专利名称：东北野生大豆编码dreb转录因子基因及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因材料，本发明还涉及这种基因的克隆方法。
背景技术：
低温、干旱和盐碱等逆境条件严重影响作物的产量和质量，是制约我国东北地区乃至全国农业生产的重大问题。提高作物的耐低温、干旱和盐碱能力以及充分利用盐碱地资源开拓耕地面积是解决粮食安全的重要途径。近年来随着分子生物学和基因工程技术的迅猛发展，为进行抗逆分子育种研究提供了重要手段。进行抗逆分子育种要求有丰富的基因资源。近几年来，国内外在克隆植物渗透胁迫相关基因方面取得了一些进展，为分子育种提供了丰富的抗逆基因资源。
DREB(Dehydration Responsive Element Binding protein)转录因子是目前渗透胁迫分子生物学研究较为热点的蛋白因子。以模式植物拟南芥和水稻为材料，在基因分离、结构分析、功能鉴定等方面都做了很多研究，大量的研究表明，DREB转录因子在植物对渗透胁迫反应中起到非常重要的调控作用。而在抗逆性强的东北野生大豆方面尚未见报道。从野生资源中可望获得在渗透胁迫过程中起关键作用的基因，将为植物抗渗透胁迫基因工程提供了具有自主知识产权的基因资源。
发明内容本发明的目的在于提供一种在植物抗渗透胁迫过程中起关键作用的基因。
本发明基因的基本特征该基因包括1179bp的开放读码框，编码392个氨基酸，有ATG起始密码子和TAG终止密码子；在GsDREB内部具有转录因子特有的与DNA结合的结构域DREBP/AP2，其保守的氨基酸残基为RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三个平行的β-折叠和一个α-螺旋结构，可以与DNA的GCC-BOX结合，N端具有6个氨基酸的核定位序列(SRKRKS)。
它的序列及推测的氨基酸序列为1 TTTCATTGAGTACTGTGTGGCGAAGTTTGTGTCTTGGATTTTGTGGAC GGTGCTTAT1 M G A Y61 GATCAAGTTTCTCTTAAGCCATTGGATTCTTCTAGAAAGAGGAAAAGTAGGAGCAGAGGG5 D Q V S L K P L D S R S R G121GATGGGTCCAAATCTGTGGCTGAGACTATTGCAAAGTGGAAGGAATACAATGAGCATCTT25 D G S K S V A E T I A K W K E Y N E H L181TATTCTGGCAAAGATGATAGTAGAACAACTCGTAAGGCGCCGGCTAAAGGTTCGAAGAAA45 Y S G K D D S R T T R K A P A K G S K K
241GGGTGCATGAAAGGGAAGGGAGGACCTCAAAATTCTCAGTGTAACTACAGAGGAGTTAGG65 G C M K G K G G P Q N S Q C 301CAGAGGACATGGGGGAAATGGGTTGGTGAGATTAGGGAACCCAATAGAGGAAGCAGGCTT85 361TGGTTGGGTACCTTCTCTTCTGCCCAGGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCTAGA105 421GCTATGTATGGTCCTTGTGCACGCCTCAATTTTCCCGAAATCACAGATTATCCTTCTGTT125 E I T D Y P S V481AAGGAATCGTTGAAGGACTCTTCGATGGCTGCATCGTCGTCTTGTTCTTCGGCAGCAACT145 K E S L K D S S M A A S S S C S S A A T541GCAGCATCTGACACTACTACTACAACATCGAACCAATCGGAGGTTTGTGCTGTTGAGGAT165 A A S D T T T T T S N Q S E V C A V E D601GTTATCGAGAAACCTGCGAATGTGAATGATAAGTTTAATGATTGTCATAAGGCTTACGTA185 V I E K P A N V N D K F N D C H K A Y V661TCTGCCTCACCAACTAGTAGAATGAAGCAAGAGCCTAGGGATGAGGCTGTGGACCACATG205 S A S P T S R M K Q E P R D