专利名称：改良的色素上皮衍生因子变体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF )的抗血管生成变体及其用途，其中所述变体包含多个被改变的磷酸 化位点、编码所述位点的多核苷酸。尤其，包含多个被改变的磷酸化位点 的PEDF变体4是供优良的抗血管生成活性和高神经营养活性，可用于治疗 与新血管形成和神经变性病状关联的疾病。
背景技术：
色素上皮衍生因子(PEDF)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员，但 是到目前为止，没有发现其呈现出对任何蛋白酶的抑制活性。最初，基于 它把分裂的眼癌细胞转化成分化型神经元的能力而把它离析出来，因此将 它鉴定为神经营养因子。后来发现，除了其神经营养功能之外，PEDF还 是眼睛中血管生成的有效天然抑制剂，在眼睛中它抑制几种强的促血管生 成因子的刺激活性。这一抗血管生成的潜能也已经在一些动物才莫型中表现 出来，其中例证了 PEDF为负责减少眼睛中血管生长的因子。尽管最初在 从胎儿的人类视网膜获得的色素上皮细胞的培养基中发现PEDF,但目前 清楚，PEDF不只在视网膜中也在成人眼睛的多个位点以及成年人类的脑、 脊髓和人类血浆中祐束达。因此，PEDF可能具有抑制全身血管生成的潜 能。
已经确定，蛋白质磷酸化在大部分细胞内过程的调节中扮演主要角 色。然而，越来越明显，蛋白质激酶也可调节细胞外过程，因为它们在细 胞外作为外部蛋白质(ecto-protein)激酶或外蛋白质(exo-protein)激酶存 在。外部蛋白质激酶是膜结合酶，其催化活性位于多种细胞的胞外细胞表
8面。外蛋白质激酶是分泌的可溶酶，其催化活性存在于胞外环境中，与细 胞无直接关联。这些蛋白质激錄被示出为磷酸化细胞外可溶底物和细胞表 面蛋白质，因此在包括细胞-细胞的相互作用、分化、增殖和离子流在内的 许多生理学过程中起调节作用。
本发明的诸发明人在他们的最近研究中已经显示，从人类血浆
(plPEDF)提纯而来的PEDF是一种磷蛋白质，该磷蛋白质在循环中被酪 蛋白激酶CK2 ( CK2 )和蛋白质激酶A (PKA)磷酸化(Maik-Rachline G., 等.Blood. 105:670-678， 2005 )。还显示，CK2在两个主要残基Ser24和 Serll4上磷酸化PEDF，而PKA在Ser227上磷酸化PEDF。使用几种模拟 磷酸(Ser到Glu)或非磷酸(Ser到Ala)形式的PEDF的磷酸化位点突 变体，发现PEDF的CK2和PKA磷酸化各自显著地影响它的生理机能。 CK2磷酸化的PEDF具有降低了的神经营养活性，而其抗血管生成活性显 著地增加。另一方面，PKA磷酸化P争低了 PEDF抗血管生成活性，但对它 的神经营养活性几乎没有影响(Maik-Rachline G.,等.Blood. 2005, 105:670-678 )。
在本发明申请人的国际申请公布第WO 2006/054278号中，揭示了 一 种PEDF变体以及另 一种PEDF变体，其中第一种PEDF变体把在PEDF 的CK2磷酸化位点上的两个丝氨酸残基即丝氨酸24和丝氨酸114置换成 带负电荷的氨基酸，它与重组野生型PEDF相比较具有更高的抗血管生成 活性而具有更低的神经营养活性，第二种PEDF变体把在PKA磷酸化位点 上的丝氨酸残基即丝氨酸227置换成带负电荷的氨基酸，它与重组野生型 PEDF的相比较表现出更低的抗血管生成活性而表现出相似的神经营养活 性。WO 2006/054278要求保护包含至少一个被改变的磷酸化位点的抗血管 生成PEDF变体。WO 2006/054278进一步要求保护编码抗血管生成PEDF 变体的离析多核苷酸及其使用方法。
美国专利第5,840,686号揭示了编码PEDF、被截断的PEDF及等效 蛋白质的核酸，用于产生重组PEDF、 一皮截断的PEDF和等效蛋白质的重 组方法，以及这些蛋白质在神经元分化、神经元生存和神经胶质抑制中的 用途。美国专利第6,319,687号要求保护重组PEDF蛋白质和具有PEDF生
9物活性的PEDF截断形式。
国际申请公布第WO 03/059248号揭示了呈现有效的抗血管生成和神 经营养活性的人类血浆PEDF。
国际申请公布第WO 2004/028559号揭示了基本由PEDF的5到50个 邻接tt酸组成的PEDF片段、包含所述PEDF片段的药物組合物及其用 于治疗癌症或眼科疾病的用途。
美国专利申请第2005/0222031号揭示了用于预防或治疗恶性黑色素 瘤的方法，该方法包括为有相应需要的患者施用PEDF或具有功能上与 PEDF等效特性的PEDF变体。根据美国专利申请第2005/0222031号，PEDF 变体包含改变人类PEDF的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，并具
有功能上与人类PEDF等效特性的tt酸序列。然而，在美国专利申请第 2005/0222031号中，既没有揭示被改变的氨基酸残基的位点和数量，也没 有揭示氨基酸改变对PEDF生物活性的影响。
美国专利第6,821,775号揭示了一种复制缺陷型腺病毒载体，它含有 编码PEDF或其治疗性片段的核酸序列。尽管包含置换、缺失或添加并编 码功能性PEDF肽或其治疗性片段的核酸序列适宜插入病毒载体中，但是 美国专利第6,821,775号并没有揭示能够发挥出比PEDF更优活性的具体 PEDF变体。
美国专利申请公开第2003/0158112号揭示了一种治疗脉络膜新血管 形成的方法，包含直接对眼睛施用治疗性因子或编码治疗性因子的核酸序 列，以选择性地诱导与脉络膜新血管形成相关联的内皮细胞的凋亡，从而 治疗脉络膜新血管形成。所列出的治疗性因子包括PEDF或其片段。在美 国专利申请公开第2003/0158112号中，对于在特定位点有氨基酸置换的 PEDF变体，没有指出这些变体可用于治疗脉络膜新血管形成。
国际申请公布第WO 05/041887号揭示了用于治疗涉及增加的血管通 透性的病状的方法，该方法包括施用PEDF或PEDF44氨基酸肽或其同系 物，其中分别在位点IOI、 103、 112和115的氨基酸残基谷氨酰胺、异亮 氨酸、亮氨酸和丝氨酸不被改变。在国际公布申请第WO 05/041887号中没有揭示包含在位点24、 114和227被置换的丝氨酸残基的PEDF变体 可用于治疗涉及增加的血管通透性或增加的血管生成的病状。
仍然存在对表现出神经营养活性的PEDF的有效抗血管生成变体的、 没有得到满足的需求。
发明概述
本发明提供了新颖的抗血管生成PEDF变体，它包含相对于人类PEDF 氨基酸序列SEQIDNO:l被改变的氨基酸序列，其中该被改变的氨基酸序 列包含多个被改变的磷酸化位点。尤其，本发明提供了新颖的抗血管生成 PEDF变体，它包含相对于人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO:l被改变的 tt酸序列，其中该被改变的氨基酸序列包含在丝氨酸24、丝氨酸114和 丝氨酸227处的三个被改变的磷酸化位点。本发明进一步提供编码该新颖 PEDF变体的离析多核苷酸、含有所述变体的药物组合物及其使用方法。 本发明进一步提供针对所述PEDF变体的离析抗体。
出乎意料的是，现在揭示，在位点24、 114和227包含三个带负电荷 的氨基酸残基、替换在这些位置自然存在的丝氨酸残基并因此模仿CK2 和PKA磷酸化的PEDF变体表现出优良的抗血管生成活性。相对于仅在位 置24和114包含两个带负电荷的氨基酸残基的PEDF变体(它仅模仿由 CK2进行的磷酸化)，在下文被称为EEE变体的该三重变体显示为更有效 的抗血管生成因子，并且远比重组野生型PEDF更有效。令人惊讶的是， EEE变体表现出高的神经营养活性。由EEE变体获得的神经营养活性类似 于重组野生型PEDF的神经营养活性，但显著高于在丝氨酸24和丝氨酸 114处具有两个带负电荷的氨基酸残基的PEDF变体的神经营养活性，后 者表现出可以忽略不计的神经营养活性。因此，出乎意料的是，该新颖 PEDF EEE变体表现出较高的抗血管生成活性，同时保留了重组野生型 PEDF的神经营养活性。
