专利名称：：二氧哌嗪类化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用疏展曲霉菌Hl-l(As7^g"/wHl-l)(该菌种已于2006年7月13日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是CCTCCM206066)生产二氧哌嗪类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
：有关二氧哌嗪类化合物的文献报道较多，但是这两种新结构的二氧哌嗪类化合物未见报道。本发明人研究得知，疏展曲霉菌Hl-l(Asperg沿"sej^sesHl-l)液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的海虾致死活性，遂对其活性成分进行了研究。研究发现，所示二氧哌嗪类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见对该菌株的抗肿瘤活性成分研究、该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。
发明内容本发明旨在提供两种具有细胞增殖抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性的新化合物。其结构式分别是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其结构特征是式I可以看作是由二氧哌嗪和苯甲醛衍生物两部分构成。二氧哌嗪部分是由色氨酸与丙氨酸构成；苯甲醛衍生物的苯环上连有一个异戊烯基、一个7个碳的烃基和两个R基，R,和R2是氨基、羟基、垸氧基、酰氧基或酰氨基等基团。式II可看作是由色氨酸和丙氨酸构成的二氧哌嗪，其中色氨酸部分上连有两个异戊烯基和一个反异戊烯基；丙氨酸部分为丙氨酸的脱氢产物。本发明采用MTT法测试了式I和式II化合物对P388和HL60细胞株的抗肿瘤活性；采用SRB法测试了式I和式II化合物对A549和BEL7402细胞株的抗肿瘤活性。实验证实，式I化合物对P388、HL60和A549这三种肿瘤细胞有抗肿瘤作用；式II化合物对A549、HL60和BEL7402这三种肿瘤细胞有抗肿瘤作用。因此本发明的式I或II化合物可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。式I或式II化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。式i或n化合物还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，式I或II化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。本发明的式I或II化合物可通过微生物发酵培养来获取含有该二氧哌嗪类化合物的发酵物，然后从发酵物中采用硅胶柱层析、制备薄层层析、HPLC和重结晶等方法分离纯化得到。本发明的下述实施例中列举了利用疏展曲霉菌H1-1(A^erg/Z/wq^s"Hl-l)制备优选的本发明式I或式II化合物的实例。因此，本发明的再一方面提供了一种疏展曲霉菌H1-1(Aspe^/toe」^猫Hl-l)，保藏编号是CCTCCM206066。需要特别说明的是，凡是能产生本发明式I或II化合物的任何微生物，都能用于生产该二氧哌嗪类化合物；也可经过化学方法合成该类化合物。具体实施例方式在如下的实施例中所指的化合物i和n的化学结构(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)分别是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>化合物I化合物II实施例1化合物I和II的发酵生产及分离精制1发酵生产生产菌的发酵培养按培养微生物的常规方法，取疏展曲霉菌H1-104印wg!7/^e^"s"Hl-1)(保藏编号是CCTCCM206066)适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。取斜面培养4天的疏展曲霉菌Hl-1(Asperg!7Z^e,s^Hl-l)适量，接种到装有120mL培养液[培养基组成(克/升)麦芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH2PO40.5，MgS04'H200.3，酵母膏3.0，玉米浆l，pH自然]的500mL锥型瓶中，在28'C、120转/分钟条件下摇床培养4天，获得疏展曲霉菌的种子培养液。按10%接种量将该种子培养液接种于装有150毫升生产培养液[培养基组成(克/升)麦芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH2PO40.5，MgSO4.H2O0.3,酵母膏3.0，玉米浆l，pH自然]的500mL三角烧瓶中，装载于28。C、120转/分钟的摇床上，进行为期ll天的生产发酵，获得菌丝体和发酵液。2浸膏的获得用棉布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用甲醇浸提4次，减压浓縮至不含甲醇，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓縮，得粗浸膏。发酵液减压浓縮为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共75克。3化合物的分离精制浸膏(75克)用氯仿-甲醇(9:1)混合溶剂溶解后，力卩100克200-300目硅胶H(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为8个流份。Fr-4以氯仿-甲醇(100:l10:l)为溶剂，再进行硅胶柱层析，在氯仿-甲醇(100:l)的洗脱溶剂中得化合物I(28mg);由氯仿-甲醇(90:l)的洗脱溶剂所得的流份进一步以硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(95:l)为洗脱溶剂，得化合物II(22mg)。化合物I:分子式C38H43N305，黄色固体，mpl48-15(TC，HR-ESI-MSm/z:622.3256[M+H]+(calc.622.3281);UVXMeOHnm(lgs):348(3.76)，275(3.86),224(4.21);IR(KBr)cm1:3350，3240，3044，2967，2928，1670，1637，1428，1380，1271，1253,747。及^CNMR数据见表l。表l.化合物I的'H和13CNMR数据(600，150MHz，DMSCM6,TMS，Sppm)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>化合物II:分子式CmH37N302，无色固体；mp168~169°C(丙酮)；[《-75.9(c0.08,MeOH);HRESI-MSm/z:460.2981[M+H]+(calc.460.2964);UVnm(lgs):296(3.37),287(3.47)，228(4.15);IR(KBr)cm1:3468，3184，2968，2912，1682，1625，1438，1324，1096，923，873，839。'H及l3CNMR数据见表2。