗人cyp4a11多肽抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽及该多肽抗体的制备方法。
背景技术：
CYP4A11是细胞色素P450 4A亚型之一，主要分布在肝脏和肾脏，其可以催化多种脂肪酸(月桂酸等)的代谢，调节体内脂类代谢平衡。研究发现，CYP4A11催化内源性花生四烯酸代谢生成20-羟基花生四烯酸(20-HETE)，而20-HETE与原发性高血压形成有关。此外，另有研究表明CYP4A11还参与防御紫外线氧化损伤的机制。由于目前使用的基因重组人CYP4A11(#RDI-CYP4A11abrhttp//www.researchd.com/cyp450/cyp4alab.htm提供兔抗人CYP4A11抗体，以纯化人肝脏CYP4A11蛋白为抗原，用于免疫印迹试验。)价格昂贵，制备的抗体成本过高，而且安全度低。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前使用的人CYP4A11价格昂贵，制备的抗体成本过高，而且安全度低的问题，而提供的一种CYP4A11多肽及抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法。CYP4A11多肽的氨基酸序列为ArgLeuArgArgLeuProAsnProCysGluAspLysAspGlnLeu。抗人CYP4A11多肽抗体按以下步骤制备(一)CYP4A11抗原表位的分析利用DNAStar软件分析，确定CYP4A11蛋白505～519位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列；(二)CYP4A11多肽的合成多肽自动合成仪合成，并纯化；(三)CYP4A11多肽与载体蛋白交联CYP4A11多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法，然后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析8～12h，交联形成CYP4A11-KLH；(四)制备兔抗CYP4A11多肽抗体将乳化后的CYP4A11-KLH在兔背部皮下注射，并反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶10000；(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP4A11多肽抗体，即得到抗人CYP4A11多肽抗体。本发明中的CYP4A11多肽具有优异的亲水性结构(hydrophilicity)、柔性区(flexibility)、抗原指数(antigenicity)及表面概率结构(surface probability)。本发明制备的抗人CYP4A11多肽抗体效价高，特异性好，可与天然人CYP4A11分子发生特异结合反应；本发明抗体制备成本低，只有用重组抗原制备抗体成本的十分之一，并且安全可靠性高于重组抗原制备的抗体；而且本发明制备的抗人CYP4A11多肽抗体能够满足免疫组化、免疫印迹和酶联免疫吸附实验的要求，可用于建立体外免疫分析，为兔抗人CYP4A11分子的研究及相关疾病的研究提供一个有力工具，具有重要的理论意义和临床价值。
图1是DNAstar软件分析人CYP4A11蛋白序列的数据分析结果图；图2是抗血清相对亲和力常数测定结果图，图中 曲线为浓度是10mg/L的CYP4A11-BSA的OD450值，图中 曲线为浓度是5mg/L的CYP4A11-BSA的OD450值；图3是抗体Western blot分析凝胶电泳图，图中“M”泳道标样为Marker，图中“1和6”泳道标样为CYP4A11-BSA，图中“2和5”泳道标样为BSA，图中“3和4”泳道标样为人肝脏微粒体蛋白，“1、2和3”泳道蛋白经电泳、转膜后加纯化后的抗CYP4A11抗体，“4、5和6”泳道蛋白经电泳、转膜后加纯化后的抗CYP4A11抗体和CYP4A11多肽；图4是正常人肝脏组织HE染色图(×400)；图5是抗人CYP4All多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP4A11结合图(×100)；图6抗人CYP4A11多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP4A11结合图(×400)。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式CYP4A11多肽的氨基酸序列为ArgLeuArgArgLeuProAsnProCysGluAspLysAspGlnLeu。
具体实施方式
二本实施方式抗人CYP4A1l多肽抗体按以下步骤制备(一)CYP4A11抗原表位的分析利用DNAStar软件分析，确定CYP4A11蛋白505～519位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列；(二)CYP4A11多肽的合成多肽自动合成仪合成，并纯化；(三)CYP4A11多肽与载体蛋白交联CYP4A11多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法，然后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析8～12h，交联形成CYP4A11-KLH；(四)制备兔抗CYP4A11多肽抗体将乳化后的CYP4A11-KLH在兔背部皮下注射，并反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶10000；(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP4A11多肽抗体，即得到抗人CYP4A11多肽抗体。