进一步揭示，包括丝氨酸24、 114和227的三个氨基酸置换的PEDF 变体表现出有效的抗血管生成活性，所述氨基酸置换中仅丝氨酸24和114被带负电荷的氨基酸残基置换。这一抗血管生成活性低于包含模仿CK2 和PKA磷酸化的三个带负电荷的tt酸残基的EEE变体所表现出的抗血 管生成活性，但类似于包含仅模仿CK2磷酸化的两个带负电荷的氨基酸残 基的PEDF变体所表现出的抗血管生成活性。包含在丝氨酸24、 114和227 的三个氨基酸置换的PEDF变体具有可以忽略不计的神经营养活性，所述 氨基酸置换中仅丝氨酸24和114被带负电荷的氨基酸残基置换。
根据第一方面，本发明提供一种抗血管生成的色素上皮衍生因子 (PEDF )变体或其类似物或融合蛋白，它包含源自人类PEDF ( SEQ ID NO:l)或其片段的改性tt酸序列，其中该改性M酸序列包含多个被改 变的磷酸化位点，它不同于一种包含仅由在丝氨酸24和丝氨酸114处的两 个被改变的磷酸化位点组成的PEDF变体或其类似物、片段或融合蛋白。
应该明白，本发明包含其他哺乳动物如小鼠、牛、猪等等的PEDF变体。
根据一些实施方案，本发明提供一种抗血管生成的PEDF变体，它包 含源自人类PEDF ( SEQ ID NO: 1)的改性氨基酸序列，其中该改性氨基酸 序列包含多个被改变的磷酸化位点，它不同于一种仅由在丝氨酸24和丝 氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点组成的PEDF变体或类似物、其片 段或融合蛋白。应该理解，PEDF变体的类似物、片段和融合蛋白在本发 明的范围之内。
才艮据另外的实施方案，本发明提供一种抗血管生成的PEDF变体，它 包含人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO: 1的变体，其中该变体包含多个被 改变的磷酸化位点，条件是该变体不同于仅由在丝氨酸24和丝氨酸114 处的两个被改变的磷酸化位点组成的PEDF变体或其类似物、片段或融合 蛋白。
根据一些实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合蛋白 或片段包含两个被改变的磷酸化位点，该磷酸化位点从由丝氨酸24和丝 氨酸227;以及丝氨酸114和丝氨酸227组成的组中选择。
才艮据一些优选实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合
12蛋白或片段包含在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变的 磷酸化位点。
根据进一步的实施方案，包含三个被改变的磷酸化位点的抗血管生成 的PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段具有神经营养活性。根据另外 的实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片,更的三 个被改变的磷酸化位点被带负电荷的氨基酸残基置换。根据一个示例性实 施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物或融合蛋白包含SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列或其片段。根据一个特定的示例性的实施方案，PEDF 变体包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
才艮据另外的实施方案，具有神经营养活性的抗血管生成的PEDF变体、 其类似物、融合蛋白或片段包含三个被改变的磷酸化位点，其中丝氨酸24 和丝氨酸114被非极性的氨基酸残基置换，且丝氨酸227被选自带负电荷 的氨基酸和非极性氨基酸残基的氨基酸残基置换。根据一些示例性实施方 案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物或融合蛋白包含选自SEQ ID NO:3 和SEQ ID NO:4或其片段的氨基酸序列。根据特定的示例性实施方案， PEDF变体包含选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
根据进一步的实施方案，包含三个被改变的磷酸化位点的抗血管生成 PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段基本上缺乏神经营养活性。根据 一些实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段的 丝氨酸24和丝氨酸114被带负电荷的氨基酸残基置换，且丝氨酸227被非 极性的氨基酸残基置换。根据一个示例性的实施方案，抗血管生成PEDF 变体、其类似物或融合蛋白包含SEQEDNO:5所示的氨基酸序列或其片段。 根据一个特定的示例性实施方案，PEDF变体包含SEQ ID NO:5所示的氨 基酸序列。
应该理解，本发明进一步包含人类PEDF的变体、其类似物、片段和 融合蛋白，其中三个被改变的磷酸化位点从由以下各项所组成的组中选 择带负电荷的氨基酸残基置换丝氨酸24和丝氨酸227，且非极性的tt 酸残基置换丝氨酸114;带负电荷的氨基酸残基置换丝氨酸114和丝氨酸 227，且非极性的氨基酸残基置换丝氨酸24。根据另外的实施方案，所述被改变的磷酸化位点通过化学改性获得。
根据一些实施方案，化学改性选自糖基化、氧化、永久磷酸化、还原、 十四烷基化、硫酸盐化、酰化、乙酰化、ADP核糖基化、酰胺化、羟基化、 硤化、曱基化和封闭基团衍生化。
根据另一方面，本发明提供一种编码抗血管生成的PEDF变体或其类 似物或融合蛋白的离析多核苷酸序列，它包含具有人类PEDF核苷酸序列 SEQEDNO:6的变体或其片段，该变体或其片断编码包含多个被改变的磷 酸化位点的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白，条件是所述PEDF 变体不同于仅由在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点组 成的变体。
根据一些实施方案，本发明提供一种编码抗血管生成PEDF变体的离 析多核苷酸序列，它包含具有人类PEDF核苷酸序列SEQ ID N0:6的变体， 该变体编码包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体，条件是所述PEDF 变体不同于仅由在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点组 成的变体。
根据一些实施方案，所述离析多核苷酸序列编码抗血管生成的PEDF 变体或其类似物、片段或融合蛋白，其中所述PEDF包含选自下述组的两 个被改变的磷酸化位点丝氨酸24和丝氨酸227;以及丝氨酸114和丝氨 酸227。
根据一些优选实施方案，该离析多核苷酸序列编码抗血管生成的 PEDF变体或其类似物、片段或融合蛋白，其中所述PEDF包含在丝氨酸 24、丝氨酸114和丝氨酸227的三个被改变的磷酸化位点。
根据一些实施方案，由离析多核苷酸序列编码的包含三个被改变的磷 酸化位点的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白具有神 经营养活性。才艮据另外的实施方案，由离析多核香酸序列编码的抗血管生 成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白的三个被改变的磷酸化位点 被带负电荷的氨基酸残基置换。根据一个示例性实施方案，编码包含被带 负电荷的氨基酸残基置换的三个被改变的磷酸化位点的抗血管生成的 PEDF变体或其类似物或融合蛋白的离析多核苷酸序列包含SEQ ID NO:7或其片段。根据一个特定的示例性实施方案，编码PEDF变体的离析多核 苷酸序列包含SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
