专利名称：一种生产壳寡糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产壳寡糖的方法，特别是涉及一种通过发酵培养产壳聚糖酶的微生物，生产壳聚糖酶，利用该酶降解壳聚糖生产壳寡糖的方法。
背景技术：
甲壳素和壳聚糖是多糖领域的研究热点之一，壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，在工业、农业、食品、医药等领域有着广泛的应用前景。但由于壳聚糖不溶于水，在体内不易降解吸收，从而影响了它的应用范围。壳寡糖是壳聚糖经降解后形成的聚合度2～20的氨基葡萄糖低聚糖，具有很好的水溶性，并具有许多独特的生理活性和功能，如增强机体免疫力，抑制肿瘤转移，降低血清胆固醇、血脂，降低糖尿病患者的血糖含量，调节肠道微生态平衡等。在农业方面对农作物具有抗菌抗病、增产、改善品质等功能。因此，在保健食品、生态农业、医药、生物工程等领域有着广泛的用途，具有很大的市场需求潜力。
目前国内外壳寡糖的制备方法有酸降解法、酶降解法、氧化降解法等。酸降解法生产的壳寡糖由于反应时所用的水体积大，耗能大，难以控制分子量范围，得到的水溶性寡糖产率相当低，且含有大量无机盐不容易去除。氧化降解法生产壳寡糖，由于反应剧烈，得到的寡糖分子量大小均一性差，难以控制，且该寡糖的结构易被破坏，有害物质残留多，产品质量差。酶降解法是用水解酶对壳聚糖进行生物降解，能得到平均分子量较低的壳寡糖，又由于酶法降解反应条件温和，能耗低，无污染，属绿色清洁生产，因此是国内外公认的最好的壳寡糖生产方法。但目前的酶降解法生产壳寡糖工艺中，所用的酶活性不高，专一性不强，由此造成产品收率低，生产成本高。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产壳寡糖的方法，以克服现有酶法生产壳寡糖的上述缺点。
一种生产壳寡糖的方法，其特征是将壳聚糖溶解于醋酸水溶液中，加入壳聚糖酶，使壳聚糖水解；将所得水解液减压浓缩，然后用乙醇沉淀、干燥或将水解液喷雾干燥；所述的壳聚糖酶为壳聚糖酶液或壳聚糖酶粉；所述的壳聚糖酶液的体积与壳聚糖的重量比为0.1～2L∶1Kg，所述的壳聚糖酶粉与壳聚糖的重量比为0.5g～10g∶1Kg。
按本发明的方法生产的壳寡糖水溶性好，收率高，成本低。
具体实施例方式
实施例1(1)产壳聚糖酶菌株的获得先制备选择性平板培养基分别称取壳聚糖1.0g、(NH4)2SO40.5g、酵母浸粉0.1g、K2HPO40.05g、KH2PO40.3g、NaCl 1.0g、MgSO4·7H2O 0.05g、琼脂2.0g，置于500ml三角烧瓶中，量取蒸馏水95g，倒入上述三角烧瓶中，用1mol/L的NaOH水溶液调pH至8.1，加上棉塞，于121℃高压下灭菌20min。灭菌后将制得的培养基分装到直径为9cm的玻璃平皿中，每皿15ml，冷却至室温，得选择性平板培养基。取养虾池海水0.2ml，于无菌条件下均匀涂布在上述选择性平板培养基上，28℃下培养5天，得产壳聚糖酶的细菌。以划线法将上述产壳聚糖酶细菌进一步纯化，得产壳聚糖酶菌株。
制备选择性平板培养基所用的各物质及其重量百分数范围可以是壳聚糖0.1～5％、(NH4)2SO40.1～5％、酵母浸粉0.05～1％、K2HPO40.05～0.1％、KH2PO40.01～0.5％、NaCl 0.1～3％、MgSO4·7H2O 0.02～0.08％、琼脂1.5～2.5％、水90-98％，调pH7.5～8.5。(NH4)2SO4可以改为NH4NO3也能达到同样的效果。
(2)壳聚糖酶发酵液的制备先配制发酵培养基分别称取壳聚糖25g、(NH4)2SO420g、酵母提取物5g、NaCl 20g、MgSO4·7H2O 0.5g，置于5000ml的三角烧瓶中，加入蒸馏水至1000ml，倒入三角烧瓶中，搅拌均匀，调pH至8.1，得混合液体。从该混合液体中量取100ml，倒入500ml三角烧瓶中，分别塞上两个三角烧瓶的棉塞，121高压下灭菌20min，得无菌发酵培养基。无菌条件下接种上述产壳聚糖酶菌株于装有100ml发酵培养基的500ml三角烧瓶中，置摇床30℃下培养24h，得产壳聚糖酶液体种子。无菌条件下将上述液体种子倒入装有发酵培养基的5000ml的三角烧瓶中，30℃下摇床培养60小时，得壳聚糖酶发酵液。
配制发酵培养基的各组分及其重量百分数范围可以是壳聚糖0.1～5％、(NH4)2SO40.1～5％、酵母浸粉0.05～1％、NaCl 0.1～3％、MgSO4·7H2O 0.02～0.08％，其余为水，调pH7.5～8.5。(NH4)2SO4可以改为NH4NO3也能达到同样的效果。