本实施方式利用DNAStar软件分析CYP4A11蛋白序列，蛋白序列分析结果如图1所示，CYP4A11蛋白505～519位氨基酸(多肽)具有优异的亲水性结构(hydrophilicity)、柔性区(flexibility)、抗原指数(antigenicity)及表面概率结构(surface probability)。本实施方式抗体经过纯化后纯度为96.9％，可作为抗原免疫动物，安全可靠性高。本实施方式中所使用的兔子为健康日本大耳白兔。本实施方式于耳中央动脉采血测定抗体的效价。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤(二)中采用常规C18的RP-HPLC柱进行纯化。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤(三)中CYP4A11多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法按重量份数比将4～6份经过纯化的CYP4A11多肽加入到6～8份载体蛋白KLH中，然后均匀、缓慢地加入0.5～1.5份浓度为3g/L的戊二醛溶液，室温环境下作用2±0.5h。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
四的不同点是步骤(三)中的戊二醛溶液配制后3h内使用。其它步骤与实施方式四相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤(四)中取CYP4A11-KLH与等体积的完全福氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射点为4点，每点注射100μg，首次免疫注射后第2周进行第一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同；加强免疫注射CYP4A11-KLH用不完全福氏佐剂乳化；每次加强免疫注射7天后测定抗体效价。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤(四)中反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶32000。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤(五)中采用颈动脉取血收集含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的兔血。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤(五)中采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP4A11多肽抗体(1)将含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的血清用浓度为60mmol/L、pH值为4.0的醋酸钠缓冲液稀释3～4倍，再用浓度为0.1mol/L的NaOH调节pH值至4.5；(2)向步骤(1)的混合液中缓慢加入含量为98.5％的辛酸至混合液中辛酸浓度为25mL/L；(3)室温条件下搅拌混合液30min，在4℃、10000g的条件下离心30min，再用滤孔直径为0.22μm的滤膜过滤上清液；(4)向滤液中加入滤液1/10体积的10×PBS，并用浓度为0.1mol/L的NaOH调节pH值至7.4，然后缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至滤液中硫酸铵饱和度为45％；(5)加入硫酸铵的滤液在4℃环境下静置8～12h，然后在4℃、3000g的条件下离心30min，弃去上清夜，沉淀用浓度0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液重悬，透析8～12h。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
九的不同点是步骤(五)(2)中辛酸为正辛酸。其它步骤与实施方式九相同。
具体实施方式
十一本实施方式抗人CYP4A11多肽抗体按以下步骤制备(一)CYP4A11抗原表位的分析利用DNAStar软件分析，确定CYP4A11蛋白505～519位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列；(二)CYP4A11多肽的合成多肽自动合成仪合成，并纯化；(三)CYP4A11多肽与载体蛋白交联CYP4A11多肽与载体蛋白KLH和载体蛋白BSA采用戊二醛连接法，将5mg经过纯化的CYP4A11多肽分别加入到7mg KLH和BSA中，然后均匀、缓慢地加入1mg浓度为3g/L的戊二醛溶液(配制后1h内使用)，在室温环境下作用2h，之后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析9～11h，交联形成CYP4A11-KLH和CYP4A11-BSA，无菌分装保存于-80℃的环境中；(四)制备兔抗CYP4A11多肽抗体将乳化后的CYP4A11-KLH在日本大耳白兔背部皮下注射，并反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶32000；(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP4A11多肽抗体，即得到抗人CYP4A11多肽抗体；(六)人肝脏微粒体蛋白制备(1)取10g人正常肝脏(人正常肝脏来自于死亡时间未到24h的意外死亡者或肝脏未发生病变的死亡者)剪碎，用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后加入100～150mL磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆，(2)将肝匀浆在4℃、10000g的条件下离心30min，之后取上清液在30000g的条件下离心60min，再在100000g的条件下离心60min，然后取粉红色沉淀悬浮于磷酸钾盐缓冲液(含有200mL/L甘油，5g/L胆酸钠，2mg/L抑肽酶，2mg/L亮肽素，1mg/L胃酶抑素及1mmol/L苯甲基磺酰氟)中，(3)用Bradford法进行蛋白定量、分装后置于-80℃环境中保存。