根据另外的实施方案，离析多核苷酸序列编码包含三个被改变的磷酸 化位点的抗血管生成的PEDF变体或其类似物、片段或融合蛋白，其中抗 血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白的丝氨酸24和丝氨酸 114被非极性的氨基酸残基置换，且丝氨酸227被选自下述组的氨基酸残 基置换带负电荷的氨基酸残基和非极性的氨基酸残基。根据一些示例性 实施方案，编码抗血管生成的PEDF变体或其类似物或融合蛋白的离析多
选择的核苷酸序列。根据特定的示例性实施方案，编码PEDF变体的离析 多核苷酸序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的核香酸序列。
根据进一步的实施方案，由离析多核苷酸序列编码的包含三个被改变 的磷酸化位点的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白基 本上缺乏神经营养活性。根据一些实施方案，离析多核苷酸序列编码抗血 管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白，其中该抗血管生成的 PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白的丝氨酸24和丝氨酸114被带负 电荷的氨基酸残基置换，且丝氨酸227被非极性的氨基酸残基置换。根据 一个示例性实施方案，编码抗血管生成的PEDF变体、其类似物或融合蛋 白的离析多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 10所示的核苦酸序列或其片段。 根据特定的示例性实施方案，编码PEDF变体的离析多核苷酸序列包含 SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。
根据进一步的方面，本发明提供一种表达载体，该表达载体包含编码 根据本发明原理的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白 的离析多核苷酸序列。
根据更进一步的方面，本发明提供一种包含表达载体的宿主细胞，所 述表达载体包含编码根据本发明原理的抗血管生成的PEDF变体、其类似 物、片段或融合蛋白的离析多核苷酸序列。
根据另一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含作 为活性成分的根据本发明原理的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段；以及药学上可接受的载体。
根据进一步的方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含 作为活性成分的根据本发明原理的编码抗血管生成的PEDF变体或其类似 物、融合蛋白或片段的离析多核香酸序列；以及药学上可接受的载体。
根据更进一步的方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包 含作为活性成分包含离析多核苷酸序列的表达载体，其中所述离析多核 苷酸序列编码根据本发明原理的抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合 蛋白或片段；以及药学上可接受的载体。
根据更进一步方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含 作为活性成分的包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码根据本 发明原理的抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段的离析多 核苷酸序列；以及药学上可接受的载体。
根据另 一 方面，本发明提供 一 种用于治疗患者与新血管形成相关的疾 病或病症的方法，该方法包括为有相应需要的患者施用治疗有效量的根据 本发明原理的药物组合物。
才艮据一些实施方案，与新血管形成相关的疾病或病症/人由癌症、眼疾 和用抗血管生成因子治疗的病症所组成的组中选择。
才艮据另外的实施方案，与新血管形成相关的疾病或病症是选自下迷组 的癌症肉瘤、癌瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原 性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、 滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤平滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳 腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌汗腺癌、皮脂 腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、嚢腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、 肝细胞瘤导管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、维尔姆斯氏瘤子 宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星 形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、 成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma )、黑 色素瘤和神经母细胞瘤。
16根据另外的实施方案，用本发明的方法治疗的眼疾从由以下所组成的
组中选择新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、视网膜母细胞瘤、
晶体后纤维组织增生、葡萄膜炎、早熟性视网膜病、黄斑变性、角膜移植 片新血管形成、视网膜肿瘤和脉络膜肿瘤。根据进一步的实施方案，用抗
血管生成因子治疗的病症从由以下所组成的组中选择血管瘤、关节炎、 牛皮癣、血管纤维瘤、动脉粥样硬化斑、血友病性关节病和肥厚性瘢痕。
根据进一步的方面，本发明提供一种用于治疗患者神经变性病状的方 法，该方法包括为有相应需要的患者施用治疗有效量的根据本发明原理的 药物组合物。
根据一些实施方案，神经变性病状从由以下所组成的组中选择多发 性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病、重症肌无力、运动原神经病、格-巴二氏综合症、自身免疫神经病、Lambert-Eaton类重症肌无力综合征、肾 上腺炎神经疾病、肾上腺炎小脑萎缩、非肾上腺炎僵人综合症、渐进性小 脑萎缩、Rasmussen氏脑炎、肌萎缩侧索硬化、Sydeham舞蹈病、Tourette 综合症、自身免疫性多内分泌病、免疫异常性神经病、获得性神经性肌强 直、多关节弯曲症、视神经炎和全身肌强直综合症。
才艮据另外的方面，本发明才是供与选自下述组的多肽特异性结合的离析 抗体或其片段(a)包含源自人类PEDF ( SEQ ID NO: 1 )的改性氨基酸序 列的抗血管生成PEDF变体，该变体包含至少一个带负电荷的被改变的磷 酸化位点；(b) (a)的片段；(c) (a)或(b)的类似物，其中所迷离析抗 体不结合具有非磷酸化丝氨酸或不带负电荷的被改变的磷酸化位点的相 应人类PEDF tt酸序列SEQ ID NO:l 。