E A V D H M721GACACAGGGGCTGGGGAAATTCAAGATGTCGGACTAGAAGGAACACATGATACTGGGCAG225 D T G A G E I Q D V G L E G T H D T G Q781GTTGCAGAGAATGTAAATAAAGATCAGATGGATTTGTCATGGATTGATGGCCTTGACTTT245 V A E N V N K D Q M D L S W I D G L D F841ATTGACGATTACTTGAAGAGCCTTTCCGCGGATGAGTTATTTCAGGTGGACGAACTTTTG265 I D D Y L K S L S A D E L F Q V D E L L901GGGCTTATAGATAATAACCCAATCGATAACTCTGTGTTGATGCAAGGTTTGGATTTTGGA285 G L I D N N P I D N S V L M Q G L D F G961CAAATGGGTTTTCCTGGAGATGGTAATCCTCAGGTTGACGATACTCCTTCAAGCTTTATT305 Q M G F P G D G N P Q V D D T P S S F I1021 TATCAGTTGCAAAATCCAGATGCCAAGTTGTTAGGAAGTTTGCCCCATATGGAGCAGACA325 Y Q L Q N P D A K L L G S L P H M E Q T1081 CCATCAGGTGTTGATTATGGATTAGATTTCTTGAAAACAGTGGAGCCAGGGGACTATAAT
345 P S G V D Y G L D F L K T V E P G D Y N1141 GGTGGAGGGGAAGAACCACCATTTCTTAATTTGGATGATGATCTAAACCATGATTCAAAT365 G G G E E P P F L N L D D D L N H D S N1201 GGCATGCAAGCAAGGAAGGGTGGC AGAAGGCTACGTGTATCTGCTTCATTTTCAACT385 G M Q A R K G G *1261 GGTTCTAGCGTCTGCTGGTAATCTGTCTCTTGGGCTGTTGTCCCCTTTTTAGCTATATAA1321 TAGGCGCATAAGAGGAATACCCCTATACAACTAATACAAG本发明的基因是采用这样的方法来克隆的根据拟南芥DREB2A、DREB2B(AB007790、AB007791)、番茄DREB2(AF500012)、玉米DREB2(AF450481)的多序列比对结果，在DREBP/AP2的β-折叠区和α-螺旋区设计一套简并引物。以反转录产物为模板，采用降落PCR的方法，获得到191bp的片段，命名为GsAP2。引物序列为GsAP2 UPgg(A/T/C)AAA Tgg gT(T/A/g)(g/T)(C/g)(A/T/C)gAGsAP2 DOWN gg(g/A)AA(g/A)TT(g/A)Ag(A/T/g)(A/C)(g/T)A gC以获得的GsAP2序列为靶序列，采用3’RACE和5’RACE方法分别对其3’和5’末端未知的序列进行扩增。引物序列如下Primers Sequences(5‘→3’)PCRAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACA A(17) 3’RACEAUAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT AC 3’/5’RACEAAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACg ggI Igg gII ggg IIg5’RACEGsDREB 3GSP1 gAg gAg TTA ggC AgA ggA CAC g 3’RACEGsDREB 3GSP2 gCA ggC TTT ggT Tgg gTA C 3’RACEGsDREB 3GSP3 gCT gCT CTT gCC TAT gAT gAA G 3’RACEGsDREB 5GSP1 AAg gAT AgC ACA Agg ACC ATA C 5’RACEGsDREB 5GSP2 TgC TTC CTC TAT Tgg gCT CC 5’RACEGsDREB 5GSP3 CgT gTC CTC TgC CTA ACT CCT C 5’RACE经过PCR扩增获得1162bp 3’端序列和482bp 5’端序列它们与191bp的保守区分别具有106bp和45bp的重叠区域；将5’RACE序列、3’RACE序列和GsAP2序列拼接，获得1622bp的拼接序列；在拼接的两端序列设计引物，采用RT-PCR方法进行全长基因扩增，结果获得了1360bp全长cDNA序列，该基因被命名为GsDREB。