本实施方式采用ELISA检测抗血清效价ELISA检测板用浓度为1mg/L的CYP4A11-BSA包被，每孔包被物100μL，在4℃条件下孵育8～12h，然后每孔加入200μL浓度为100mL/L的牛血清，在37℃的条件下封闭2h后洗涤，加入倍比稀释2倍的含有兔抗人CYP4A11多肽抗体血清(对照组加入正常兔血清)，37℃条件下孵育30min，经过3次洗涤后每孔加入5000倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG100μL，再在37℃条件下孵育15min，洗涤3次后进行TMB显色，37℃条件下孵育15min后用酶标仪测定样品在A450的吸光值，再用Multiskan Transmit软件分析可得出抗体效价，本实施方式抗体效价为1∶32000。
本实施方式采用间接ELISA检测抗血清相对亲和常数ELISA检测板分别用浓度为5mg/L和10mg/L的CYP4A11-BSA包被，并用浓度为100mL/L的牛血清封闭，然后加入已知蛋白浓度的纯化多抗，再加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗后OPD显色测定OD450值，显色测定的OD450值如图2所示，通过公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]t-2[Ab]t)(其中[Ab’]t、[Ab]t指的是分别包被5mg/L和10mg/L时抗体半饱和[OD50]时抗体的摩尔浓度，[Ag]t，[Ag’]t指的是包被的抗原浓度，n＝[Ag]t/Ag’]t，本实施方式中n＝2)计算，结果表明相对亲和力常数在105～106M-1。
本实施方式进行抗体的Western blot分析，采用合成肽竞争法鉴定抗体的特异性，用2×SDS上样缓冲液悬浮制备的人肝脏微粒体蛋白、CYP4A11-BSA及BSA，先95℃加热5min，置于冰上冷却10min，再上样，上样量分别为70μg、15μg、15μg，然后以标准蛋白Marker为中心两侧对称同时上样，经SDS-PAGE分离后，以湿转法电转至硝酸纤维素膜上；经脱脂奶粉封闭(室温1h)后将凝胶按泳道切割，取出备用，Marker泳道两边的凝胶上样中分别加入1∶1000稀释纯化后抗体和1∶1000稀释纯化后抗体加等量合成肽(4℃过夜，以0.05％Tween-20TBS洗膜3次)，然后加入1∶10000 HRP-山羊抗小鼠IgG(室温孵育1h，以0.05％Tween-20TBS洗膜3次)；之后所有凝胶用化学发光剂试剂盒(ECL Plus)处理5min后，于暗室曝光到X光胶片上，显影、定影。本实施方式抗体Western blot分析凝胶电泳结果如图3所示，抗血清与人肝脏微粒体蛋白在Mr大约为53000处出现1条清晰的带，与CYP4A11的分子量相符，由于是多克隆抗体，还出现一条非特异性结合条带；抗血清与CYP4A11-BSA在Mr大约为69000处出现1条清晰的带，与BSA分子量相符；抗血清与BSA则无条带出现；说明所制备的抗体可识别含有半抗原的抗原表位的蛋白并能与天然CYP4A11蛋白结合。而在加入CYP4A11多肽的“4、5和6”泳道中相应条带均明显消失或变浅，这也进一步证实制备的抗体即为抗CYP4A11合成肽的抗体。
本实施方式进行抗体的免疫组化染色，取出用丙酮固定的冰冻人肝脏切片，滴加5％BSA，室温下5％BSA封闭20min，加入1∶1000稀释兔抗人CYP4A11多肽抗体，4℃孵育过夜，再用PBS洗片后加入羊抗兔IgG-HRP，37℃孵育20min，PBS洗片后进行DAB显色，苏木素复染，返蓝后，脱水、透明、封片，镜检，放大100倍和400倍拍照记录结果。免疫组化染色实验图片如图4～6所示，图4为正常人肝脏组织HE染色图(×400)；图5为抗人CYP4A11多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP4A11结合图(×100)，图5中箭头所指为肝脏血管内皮，无着色；图6为抗人CYP4A11多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP4A11结合图(×400)，图6中箭头所指为细胞胞浆中棕黄色颗粒。CYP4A11蛋白位于细胞的内质网，免疫组化实验胞浆明显着色，而细胞核和无内质网的血管内皮没有着色，由此证明，抗人CYP4A11的抗体可以与正常肝脏组织中的CYP4A11蛋白结合。
序列表<110>哈尔滨医科大学<120>一种CYP4A11多肽及抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法<160>1<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CYP4A11多肽，用于制备抗人CYP4A11多肽抗体。
<400>1Arg Leu Arg Arg Leu Pro Asn Pro Cys Glu Asp Lys Asp Gln Leu1 5 10 1权利要求
1.一种CYP4A11多肽，其特征在于CYP4A11多肽的氨基酸序列为ArgLeuArgArgLeuProAsnProCysGluAspLysAspGlnLeu。