根据一些实施方案，本发明提供了特异性结合人类PEDF氨基酸序列 SEQIDNO:l的变体的离析抗体或其片段，该变体或其片段包含至少一个 带负电荷的被改变的磷酸化位点，其中所述离析抗体不结合具有一个非磷 酸化丝氨酸或一个不带负电荷的被改变的磷酸化位点的相应的人类PEDF 絲酸序列SEQ ID NO: 1 。
根据另外的实施方案，该离析抗体或其片段特异性结合到包含一个在 丝氨酸24处的被改变的磷酸化位点的PEDF变体或其片段或类似物。根据示例性的实施方案，所述离析抗体或其片段特异性结合到包含选自SEQ ID NO: 2、 5、 11和12的氨基酸序列的PEDF变体。
根据进一步的实施方案，所述离析抗体或其片段特异性结合到包含一 个在丝氨酸227处的被改变的磷酸化位点的PEDF变体或其片段或类似物。 根据示例性的实施方案，该离析抗体或其片段特异性结合到包含选自SEQ ID NO: 2、 3和13的氨基酸序列的PEDF变体。
根据另外的实施方案，所述离析抗体或其片段特异性结合到包含一个 在丝氨酸114处的被改变的磷酸化位点的PEDF变体或其片段或类似物。 根据示例性的实施方案，该离析抗体或其片段特异性结合到包含选自SEQ ID NO: 2、 5、 12和14的氨基酸序列的PEDF变体。
根据进一步的实施方案，所述离析抗体或其片段特异性结合到包含在 丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点的PEDF变体或片段 或其类似物。根据示例性的实施方案，该离析抗体或其片段特异性结合到 包含选自SEQ ID NO: 2、 5和12的氨基酸序列的PEDF变体。
根据更进一步的实施方案，所述离析抗体或其片段特异性结合到包含 在丝氨酸24和丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变的磷酸化位点的 PEDF变体或片段或其类似物。根据示例性的实施方案，该离析抗体或其 片段特异性结合到包含SEQIDNO:2的tt酸序列的PEDF变体。
根据另外的实施方案，所述离析抗体或其片段选自多克隆抗体、单克 隆抗体、Fab、 F (ab) 2、嵌合抗体和单链抗体。
根据进一步的方面，本发明提供一种产生本发明的PEDF变体的方法， 该方法包括在促进PEDF变体或其片段或类似物的表达的条件下，培养 含有编码本发明的PEDF变体、其片段或类似物的多核苷酸的原核和/或真 核宿主细胞，以及随后回收该变体或其片段或类似物。
结合附图、说明书、实施例和所附权利要求，可以更好地理解本发明 的这些和其他实施方案。
附图简述
图1A-D示出PEDF的CK2和PKA磷酸化之间的相互影响。图1A， 在不同pH的緩沖液(已指出)中预透析的重组PEDF (rPEDF)和S24、 114E变体(EE)被PKA磷酸化。SDS凝胶用考马斯蓝染色(下图)，并 经过放射自显影(上图)。图1B，用在磷酸化之前经过热处理的rPEDF和 S24、 114E变体(EE)进行图1A的实验。图1C，在不同pH的緩冲液(已 指出)中预透析的rPEDF和S24、 114A变体(AA)由PKA磷酸化，在磷 酸化之前经过或没有经过热处理。磷酸化的产物通过SDS-PAGE和放射自 显影(上图)或通过用抗PEDF抗体进行免疫印迹(下图)来分析。图1D, 血浆PEDF (plPEDF)、 rPEDF、 S227A和S227E变体由CK2磷酸化，在 磷酸化之前经过或没有经过热处理。如在图1A的图中所描述的来分析磷 酸化的产物。
图2A-C示出体外PEDF的CK2和PKA磷酸化。图2A示出PEDF变 体的图示，其中Ser24、 Serl14和/或Ser227被置换为Ala或Glu。图2B 和2C, rPEDF和rPEDF变体由CK2 (图2B )或由PKA (图2C)磷酸化， 且磷酸化的产物通过SDS-PAGE后放射自显影(上图)并用抗PEDF抗体 进行免疫印迹(下图)来分析。
图3A-C示出在人类脐带血管内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cell, HUVEC)中rPEDF变体对ERK活化和增殖的影响。图 3A，用指示的rPEDF变体刺激HUVEC。胞浆提取物用抗磷酸ERK抗体 (叩ERK,上图)或抗普通ERK抗体(agERK，下图)进行免疫印迹。 指示ERK2和ERK1的位置。图3B，图1A中的结果的定量分析，表示为 ERK1和ERK2两者的ERK活化。图3C，用血浆(pi) PEDF、 rPEDF或 PEDF变体培养HUVEC。在48个小时后，用亚曱蓝法测定细胞数量。
图4A-B示出rPEDF及其变体对PEDF诱导的神经营养活性的影响。 图4A，用rPEDF或rPEDF变体培养视网膜母细胞瘤Y-79细胞。在细胞附 着到聚-D-赖氨酸涂布的平板上7天之后，通过倒置显微镜观察细胞形态。 图4B,在图4A图中呈现结果的定量分析。*尸<0.01; **尸<0.05表示用rPEDF 处理的细胞与用各种PEDF变体处理的细胞之间的比專交。
图5A-B示出PEDF变体对中等的bFGF诱导的新血管形成的抗血管生成活性。图5A,在存在或没有bFGF (300 ng/ml)的情况下，给CD-1 棵鼠皮下注射0.5 ml包含rPEDF、 plPEDF和PEDF变体的基质胶 (Matrigel)。对照塞(plug)仅用PBS或bFGF处理。7天之后，宰杀小 鼠，塞经过H&E染色并且在光学显微镜(x40放大)下拍照。图5B,通 过计数3个不同横截面面积的血管的数目/视野(field)来量化血管生成。 *尸<0.01表示在用bFGF处理的塞和用bFGF和PEDF变体处理的塞之间的 差异的统计显著性。
图6A-B示出PEDF变体对大范围的bFGF诱导的新血管形成的抗血 管生成活性。图6A，在存在或没有bFGF ( 500ng/ml)的情况下，给CD-1 棵鼠皮下注射0.5 ml包含PEDF变体的基质胶。对照塞仅用PBS或bFGF 处理。7天之后，宰杀小鼠，塞经过H&E染色并且在光学显微镜(x40放 大)下拍照。图6B,通过计数3个不同截面面积的血管的数目/视野来量 化血管生成。**尸<0.05表示在用bFGF和EEE变体处理的塞和用bFGF和 EEA或S24、 114E变体处理的塞之间的差异的统计显著性。
图7示出PEDF的差别磷酸化状态和它们对PEDF功能的影响的图示。
图8A-B示出EEE三重变体对无胸腺小鼠中DU145异种移植物生长 的影响。图8A，用EEE变体处理植入DU145细胞的CD-1棵鼠。用PBS 处理对照组。肿瘤体积相比较于其初始大小呈现倍增。图8B,第36天的 肿瘤照片。左边，从PBS处理的组切离的肿瘤。右边，从EEE变体处理 的组切离的肿瘤。
图9A-C示出通过抗CK2或抗PKA磷酸化PEDF多克隆抗体识别 PEDF变体。图9A,重组PEDF( r )或血浆PEDF( pl )经过叩Ser24、邵Ser227 或aPEDF抗体免疫印迹。图9B， rPEDF或plPEDF用马铃薯酸性石寿酸酶 (PAP)处理，然后用叩Ser24、邵Ser227或aPEDF抗体进行免疫印迹。 对照试样不进行处理。图9C， rPEDF、 EEA、 AAE、 EEE或AAA变体用 apSer24、叩Ser227或aPEDF抗体进行免疫印迹。
发明详述本发明提供包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体、其片段、类 似物和融合蛋白。本发明也提供了编码PEDF变体、其片段、类似物和融 合蛋白的离析核酸，该PEDF变体、其片段、类似物和融合蛋白包含多个 被改变的磷酸化位点并具有抗血管生成活性。
根据本发明，自然存在的人类PEDF ( SEQ ID NO:l)包含两个CK2 磷酸化位点和一个PKA磷酸化位点。CK2磷酸化位点位于丝氨酸残基24 和114，而PKA磷酸化位点位于位点227的丝氨酸残基。