全长基因PCR扩增的引物序列如下GsDREB UP CACggA TCCAgT TTg ATT gAg TAC TgT gTgGsDREB DOWNggCgAg CTCCTT gTA TTA gTT gTA TAg ggg利用DNA、氨基酸序列分析软件分析基因序列，在序列水平上推测基因的功能。该基因包括1179bp的开放读码框，编码392个氨基酸，有ATG起始密码子和TAG终止密码子，说明基因的完整性；分析其氨基酸序列，在GsDREB内部具有转录因子特有的与DNA结合的结构域DREBP/AP2，其保守的氨基酸残基为RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三个平行的β-折叠和一个α-螺旋结构，可以与DNA的GCC-BOX结合，N端具有6个氨基酸的核定位序列(SRKRKS)。这些分析结果暗示着该基因编码一类转录因子，并且具有转录因子所具有的结构特征。
本发明从东北野生大豆中克隆的GsDREB基因，其氨基酸序列中含有转录因子所特有的核定位序列、DNA结合结构域以及C-端酸性活性区等。序列决定功能，因此该基因具有转录因子的活性，在植物抗渗透胁迫过程中起调控作用。并且该基因来源于野生大豆，与大豆亲缘关系很近，外源基因遗传转化大豆可以稳定遗传和表达，因此该研究为大豆抗渗透胁迫基因工程提供新的基因资源；同时对于理解渗透胁迫分子生物学机理奠定理论基础。
图1是DREBP/AP2结构域PCR扩增的电泳结果；图2是GsDREB全长基因的扩增结果；图3是克隆片段GsDREB氨基酸序列在基因数据库中的同源性检索结果具体实施方式
下面举例对本发明作更详细的描述DREB属于DREBP亚家族，在序列上具有保守的AP2结构域，而与EREBP家族的其它亚家族的氨基酸序列有差别。根据拟南芥DREB2A、DREB2B(AB007790、AB007791)、番茄DREB2(AF500012)、玉米DREB2(AF450481)的多序列比对结果，在DREBP/AP2的β-折叠区和α-螺旋区设计一套简并引物。采用RT-PCR的方法，获得到191bp的片段。图1是其结构域PCR扩增的电泳结果，其中M2000Mark；1，3，5，7第一轮PCR的结果，退火温度分别为44.8℃，49.1℃，53.3℃，56.6℃；2，4，6，8为第二轮PCR的结果，退火温度为44℃。PCR扩增的简并引物序列为GsAP2 UPgg(A/T/C)AAATgggT(T/A/g)(g/T)(C/g)(A/T/C)gAGsAP2 DOWN gg(g/A)AA(g/A)TT(g/A)Ag(A/T/g)(A/C)(g/T)AgC克隆，测序，序列分析。其氨基酸序列，具有DREBP/AP2区域保守的氨基酸序列，命名为GsAP2。与GsAP2相似性最高的是拟南芥DREB2A和水稻的DREB-likeproteine，均达到82％。证明所获得的片段即为野生大豆DREB的保守区-DREBP/AP2。GsAP2的序列及推测的氨基酸序列为(灰框的氨基酸为保守的氨基酸残基为DREBP/AP2结构域保守氨基酸，单线的氨基酸序列构成β-折叠结构，双线的区域为α-螺旋结构)1 ACTCAAAATTCTCAGTGTAACTACAGAGGAGTTAGGCAGAGGACACGGGGGAAATGGGTT1 T Q N S Q C N Y 61GGTGAGATTAGGGAGCCCAATAGAGGAAGCAGGCTTTGGTTGGGTACCTTCTCTTCTCAG21 121 CCGGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCTAGAGCTATGTATGGTCCTTGTGCTATC41 C A I181 CTTAACTTTCC61 L N F为了获得DREB基因的全长的序列，我们以获得的GsAP2序列为靶序列，采用3’RACE和5’RACE方法分别对其3’和5’末端未知的序列进行扩增。