(3)壳聚糖酶液的制备将上述壳聚糖酶发酵养液于4℃下5000rpm离心30min除菌体，得到的离心上清液再经截留分子量为10000Da的超滤膜超滤除去小分子物质，其含大分子量的浓缩液酶活力达120Iu，即为壳聚糖酶液。
(4)壳聚糖水解液的制备称取壳聚糖15Kg置于500L的不锈钢反应釜中，加入294L水，6L醋酸，搅拌溶解，加入上述壳聚糖酶液1.5L，40℃下搅拌降解12小时，得壳聚糖水解液。
在所述的壳聚糖水解液中，醋酸的重量百分数浓度范围为2％～5％，壳聚糖的浓度范围为2％～10％，壳聚糖酶液的体积与壳聚糖的重量比为0.1～2L∶1Kg，降解温度范围为30～50℃，降解时间为2小时～24小时。
(5)壳寡糖制备将上述壳聚糖水解液减压浓缩至原体积的1/3，即约100L，向该浓缩液中加入5倍体积比(V/V)的食品级乙醇，沉淀，甩干，得固形物。再向固形物中加入2倍体积的食品级乙醇，搅拌脱水，甩干，得固形物，再经真空干燥得壳寡糖产品，该壳寡糖收率80％，水溶性好。
实施例2(1)产壳聚糖酶菌株的获得同实施例1中的(1)之步骤。
(2)壳聚糖酶发酵液的制备同实施例1中的(2)之步骤。
(3)壳聚糖酶粉的制备将壳聚糖酶发酵养液于4℃下5000rpm离心30min除菌体，得到得离心上清酶液，再经截留分子量为10000Da的超滤膜超滤除去小分子物质，得含大分子量的酶浓缩液，经冷冻干燥，制得壳聚糖酶粉。
(4)壳聚糖水解液的制备称取壳聚糖15Kg置于500L的搪瓷罐中，加入294L水，10L醋酸，搅拌溶解，加入壳聚糖酶粉25g，40℃下搅拌降解15小时，得壳聚糖酶解液。
在本实施例中，壳聚糖水解液中醋酸的重量百分数浓度范围为2％～5％，壳聚糖的浓度范围为2％～10％，壳聚糖酶粉与壳聚糖的重量比范围为0.5g～10g∶1Kg，降解温度范为围30～50℃，降解时间为2小时～24小时。
(5)壳寡糖制备将壳聚糖水解液，采用喷雾干燥机，调节进料口温度为175℃，出料口温度75～80℃，进行喷雾干燥，制得壳寡糖干燥粉产品，该壳寡糖收率90％，水溶性好。
本发明人从海洋微生物中通过选择性培养基分离出产壳聚糖酶的微生物菌株，并进行了产酶发酵条件的试验，掌握了酶的分离纯化技术，研究了酶催化底物的最适反应条件等，建立了壳寡糖质量分析方法，分析了酶解产物。本研究的产壳聚糖酶菌株经逐级放大培养到100L发酵试验，产酶活性稳定，酶活力高，发酵液壳聚糖酶活力达120Iu，满足酶法生产壳寡糖的要求。利用发酵生产的壳聚糖酶水解壳聚糖，制成壳寡糖，收率高，水溶性好。
权利要求
1.一种生产壳寡糖的方法，其特征是将壳聚糖溶解于醋酸水溶液中，加入壳聚糖酶，使壳聚糖水解；将所得水解液减压浓缩，然后用乙醇沉淀、干燥或将水解液喷雾干燥；所述的壳聚糖酶为壳聚糖酶液或壳聚糖酶粉；所述的壳聚糖酶液的体积与壳聚糖的重量比为0.1～2L∶1Kg，所述的壳聚糖酶粉与壳聚糖的重量比为0.5g～10g∶1Kg。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的壳聚糖酶是按下述方法得到的以含壳聚糖的发酵培养基发酵培养产壳聚糖酶的菌株，制出含壳聚糖酶的发酵培养液，经低温离心除菌体，再经超滤除去小分子物质，得到壳聚糖酶液；或再将该壳聚糖酶液冷冻干燥，制得壳聚糖酶粉。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的发酵培养基各组分及其重量百分数范围是壳聚糖0.1～5％、NH4NO3或(NH4)5SO40.1～5％、酵母浸粉0.05～1％、NaCl 0.1～3％、MgSO4·7H2O 0.02～0.08％，其余为水。
全文摘要
一种生产壳寡糖的方法，其特征是将壳聚糖溶解于醋酸水溶液中，加入壳聚糖酶，使壳聚糖水解；将所得水解液减压浓缩，然后用乙醇沉淀、干燥或将水解液喷雾干燥；所述的壳聚糖酶为壳聚糖酶液或壳聚糖酶粉；所述的壳聚糖酶液的体积与壳聚糖的重量比为0.1～2L∶1Kg，所述的壳聚糖酶粉与壳聚糖的重量比为0.5g～10g∶1Kg。按本发明的方法生产的壳寡糖水溶性好，收率高，成本低。
文档编号C07H3/06GK1884308SQ20061004541
公开日2006年12月27日 申请日期2006年7月8日 优先权日2006年7月8日
发明者刘万顺, 韩宝芹, 彭睿 申请人:青岛弘海生物技术有限公司