根据一个方面，本发明提供一种离析的抗血管生成的PEDF变体、其 类似物或融合蛋白，它包含SEQIDNO:l或其片段的氨基酸序列，该SEQ IDNO:l或其片段包含多个被改变的磷酸化位点。
术语"PEDF变体"在这里是指相对于自然存在的PEDF而包含改性的 或被改变的氨基酸序列的PEDF蛋白质，其中至少两个、优选至少三个磷 酸化位点被改变，该变体保留抗血管生成活性。应该理解，本发明尤其涉 及人类PEDF ( SEQ ID NO:l )，但是由于人类PEDF和源自其他哺乳动物 的PEDF之间具有高度同源性，所以本发明涵盖其他哺乳动物如小鼠、牛、 猪等等的PEDF。
通常以离析形式提供PEDF变体。术语"离析，，指变体从自然地伴随天 然序列的其他生物组分中分离出来，所述其他生物组分例如蛋白质、多核 苷酸等。优选地，PEDF变体^皮提纯至同质性的。
术语"多个"被改变的磷酸化位点指至少两个被改变的磷酸化位点、优 选地至少三个被改变的磷酸化位点。
才艮据一些实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物或融合蛋白 包含两个选自下述组的磷酸化位点丝氨酸24和丝氨酸227;以及丝氨酸 114和丝氨酸227。在丝氨酸24和丝氨酸114处均包含被改变的磷酸化位 点的PEDF变体被排除在本发明之外。
才艮据一些优选的实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片 段或融合蛋白包含在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变 的磷酸化位点。
21根据一些实施方案，本发明提供一种与野生型重组PEDF相比较具有 减少的神经营养活性的PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白。优选地， PEDF变体、其片段或类似物具有神经营养活性。
在这里使用的术语"片段"指PEDF的全长氛基酸序列的任何一部分， 该部分具有比PEDF的全长氨基酸序列少的氣基酸，例如少于人类PEDF (SEQ ID NO:l )的418个氨基酸，该部分仍然包含多个被改变的磷酸化 位点并且仍然保有抗血管生成活性。通常，全长蛋白质的一部分是肽、多 肽或蛋白质。"肽，，表示由不超过50个氨基酸组成的氨基酸序列。"多肽" 表示通常由超过50个氨基酸残基组成的UJ菱序列。"蛋白质"表示一个或 多个共价键合的多狀链。术语肽、多肽和蛋白质在本说明书中可互换使用。
在这里使用的术语"抗血管生成的"活性被用来定义PEDF变体减少或 抑制内皮细胞增殖和/或减少或抑制内皮细胞迁移和/或诱导内皮细胞凋亡 和/或减少或抑制新血管形成的能力。抗血管生成活性可以用本领域中已知 的各种方法检测。用于测定血管生成的或抗血管生成的活性的体外试验或 体内试验的例子包括小鼠角膜新血管形成、鸡绒毛尿胶嚢膜试验、兔角膜 嚢袋试验、主动脉环试验和基质胶塞中新血管形成的试验(还参见下文实 施例)。
在这里使用的术语"类似物"指相比较于自然存在的PEDF (优选地是 SEQ ID NO:l的人类PEDF )具有改性氨基酸序列的PEDF肽、多肽或蛋 白质，它包含多个被改变的磷酸化位点和至少一种氨基酸置换、添加、缺 失和/或化学改性。对于使用"氨基酸置换"，意思就是功能上等效的氨基酸 残基置换该序列中的残基，导致静态改变(Silent change )。例如，在序列 里的一个或多个氨基酸残基可被另一相似极性的氨基酸置换，该相似极性 的氨基酸充当功能等效物，这就获得静态改变。在序列内氨基酸的置换物 可以从该氨基酸所属类别的其他成员中选择。例如，非极性(疏水的)氨 基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨 酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、 酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性的)氨基酸包括精氨酸、 赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此类置换被认为是保守置换。另外，本发明包含非保守置换。可以进行非保
守置换以使得PEDF变体、其类似物或片段的生物活性(例如，抗血管生 成活性)被保留或者被提高。应该明白，本发明包含PEDF类似物，其中 至少两个氨基酸残基被其他氨基酸置换以产生PEDF变体的抗血管生成类 似物，相比较于自然存在的PEDF或野生型重组PEDF,该类似物具有增 加的稳定性或更长的半衰期。
本发明的类似物包括与人类PEDF ( SEQ IDNO:l)或其片段至少具有 70%相似性的肽、多肽或蛋白质，优选地与人类PEDF ( SEQ IDNO:l )或 其片段至少具有80%同源性，更优选地与人类PEDF (SEQIDNO:l)或其 片段至少具有90%同源性，最优选地与人类PEDF ( SEQ ID NO:l)或其片 段至少具有95%同源性。通过比较一种多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸 置换物和另 一种多肽的序列，确定两种多肽之间的术语"相似性"。
在这里使用的术语"被改变的磷酸化位点"指通过氨基酸置换和/或化 学改性而改变磷酸化位点。应该明白，在一个磷酸化位点中丝氨酸或苏氨 酸残基的置换意思是指保守的、但优选地是指非保守的置换。因此，位于 CK2或PKA的磷酸化位点的丝氨酸残基置换包括置换成非极性的氨基酸、 置换成带负电荷的氨基酸或置换成带正电荷的氨基酸、优选地置换成带负 电荷的氨基酸。在这里使用的术语"改性tt酸"指通过氨基酸置换和/或化 学改性的氨基酸改变。术语改变和改性在说明书和权利要求中可互换地使 用。
由于在蛋白质中的一个丝氨酸残基的磷酸化与一个带负电荷的磷酸 基团添加到该丝氨酸相关联，所以，带负电荷的氨基酸对丝氨酸的置换模 仿磷酸化的丝氨酸并因此用于表征该磷酸化的生物学意义。重要的是，尽 管磷酸化的蛋白质通过体内磷酸酶活性而被去磷酸化，但是带负电荷的氨 基酸对丝氨酸的置换产生了在那个位点有永久带负电荷的氨基酸的蛋白 质。
如下文所示，由谷氨酸残基对在重组人类PEDF的24、 114和227位 点的丝氨酸残基进行置换，得到具有高抗血管生成和神经营养活性的 PEDF变体。把在位点24和114的丝氨酸残基置换成谷氨酸，同时把在位
23点227的丝氨酸残基置换成丙氨酸，得到具有抗血管生成活性但几乎无神 经营养活性的PEDF变体。把在位点24和114的丝氨酸残基置换成丙氨酸 而把在位点227的丝氨酸残基置换成谷氨酸，得到的PEDF变体具有低于 重组野生型PEDF的神经营养活性但类似于重组野生型PEDF的抗血管生 成活性。把所有三个丝氨酸残基置换成丙氨酸，得到具有类似于重组野生 型PEDF的神经营养活性和抗血管生成活性的PEDF变体。
术语"神经营养，，活性在此定义为诱导神经细胞表型分化的能力。例如， PEDF诱导所培养的视网膜母细胞瘤细胞分化的能力被认为是神经营养活 性。PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白可以基本上缺乏神经营养活 性。谈及基本上缺乏神经营养活性，意思是指PEDF变体、其片段、类似 物或融合蛋白具有不超过20%的重组野生型PEDF神经营养活性，优选地 不超过重组野生型PEDF神经营养活性的10%，更优选地不超过5%。
本发明包含含有化学改性氨基酸残基的PEDF变体、其类似物、片段 或融合蛋白。氨基酸残基的改性包括但不限于糖基化、氧化、永久磷酸化、 还原、十四烷基化、硫酸化、酰化、乙酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、环 化、二硫键形成、羟基化、碘化、曱基化、保护/封闭基团衍生化或在本领 域中已知的任何其他衍生化方法。这样的改性可以在PEDF变体、其类似 物或片段的序列的任何位置发生，包括肽主链、氨基酸支链、氨基或羧基 末端。