RACE-PCR扩增的引物序列如下Primers Sequences(5‘→3’) PCRAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACA A(17) 3’RACEAUAPggC CAC gCg TCg ACT AgT AC3’/5’RACEAAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACg ggI Igg gII ggg IIg 5’RACEGsDREB 3GSP1gAg gAg TTA ggC AgA ggA CAC g 3’RACEGsDREB 3GSP2gCA ggC TTT ggT Tgg gTA C 3’RACEGsDREB 3GSP3gCT gCT CTT gCC TAT gAT gAA G 3’RACEGsDREB 5GSP1AAg gAT AgC ACA Agg ACC ATA C 5’RACEGsDREB 5GSP2TgC TTC CTC TAT Tgg gCT CC5’RACEGsDREB 5GSP3CgT gTC CTC TgC CTA ACT CCT C 5’RACE经过PCR扩增获得1162bp 3’端序列和482bp 5’端序列；它们与191bp的保守区分别具有106bp和45bp的重叠区域；将5’RACE序列、3’RACE序列和GsAP2序列拼接，获得1622bp的拼接序列；在拼接的两端序列设计引物，采用RT-PCR方法进行全长基因扩增，结果获得了1360bp全长cDNA序列，该基因被命名为GsDREB。图2是全长基因PCR扩增的电泳结果，其中M2000Mark；1，2，3，4不同退火温度下扩增的结果，退火温度分别为52℃、54℃、56℃、58℃，目的片段的长度为1.3kb。全长基因PCR扩增的引物序列如下GsDREB UP CACggA TCCAgT TTg ATT gAg TAC TgT gTgGsDREB DOWNggCgAg CTCCTT gTA TTA gTT gTA TAg ggg利用DNA、氨基酸序列分析软件分析基因序列，在序列水平上推测基因的功能。该基因包括1179bp的开放读码框，编码392个氨基酸，有ATG起始密码子和TAG终止密码子，说明基因的完整性；分析其氨基酸序列，在GsDREB内部具有转录因子特有的与DNA结合的结构域DREBP/AP2，其保守的氨基酸残基为RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三个平行的β-折叠和一个α-螺旋结构，可以与DNA的GCC-BOX结合，N端具有6个氨基酸的核定位序列(SRKRKS)。这些分析结果暗示着该基因编码一类转录因子，并且具有转录因子所具有的结构特征。图3是克隆片段GsDREB氨基酸序列在基因数据库中的同源性检索结果。
基因的全长DNA序列及推测的氨基酸序列为1 TTTCATTGAGTACTGTGTGGCGAAGTTTGTGTCTTGGATTTTGTGGAC GGTGCTTAT1 M G A Y61GATCAAGTTTCTCTTAAGCCATTGGATTCTTCTAGAAAGAGGAAAAGTAGGAGCAGAGGG5 D Q V S L K P L D S R S R G121 GATGGGTCCAAATCTGTGGCTGAGACTATTGCAAAGTGGAAGGAATACAATGAGCATCTT25 D G S K S V A E T I A K W K E Y N E H L181 TATTCTGGCAAAGATGATAGTAGAACAACTCGTAAGGCGCCGGCTAAAGGTTCGAAGAAA45 Y S G K D D S R T T R K A P A K G S K K241 GGGTGCATGAAAGGGAAGGGAGGACCTCAAAATTCTCAGTGTAACTACAGAGGAGTTAGG65 G C M K G K G G P Q N S Q C 301 CAGAGGACATGGGGGAAATGGGTTGGTGAGATTAGGGAACCCAATAGAGGAAGCAGGCTT85 361 TGGTTGGGTACCTTCTCTTCTGCCCAGGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCTAGA105 421 GCTATGTATGGTCCTTGTGCACGCCTCAATTTTCCCGAAATCACAGATTATCCTTCTGTT125 E I T D Y P S V