表2化合物II的^和13CNMR数据(600，150MHz,DMS0-4,TMS，Sppm)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>148.99(1H'bs)1538.9166.08(1H，dd,17.4,10.5Hz)145.6175.15(1H，dd,17.4,0.9Hz);5.14(1H，dd，10.5，0.9Hz)112.1181.49(3H,s)27.7b191.50(3H，s)27.8b205.61(1H,bs);4.94(1H，bs)102.3213.40(2H，bd，7.3Hz)34.6225.35(1H,tm，7.3Hz)124.523131.6241.74(3H，bs)25.7C251.75(3H，bs)17.9263,54(2H,m)31.4275.43(1H，tm'7.3Hz)122.9d28133.0a291.81(3H，bs)25.8C301.87(3H，bs)17.9注具有相同上标的数据可以互换。实施例2抗肿瘤活性的测试1实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例l中分离精制的纯品化合物I-II。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。细胞系及细胞的继代培养活性测试采用P388、A-549、HL60和BEL7402细胞系。各种细胞均用含10%FBS的RPMI-1640培养基，在37°C通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。1-1MTT法活性测试方法
技术领域：
：本发明采用MTT法，测试评价了被测试样品对P388和HL60癌细胞增殖的抑制活性。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的formazan,formazan的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于formazan的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。活性测试时，取对数生长期的P388和HL60细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升5><104个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，在37。C下培养24小时后，每孔加入2微升不同浓度的样品溶液，继续培养72小时。然后加入20pL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培养4小时，移出150uL培养液后加入150uLDMSO溶解fo匿zan，在540nm处测定其吸收度。按照腦-(OD対,-OD样品)/OD^,X100呢式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR%),并采用bliss法计算出半数抑制浓度ICso。1-2SRB活性测试方法
技术领域：
：本发明采用SRB法，测试评价了被测试样品对A-549和BEL7402癌细胞增殖的抑制活性。SRB是一种粉红色的，含有两个硫酸基的氨基甲氧杂蒽类碱性蛋白结合染料，弱酸性条件下，SRB能与被三氯乙酸(TCA)固定的细胞表面生物大分子的碱性氨基酸残基(Lys、Arg或His)通过静电引力结合，被结合染料的量在细胞密度为2.5x104~6x105/cm3范围内，与蛋白含量呈正比，而蛋白含量与细胞数量呈正比。而在弱碱性条件下，经Tris非缓冲液洗涤后，SRB与碱性氨基酸残基分离。故可根据细胞染色程度推测细胞数。取对数生长期的A-549和BEL7402肿瘤细胞，用新鲜RPMI-1640培养基配成浓度为2Xl()S个/mL的细胞悬液，按每孔200pL接种于96孔板中，每孔加入2不同浓度样品溶液，37。C培养72小时。然后在4。C、3000prm条件下离心3min，吸去上清。每孔细胞中加入预冷的80%三氯乙酸(TCA)50^L，置于4'C冰箱固定1.5小时，再用水冲洗5次并空气干燥，每孔加入0.5%SRB的1%TCA溶液50pL并于室温静置30min，用预冷的1%TCA水溶液清洗4次，除去未结合的SRB染料。每孔加入150^LTris溶液(10mmol/L，pH10.5)溶解蛋白结合染料，用酶标仪于520nm下测定每孔吸光度OD值。按细胞增殖抑制率IR(%)=(OD加-OD样品)/OD空白X100%计算，再利用Bliss方法由求出半数抑制浓度(IC50)。2实验结果表3.化合物I对P388、A-549、HL60和BEL7402细胞的抑制活性cellInhibitionRates(%)IC50(p104M10、1CT6M10—7M10-8MM)P38886.579.9002.01.8A54963.562.012.78.33.514.5HL6093.086.96,0004.8BEL740236.322.014.56.88.0>100表4.化合物II对P388、A-549、HL60和BEL7402细胞的抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3结论化合物I对P388、A-549和HL60癌细胞具有抗肿瘤作用；化合物II对A-549、HL60和BEL7402细胞具有增殖抑制作用。化合物I和化合物II可作为抗肿瘤剂(即抗肿瘤药物)用于抗肿瘤的研究中，具有开发为抗肿瘤药物的潜力；也可作为抑制细胞增殖抑制的低分子生物探针用于生命科学研究。权利要求1.式I化合物式I权利要求1所述的式I化合物，其中R1和R2为羟基。2.式II化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式II3.权利要求1所述式I化合物或权利要求3所述式II化合物的制备方法，其特征是发酵培养疏展曲霉菌H,-1，获取含有上述式I和式II化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出式I和式II化合物。4.权利要求3所述的制备方法，其中将所述发酵物经硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，其中Fr-4以氯仿-甲醇(100:l10:l)为溶剂，再进行硅胶柱层析，在氯仿-甲醇(100:1)的洗脱溶剂中得化合物I;由氯仿-甲醇(90:1)的洗脱溶剂所得的流份进一歩以硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(95:l)为洗脱溶剂，得化合物II。5.权利要求1或2所述的式I或式II化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。6.根据权利要求5所述的用途，其中所述抗肿瘤药物是指所述式I式II化合物在制备细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。7.根据权利要求5所述的用途，其中所述抗肿瘤药物是指所述的式I或式II化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的用途。全文摘要本发明涉及两种二氧哌嗪类化合物的制备方法和用途。本发明用采自福建红树林根际海泥中的疏展曲霉菌H1-1(AspergilluseffusesH1-1)生产出结构新颖的二氧哌嗪类化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。文档编号C07D241/00GK101113148SQ20061010365公开日2008年1月30日申请日期2006年7月26日优先权日2006年7月26日发明者刘为忠,方玉春,朱伟明,朱天骄,顾谦群申请人:中国海洋大学;中国大洋矿产资源研究开发协会