包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体、片段及其类似物可通过 在本领域中已知的各种方法产生，包括重组产生或合成产生。重组产生可 通过使用编码PEDF变体、其片段或类似物的离析多核苦酸实现，该离析 多核苷酸可操作连接到用于多核苷酸表达的启动子。任选地，增加该启动 子的调节子、核糖体结合位点、翻译起始和转录终止子。包含编码PEDF 变体、其片段或类似物的多核苷酸、启动子和任选地调节子、核糖体结合 位点、翻译起始和转录终止子的构建体可置于载体中，如质粒、病毒或嗜 菌体载体。载体可用于转染或转化宿主细胞，例如细菌、酵母菌、昆虫或 哺乳动物细月包。
本发明也包含通过使所述PEDF变体或其类似物经过至少一种裂解剂处理而产生的PEDF片段。裂解剂可以是化学裂解剂如溴化氰，或者可以 是酶，优选地可以是内切蛋白酶。可用于切割PEDF变体或其类似物的内 切蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶或在本领 域中已知的产生蛋白水解片段的任何其他酶。
合成的肽、多肽或蛋白质是本领域公知的，且可以商业途径获自多个 公司。包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体、片段或其类似物可使 用标准直接肽合成法合成(参见Bodanszky, 1984, Principles of Peptide Synthesis(肽合成原理)，Springer-Verlag， Heidelberg),例如通过固相合成 法(例如，参见Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 )。固相肽 合成方法的例子包括把叔丁基氧化羰基用作a氨基保护基团的BOC方法 以及利用9-亚药基曱基氧化羰基保护氨基酸残基的a-氨基的FMOC方法， 这两种方法在本领域中广为人知。此外，如果需要，非经典的氨基酸或化 学氨基酸类似物可作为置换物或添加物引入PEDF变体、其片段或类似物 中。非经典的氨基酸包括但不限于oc-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、羟基脯 氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯 基甘氨酸、环己基丙氨酸等等。
本发明进一步包含PEDF变体、其片段或类似物，它们可以包含PEDF 的氨基酸的一种或多种D-异构体形式。 一旦使用本发明，产生逆反D-氨 基酸的PEDF肽就是简单的事情，其中该肽用所公布的相同氨基酸制备， 但至少一种氨基酸或也许所有的氨基酸是D-氨基酸。当在肽中的所有氨基 酸都是D-氨基酸且分子的N-和C-末端逆转时，得到这样一种分子该分 子与其L-氨基酸形式在相同的位点具有相同的结构基团。但是，在对抗蛋 白水解降解方面，这种分子更稳定，因此可用于在此叙述的许多应用中。
本发明的范围包括含有PEDF变体、其片段或类似物的嵌合蛋白或融 合蛋白，该PEDF变体、片段或其类似物在其氨基或羰基末端或者在一个 支链处经由肽4建与不同蛋白质的氨基酸序列连接。这样的嵌合蛋白可用蛋 白质合成法制备，例如，通过使用肽合成器，或通过使用在本领域中已知 的方法使编码所需要的氨基酸序列的适当核酸序列以适当的编码框架互 相连接，以及通过在本领域中众所周知的方法表达嵌合蛋白。
25根据另一方面，本发明提供一种离析多核苷酸序列，它包含源于人类
PEDF核苷酸序列SEQ ID NO:6的改性核苷酸序列，该人类PEDF核苷酸 序列SEQ ID NO:6编码包含源于包含多个被改变的磷酸化位点的SEQ ID NO:l的改性氨基酸序列的抗血管生成的PEDF变体或片段、其类似物或融 合蛋白，条件是相比于仅由两个在丝氨酸24和丝氨酸114被改变的磷酸 化位点所组成的SEQ ID NO:l ，该离析多核苷酸序列不编码包含一种改性 氨基酸序列的PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白。简单起见，在下 文说明中使用的术语"PEDF变体"应该被解释成包括PEDF变体的所有形 式，包括含有多个被改变的磷酸化位点的其类似物、片段及融合蛋白，并 具有抗血管生成活性。
应该理解，这里使用的术语"改性核苷酸序列"和"核苷酸序列变体"指 相对于人类PEDF的核苷酸序列SEQIDNO:6而改变的核苷酸序列，所述 改变优选地通过导致在磷酸化位点的不同氨基酸的核普酸置换。
术语"多核苷酸"意指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的聚 合体，该聚合体可源自于任何源，可以是单链或双链，并且可以任选包含 能够摻入DNA或RNA聚合体的合成的、非天然的、或被改变的核苷酸。
"离析多核苷酸"指与自然存在状态下在其侧面的序列分离的多核香酸 区段或片段，例如，从通常毗邻该片段的序列中移出的DNA片段，所述 序列例如在基因组中自然存在的与基因组片段毗邻的序列。该术语也适用 于完全从天然伴随核酸(例如RNA或DNA)的其他成分或在细胞中天然 与之伴随的蛋白质提纯而来的多核苷酸。因此该术语包括例如掺入载体、 自主复制的质粒或病毒或者原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组 DNA,或作为独立于其他序列的单独分子(例如，作为通过PCR或限制 酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)而存在的重组DNA。也包 括重组DNA和RNA如mRNA，其中该重组DNA是编码另外的多肽序列 的杂合基因的部分。
术语"编码"指在离析多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中的特定 核苷酸序列的固有性质，用作生物过程中其他聚合体和大分子的合成模 板，其中所述聚合体和大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA, tRNA
26和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性。因此，如果对 应于所述一种基因的转录和mRNA的翻译在细胞或其他生物系统内产生 一种多肽或蛋白质，则该基因就编码该多肽或蛋白质。其核苷酸序列与 mRNA序列相同并通常在序列表中提供的编码链以及被用作基因或cDNA 的转录模板的非编码链，可以说是编码该基因或cDNA的多肽或蛋白质或 其他产物。
本领域的技术人员应明白，正如所谓的"Wobble规则，，所给出的那样， 考虑到遗传密码的筒并以及允许把在密码子的第三个位点上的经典碱基 配对排除在外，多种核酸可以编码任何给定的多肽或蛋白质。此外，包括 或多或少的核苷酸的多核苷酸可产生相同的或等价的多肽或蛋白质。因 此，本发明预期包含编码SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:5的絲酸序列及其 类似物、片段或融合蛋白的多核苷酸。
本发明的多核苷酸也具有在框架中^^皮融合到标记序列的编码序列，这 允许本发明多肽的提纯。对于细菌宿主的情况，标记序列可以是六联组氨 酸标签(six histidine tag),对于哺乳动物宿主的情况，标记序列可以是血 凝素(HA)标签。
编码野生型或自然PEDF蛋白质的多核苷酸序列是已知的(例如，参 见公布的国际专利申请第WO 95/33480和WO 93/24529号)，可从在此讨 论的多肽序列推断出其他多核苷酸序列。根据特定的实施方案，本发明提 供一种多核苷酸序列，它编码从SEQ ID NO:7到SEQ ID NO: 10中选择的 PEDF变体。