481AAGGAATCGTTGAAGGACTCTTCGATGGCTGCATCGTCGTCTTGTTCTTCGGCAGCAACT145 K E S L K D S S M A A S S S C S S A A T541GCAGCATCTGACACTACTACTACAACATCGAACCAATCGGAGGTTTGTGCTGTTGAGGAT165 A A S D T T T T T S N Q S E V C A V E D601GTTATCGAGAAACCTGCGAATGTGAATGATAAGTTTAATGATTGTCATAAGGCTTACGTA185 V I E K P A N V N D K F N D C H K A Y V661TCTGCCTCACCAACTAGTAGAATGAAGCAAGAGCCTAGGGATGAGGCTGTGGACCACATG205 S A S P T S R M K Q E P R D E A V D H M721GACACAGGGGCTGGGGAAATTCAAGATGTCGGACTAGAAGGAACACATGATACTGGGCAG225 D T G A G E I Q D V G L E G T H D T G Q781GTTGCAGAGAATGTAAATAAAGATCAGATGGATTTGTCATGGATTGATGGCCTTGACTTT245 V A E N V N K D Q M D L S W I D G L D F841ATTGACGATTACTTGAAGAGCCTTTCCGCGGATGAGTTATTTCAGGTGGACGAACTTTTG265 I D D Y L K S L S A D E L F Q V D E L L901GGGCTTATAGATAATAACCCAATCGATAACTCTGTGTTGATGCAAGGTTTGGATTTTGGA285 G L I D N N P I D N S V L M Q G L D F G961CAAATGGGTTTTCCTGGAGATGGTAATCCTCAGGTTGACGATACTCCTTCAAGCTTTATT305 Q M G F P G D G N P Q V D D T P S S F I1021 TATCAGTTGCAAAATCCAGATGCCAAGTTGTTAGGAAGTTTGCCCCATATGGAGCAGACA325 Y Q L Q N P D A K L L G S L P H M E Q T1081 CCATCAGGTGTTGATTATGGATTAGATTTCTTGAAAACAGTGGAGCCAGGGGACTATAAT345 P S G V D Y G L D F L K T V E P G D Y N1141 GGTGGAGGGGAAGAACCACCATTTCTTAATTTGGATGATGATCTAAACCATGATTCAAAT365 G G G E E P P F L N L D D D L N H D S N1201 GGCATGCAAGCAAGGAAGGGTGGC AGAAGGCTACGTGTATCTGCTTCATTTTCAACT385 G M Q A R K G G *1261 GGTTCTAGCGTCTGCTGGTAATCTGTCTCTTGGGCTGTTGTCCCCTTTTTAGCTATATAA1321 TAGGCGCATAAGAGGAATACCCCTATACAACTAATACAAG
权利要求
1.东北野生大豆编码DREB转录因子基因，其特征是该基因包括1179bp的开放读码框，编码392个氨基酸，有ATG起始密码子和TAG终止密码子；在GsDREB内部具有转录因子特有的与DNA结合的结构域DREBP/AP2，其保守的氨基酸残基为RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三个平行的β-折叠和一个α-螺旋结构，可以与DNA的GCC-BOX结合，N端具有6个氨基酸的核定位序列(SRKRKS)。