2.抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法，其特征在于抗人CYP4A11多肽抗体按以下步骤制备(一)CYP4A11抗原表位的分析利用DNAStar软件分析，确定CYP4A11蛋白505～519位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列；(二)CYP4A11多肽的合成多肽自动合成仪合成，并纯化；(三)CYP4A11多肽与载体蛋白交联CYP4A11多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法，然后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析8～12h，交联形成CYP4A11-KLH；(四)制备兔抗CYP4A11多肽抗体将乳化后的CYP4A11-KLH在兔背部皮下注射，并反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶10000；(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP4A11多肽抗体，即得到抗人CYP4A11多肽抗体。
3.根据权利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法，其特征在于步骤(二)中采用常规C18的RP-HPLC柱进行纯化。
4.根据权利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法，其特征在于步骤(三)中CYP4A11多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法按重量份数比将4～6份经过纯化的CYP4A11多肽加入到6～8份载体蛋白KLH中，然后均匀、缓慢地加入0.5～1.5份浓度为3g/L的戊二醛溶液，室温环境下作用2±0.5h。
5.根据权利要求4所述的抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法，其特征在于步骤(三)中的戊二醛溶液配制后3h内使用。
6.根据权利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法，其特征在于步骤(四)中取CYP4A11-KLH与等体积的完全福氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射点为4点，每点注射100μg，首次免疫注射后第2周进行第一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同；加强免疫注射CYP4A11-KLH用不完全福氏佐剂乳化；每次加强免疫注射7天后测定抗体效价。
7.根据权利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法，其特征在于步骤(四)中反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶32000。
8.根据权利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法，其特征在于步骤(五)中采用颈动脉取血收集含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的兔血。
9.根据权利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法，其特征在于步骤(五)中采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP4A11多肽抗体(1)将含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的血清用浓度为60mmol/L、pH值为4.0的醋酸钠缓冲液稀释3～4倍，再用浓度为0.1mol/L的NaOH调节pH值至4.5；(2)向步骤(1)的混合液中缓慢加入含量为98.5％的辛酸至混合液中辛酸浓度为25mL/L；(3)室温条件下搅拌混合液30min，在4℃、10000g的条件下离心30min，再用滤孔直径为0.22μm的滤膜过滤上清液；(4)向滤液中加入滤液1/10体积的10×PBS，并用浓度为0.1mol/L的NaOH调节pH值至7.4，然后缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至滤液中硫酸铵饱和度为45％；(5)加入硫酸铵的滤液在4℃环境下静置8～12h，然后在4℃、3000g的条件下离心30min，弃去上清夜，沉淀用浓度0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液重悬，透析8～12h。
10.根据权利要求9所述的抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法，其特征在于步骤(五)(2)中辛酸为正辛酸。
全文摘要
一种CYP4A11多肽及抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法，它涉及一种多肽及该多肽抗体的制备方法。它解决了目前使用的人CYP4A11价格昂贵，而且抗体不能全部满足用于免疫印迹、免疫组织化学实验和酶联免疫吸附实验的问题。CYP4A11多肽的氨基酸序列为RLRRLPNPCEDKDQL。抗人CYP4A11多肽抗体按以下步骤制备(一)CYP4A11抗原表位的分析；(二)CYP4A11多肽的合成；(三)CYP4A11多肽与载体蛋白交联；(四)制备兔抗CYP4A11多肽抗体；(五)收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗人CYP4A11多肽抗体。本发明制备的抗人CYP4A11多肽抗体效价高，可与天然人CYP4A11分子发生特异结合反应；本发明抗体制备成本低；而且本发明制备的抗体能够满足免疫组化、免疫印迹和酶联免疫吸附实验的要求。
文档编号C07K16/18GK1916019SQ20061001048
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月4日 优先权日2006年9月4日
发明者朱大岭, 唐晓波, 杨微, 刘海英, 武正华, 吴红 申请人:哈尔滨医科大学