PEDF多核苷酸可以被表达成被转运的蛋白质，其中PEDF变体从包 含多核苷酸的宿主细胞在其中生长的培养基中离析出来，或可以通过缺失 前导或其他肽而被表达成胞内蛋白质，此种情况下PEDF从宿主细胞离析 出来。然后，这样离析出来的PEDF用在本领域中已知的蛋白质提纯方法 提纯。
通过把包含编码PEDF变体、其片段或类似物的离析多核苷酸的表达 载体传递至与感兴趣的组织相关的细胞，PEDF变体、类似物或其片段可 被提供给该感兴趣的组织。所述细胞产生并分泌该PEDF多肽变体，以使得其被合适地提供给该组织里面的细胞以在感兴趣的組织内发挥生物活
性，例如抗血管生成活性或神经营养活性。因此，包含PEDF变体的表达 载体通常包括与已知PEDF序列同源的离析多核苷酸序列，例如，它们将 会在至少低严紧条件下、更优选地在中严紧条件下、最优选地在高严紧条 件下与已知序列的至少一个片段杂交(釆用在Sambrook等.，1989,分子克 隆实验室手册，第二版，ColdSpringHarbor出版社中所提出的低、中、 高严紧性的定义)。
除了编码PEDF变体多肽的离析多核苷酸序列之外，表达载体包含启 动子。在本发明上下文中，启动子必须能够驱动PEDF多核苷酸在细胞内 的表达。许多病毒启动子适合用于这样的表达盒，例如逆转录病毒ITR、 LTR、即时早期病毒启动子(IEp)如疱渗病毒IEp (例如ICP4-IEp和 ICP0-IEp)和巨细胞病毒(CMV) IEp、以及其他病毒启动子(例如，晚 期病毒启动子、潜伏活性启动子(LAP)、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子以 及鼠白血病病毒(MLV)启动子)。其他合适的启动子是真核启动子，包 含增强子序列(例如兔(3-球蛋白调节元件)、组成活性启动子(例如P-肌 动蛋白启动子等)、信号和/或组织特异性启动子(例如可诱导的和/或可抑 制的启动子，如响应于TNF或RU486的启动子、金属硫蛋白启动子等)、 以及肿瘤特异性启动子。
在表达载体内，编码PEDF变体或其类似物或片段的多核苷酸和启动 子可操作地连接，以使得启动子能够驱动编码PEDF变体、其类似物或片 段的多核苷酸表达。只要维持这一可操作的连接，则表达载体可包括超过 一个的基因，如通过内部核糖体进入位点(IRES)分隔的多个基因。此夕卜， 表达载体任选包括其他元件，如剪切位点、多腺苷酸化序列、转录调节元 件(例如增强子、沉默子等)或其他序列。
表达载体必须以使得它们能够表达其中含有的编码PEDF变体、其片 段或类似物的离析多核苷酸的方式被引厶到细胞内。可以这样使用任何合 适的载体，这些载体中有许多在本领域中都是已知的。此类载体的例子包 括棵DNA载体(如寡核苷酸或质粒)、病毒载体如腺相关病毒载体(Berns 等.，1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 772:95-104)、腺病毒载体、疱渗病毒载体(Fink等.，1996, Ann. Rev. N画sci. 19:265-287)、包装扩增子(Federoff 等.，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:1636-1640 )、乳头状瘤病毒载体、小 核糖核酸病毒载体、多瘤病毒载体、逆转录病毒载体、SV40病毒载体、 牛痘病毒载体和其他载体。除了感兴趣的表达载体之外，载体也可包括其 他遗传元件，例如编码选择性标记物的基因(例如，p-gal或赋予毒素抗性 的标记物)、药理活性蛋白质、转录因子或其他生物活性物质。
用于操纵包含离析多核苷酸的载体的方法在本领域中广为人知(例如 参见上文Sambrook等)，包括直接克隆、使用重组酶的位点特异性重组、 同源重组和其他合适的构建重组载体的方法。以此方式，可以将表达载体 构建为它可在任何需要的细胞中复制、在任何需要的细胞中被表达、甚至 可被整合入任何需要的细胞的基因组中。
通过任何适于将DNA转移到细胞之内的方法，把PEDF变体表达载 体引入到细胞之内。许多这样的方法在本领域中广为人知(上文Sambrook 等.；同样参见Watson等.，1992, Recombinant DNA (重组DNA),第12 章，第2版，Scientific American Books )。因此，对于原核细胞的情况，可 以例如通过电穿孔、转化、转导、接合或转移来实现载体导入。对于真核 细胞，导入载体可以通过使用例如电穿孔、转染、感染、DNA涂敷微轰击 粒子或原生质体融合。
如果有必要，在可诱导启动子的控制下PEDF变体多核苷酸已经被转 移到其中的细胞，可用作瞬时转化体。然后，这样的细胞自身可以被转移 到哺乳动物中以获得其中的治疗益处。通常，细胞^皮转移到哺乳动物的一 个部位，以使得在其中表达并从其中分泌的PEDF变体接触预期的细胞如 内皮细胞，以便发挥PEDF活性，例如抑制血管生成。或者，特别地，对 于在体外已经把载体加入到其中的细胞的情况，细胞可以首先经过几轮克 隆选4奪(通常通过在载体中使用选择性标记序列来帮助)以选择稳定的转 化体。然后，此类稳定转化体^皮转移到哺乳动物中以获得其中的治疗益处。
通过把包含编码本发明PEDF变体的离析多核苷酸的载体转染到其他 细胞群中，PEDF变体也可以被提供给细胞例如内皮细胞，由此PEDF变 体在所述其他细胞中表达并从中分泌。之后，这样转染的其他细胞群被转移到哺乳动物的一个部位，其中这样分泌的PEDF变体接触这些细胞例如
内皮细胞并抑制血管生成。PEDF变体从所述其他细胞的表达和分泌有益 于感兴趣的细胞。没有必要把编码PEDF变体的多核苷酸稳定整合入细胞。 在细胞里，可以从非整合或整合的多核苷酸表达和分泌PEDF变体。
在细胞里面，PEDF变体多核苷酸核束达成使得细胞表达和分泌PEDF 变体多肽。可使用标准的分子生物学技术(例如Northern杂交、Western 印迹、免疫沉淀反应、酶免疫测定等等)评估多核苷酸的成功表达。在本 领域中已知用于检测来自转染细胞的PEDF基因的表达和PEDF变体的分 泌的试剂(也参见下文中的实施例)。
通过重组技术产生的PEDF变体可以被提纯，以使得当它被施用患者 时是大致纯的。术语"大致纯"指一种化合物(例如蛋白质或多肽)被从自 然伴随它的成分中分离出来。通常，当试样中至少50%、更优选地至少60%、 更优选地至少75%、更优选地至少90%、最优选地至少99%的总材料(按 体积，按湿重或千重，或按摩尔百分比或摩尔分数)是感兴趣的化合物时， 该化合物就是大致纯的。可用任何适当的方法测量纯度，例如对于多肽或 蛋白质的情况用柱色谱、凝胶电泳或HPLC分析。当基本不受自然结合成 分影响或当从以天然状态伴随的自然杂质分离时，化合物如多肽或蛋白质 也是大致纯的。
抗体
多种免疫原可用来产生可与包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变 体特异性反应的抗体。重组全长PEDF变体或其片段可用于产生抗体。由 在此描述的PEDF变体蛋白质序列获得的合成肽也可作为免疫原用于产生 抗体(见下文的实施例8)。在真核细胞或原核细胞中，重组蛋白质可被表 达、提纯并用作免疫原。如果合适，自然地倍增或变性的蛋白可用于产生 抗体。可以生成单克隆抗体或多克隆抗体。
应该明白，当术语"抗体"被使用时，其意思是包括完整抗体(例如多 克隆抗体或单克隆抗体(mAb ))及其蛋白水解的片段(例如Fab或F (ab') 2片段)。本发明的范围进一步包含嵌合抗体、人类抗体和人源化抗体、重 组和工程抗体及其片段。此外，编码抗体可变区的DNA可被插入编码其
30他抗体的DNA中，以产生嵌合抗体(例如，见美国专利第4,816,567号)。 单链抗体落在本发明范围内。
产生多克隆抗体的方法为本领域中的技术人员所知道。通常，免疫原， 优选为提纯的蛋白质，与辅助剂混合，用该混合物免疫动物。通过进行试 验釆血并测定对目标PEDF变体或片段的反应滴度，来监测动物对免疫原 制剂的免疫反应。当获得适当高的针对免疫原的抗体滴度时，通常在重复 免疫之后，从该动物釆血并制备抗血清。如果需要，可进行抗血清的进一 步分级分离以富集对蛋白质有反应的抗体(例如，见Harlow和Lane( 1988 ) 抗体实验室手册，CSH出版社，其内容通过引用合并于此，如同在此完 整描述)。