2.根据权利要求1所述的东北野生大豆编码DREB转录因子基因，其特征是其序列及推测的氨基酸序列为1 TTTCATTGAGTACTGTGTGGCGAAGTTTGTGTCTTGGATTTTGTGGAC GGTGCTTAT1 MG A Y61GATCAAGTTTCTCTTAAGCCATTGGATTCTTCTAGAAAGAGGAAAAGTAGGAGCAGAGGG5 D Q V S L K P L D S R S R G121 GATGGGTCCAAATCTGTGGCTGAGACTATTGCAAAGTGGAAGGAATACAATGAGCATCTT25 D G S K S V A E T I A K W K E Y N E H L181 TATTCTGGCAAAGATGATAGTAGAACAACTCGTAAGGCGCCGGCTAAAGGTTCGAAGAAA45 Y S G K D D S R T T R K A P A K G S K K241 GGGTGCATGAAAGGGAAGGGAGGACCTCAAAATTCTCAGTGTAACTACAGAGGAGTTAGG65 G C M K G K G G P Q N S Q C 301 CAGAGGACATGGGGGAAATGGGTTGGTGAGATTAGGGAACCCAATAGAGGAAGCAGGCTT85 361 TGGTTGGGTACCTTCTCTTCTGCCCAGGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCTAGA105 421 GCTATGTATGGTCCTTGTGCACGCCTCAATTTTCCCGAAATCACAGATTATCCTTCTGTT125 E I T D Y P S V481 AAGGAATCGTTGAAGGACTCTTCGATGGCTGCATCGTCGTCTTGTTCTTCGGCAGCAACT145K E S L K D S S M A A S S S C S S A A T541 GCAGCATCTGACACTACTACTACAACATCGAACCAATCGGAGGTTTGTGCTGTTGAGGAT165A A S D T T T T T S N Q S E V C A V E D601 GTTATCGAGAAACCTGCGAATGTGAATGATAAGTTTAATGATTGTCATAAGGCTTACGTA185V I E K P A N V N D K F N D C H K A Y V661 TCTGCCTCACCAACTAGTAGAATGAAGCAAGAGCCTAGGGATGAGGCTGTGGACCACATG205S A S P T S R M K Q E P R D E A V D H M721 GACACAGGGGCTGGGGAAATTCAAGATGTCGGACTAGAAGGAACACATGATACTGGGCAG225D T G A G E I Q D V G L E G T H D T G Q781 GTTGCAGAGAATGTAAATAAAGATCAGATGGATTTGTCATGGATTGATGGCCTTGACTTT245 V A E N V N K D Q M D L S W I D G L D F841 ATTGACGATTACTTGAAGAGCCTTTCCGCGGATGAGTTATTTCAGGTGGACGAACTTTTG265I D D Y L K S L S A D E L F Q V D E L L901 GGGCTTATAGATAATAACCCAATCGATAACTCTGTGTTGATGCAAGGTTTGGATTTTGGA285G L I D N N P I D N S V L M Q G L D F G961 CAAATGGGTTTTCCTGGAGATGGTAATCCTCAGGTTGACGATACTCCTTCAAGCTTTATT305Q M G F P G D G N P Q V D D T P S S F I1021 TATCAGTTGCAAAATCCAGATGCCAAGTTGTTAGGAAGTTTGCCCCATATGGAGCAGACA325Y Q L Q N P D A K L L G S L P H M E Q T1081 CCATCAGGTGTTGATTATGGATTAGATTTCTTGAAAACAGTGGAGCCAGGGGACTATAAT345P S G V D Y G L D F L K T V E P G D Y N1141 GGTGGAGGGGAAGAACCACCATTTCTTAATTTGGATGATGATCTAAACCATGATTCAAAT365G G G E E P P F L N L D D D L N H D S N1201 GGCATGCAAGCAAGGAAGGGTGGC AGAAGGCTACGTGTATCTGCTTCATTTTCAACT385G M Q A R K G G *1261 GGTTCTAGCGTCTGCTGGTAATCTGTCTCTTGGGCTGTTGTCCCCTTTTTAGCTATATAA1321 TAGGCGCATAAGAGGAATACCCCTATACAACTAATACAAG
3.一种东北野生大豆编码DREB转录因子基因的克隆方法根据拟南芥DREB2A、DREB2B(AB007790、AB007791)、番茄DREB2(AF500012)、玉米DREB2(AF450481)的多序列比对结果，在DREBP/AP2的β-折叠区和α-螺旋区设计一套简并引物，引物序列为GsAP2 UP gg(A/T/C)AAA Tgg gT(T/A/g)(g/T)(C/g)(A/T/C)gAGsAP2 DOWNgg(g/A)AA(g/A)TT(g/A)Ag(A/T/g)(A/C)(g/T)A gC以反转录产物为模板，采用降落PCR的方法，获得到191bp的片段，命名为GsAP2；以获得的GsAP2序列为靶序列，采用3’RACE和5’RACE方法分别对其3’和5’末端未知的序列进行扩增，引物序列如下PrimersSequences(5‘→3’) PCRAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACA A(17)3’RACEAUAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT AC 3’/5’RACEAAPggC CAC gCg TCg ACT AgT ACg ggI Igg gII ggg IIg 5’RACEGsDREB 3GSP1 gAg gAg TTA ggC AgA ggA CAC g3’RACEGsDREB 3GSP2 gCA ggC TTT ggT Tgg gTA C3’RACEGsDREB 3GSP3 gCT gCT CTT gCC TAT gAT gAA G3’RACEGsDREB 5GSP1 AAg gAT AgC ACA Agg ACC ATA C5’RACEGsDREB 5GSP2 TgC TTC CTC TAT Tgg gCT CC 5’RACEGsDREB 5GSP3 CgT gTC CTC TgC CTA ACT CCT C5’RACE经过PCR扩增获得1162bp 3’端序列和482bp 5’端序列；它们与191bp的保守区分别具有106bp和45bp的重叠区域；将5’RACE序列、3’RACE序列和GsAP2序列拼接，获得1622bp的拼接序列；在拼接的两端序列设计引物，采用RT-PCR方法进行全长基因扩增，结果获得了1360bp全长cDNA序列，该基因被命名为GsDREB，全长基因PCR扩增的引物序列如下GsDREB UP CACggA TCCAgT TTg ATT gAg TAC TgT gTgGsDREB DOWNggCgAg CTCCTT gTA TTA gTT gTA TAg ggg利用DNA、氨基酸序列分析软件分析基因序列，在序列水平上推测基因的功能；该基因包括1179bp的开放读码框，编码392个氨基酸，有ATG起始密码子和TAG终止密码子，说明基因的完整性；分析其氨基酸序列，在GsDREB内部具有转录因子特有的与DNA结合的结构域DREBP/AP2，其保守的氨基酸残基为RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三个平行的β-折叠和一个α-螺旋结构，可以与DNA的GCC-BOX结合，N端具有6个氨基酸的核定位序列(SRKRKS)；这些分析结果暗示着该基因编码一类转录因子，并且具有转录因子所具有的结构特征，必将行使转录因子的功能，在信号传导过程中对功能基因的表达起调控作用。
全文摘要
本发明提供的是一种东北野生大豆编码DREB转录因子基因及其克隆方法。该基因包括1179bp完整的开放读码框，编码392个氨基酸，有ATG起始密码子和TAG终止密码子；通过Protein Conserve Domain程序分析，在GsDREB内部具有转录因子特有的与DNA结合的结构域DREBP/AP2，其保守的氨基酸残基为RgxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三个平行的β－折叠和一个α－螺旋结构，可以与DNA的GCC－BOX结合，N端具有6个氨基酸的核定位序列。这些分析结果暗示着该基因编码一类转录因子，并且具有转录因子所具有的结构特征，必将行使转录因子的功能，在信号传导过程中对功能基因的表达起调控作用。
文档编号C07K14/415GK1850975SQ20061001002
公开日2006年10月25日 申请日期2006年5月10日 优先权日2006年5月10日
发明者朱延明, 才华, 柏锡, 李 杰 申请人:东北农业大学