可以通过本领域技术人员熟悉的各种技术获得单克隆抗体。通常，一 般通过和骨髓瘤细胞进行融合，使来自用所希望的抗原免疫的动物的脾细 月包无限增殖(见Kohler和Milstein ( 1976 ) Eur. J. Immunol. 6:511 519,通 过引用结合入本文)。无限增殖化的替代方法包括用Epstein Barr病毒、致 癌基因或逆转录病毒的转化，或在本领域中已知的其他方法。篩选单个无 限增殖细胞产生的菌落，以产生具有所需要的抗原特异性和亲合力的抗 体，并且可通过包括注射到脊推动物宿主的腹膜腔在内的各种技术提高由 这种细胞产生的单克隆抗体的产量。或者，例如，依照(Huse,等.(1989) Science, 246: 1275-1281 )中概述的一般方法，通过筛选来自人类B细胞的 DNA库，可以把编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列离析出来。
其它合适的技术包括在噬菌体或类似载体中选择抗体库。例如，见 Huse,等.(1989) Science, 246:1275 1281，和Ward,等.(1989 ) Nature, 341:544 546。可以在存在或没有改性的情况下使用本发明的抗体。然而， 可以通过共价地或非共价地连接提供可检测信号的物质来标记抗体。多种 标记物和扼合技术广为人知，并且在科学文献和专利文献中都被广泛地报 导。合适的标记物包括放射性试剂、酶类、底物、辅因子、抑制剂、荧光 部分、化学发光部分、磁性粒子等等。
药物组合物和给药途径
本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的具有抗血管生成活性的PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白以及药学上可接受的载体， 该PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白包含多个被改变的磷酸化位点。
本发明药物组合物可配制为本发明的蛋白质、多肽或肽的药学上可接 受的盐。术语"药学上可接受的盐"指从药学上可4妻受的无毒碱或酸制备的
盐，该无毒石威或酸包4舌无才几碱或有才;u威以及无4几酸或有才几酸。由无才/u威获
得的盐包括铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰盐、锰、钾、钠、锌 等等。由药学上可接受的有机无毒碱获得的盐包括下述的盐伯胺、仲胺 和叔胺的盐；取代胺，包含天然取代胺；环胺；和阳离子交换树脂，如精 氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N'N-二千基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨 基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、 葡糖胺、葡萄糖胺、组氨酸、海葱次苷(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、 甲基葡糖胺、吗啉、派溱、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、 三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇等等。
当本发明的蛋白质、多肽或肽是碱性时，可以从药学上可接受的、包 括无机酸和有机酸在内的无毒酸制备盐。这样的酸包括乙酸、苯磺酸、安 息香酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烷磺酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、谷氨酸、 氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、 翻酸、硝酸、朴酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和邻甲苯磺酸等 等。尤其优选的是柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、^ii酸和酒石酸。
术语"药学上可接受的"指美国联邦政府或州政府的管理机构批准的， 或在美国药典或其他通常公认的药典中列出用于动物的、特别是用于人类 的。术语"载体"指通过它们施用治疗化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或 i某介物。上述药物载体可以是无菌液体，例如水和油，其中油包括石油、 动物油、才直物油或合成来源的油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等、 聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。当静脉施用药物组合物时，水 是优选的载体。盐溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可用作液体载体，尤其是 用作可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明 胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油硬脂酸酯、滑石、 氯化钠、脱脂乳粉、乙醇等等。如果需要，所述组合物也可包含较少量的润湿剂或乳化剂，或pH緩冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。也包括 诸如苯甲醇或羟苯曱酸甲酯的抗菌剂、诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧 化剂、诸如乙二胺四乙酸的螯合剂、以及诸如氯化钠或葡萄糖的张力调节剂。
所述组合物可采取如下形式溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、
胶嚢、粉剂、持续释放制剂等等。所述组合物可与传统的粘合剂和载体如 甘油三酸酯、微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶制成栓剂。口服制剂可以包括 标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、
碳酸镁等等。在E.W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中描 述了合适的药物载体的例子。所述组合物将包含治疗有效量的抗血管生成 PEDF变体或其片段、类似物或融合蛋白(优选地以大致纯的形式)，以及 适量的载体以便提供适合施用至患者的形式。
有效治疗特定病症或病状的抗血管生成PEDF变体、其片段、类似物 或融合蛋白的量，取决于所述病症或病状的性质，并可用标准临床技术来 测定。另外，可任选地使用体外检验以帮助确定最佳剂量范围。在制剂中 应用的精确剂量还将取决于给药途径以及疾病或病症的严重性，并且应该 依照医师的判断和每个患者的情况来决定。可以从由体外或动物模型试验 生物测定或系统获得的剂量响应曲线外推出有效剂量。
根据感兴趣组织的位置，能够以适于把PEDF变体供给感兴趣组织里 的内皮细胞的任何方式提供PEDF变体、其类似物或片段。因此，例如， 可以把包含PEDF变体源(即上述的PEDF变体多肽、或编码PEDF变体 的离析多核苷酸、或PEDF变体表达载体、或表达PEDF变体的细胞)的 组合物引入体循环，体循环把PEDF源分配到感兴趣组织。或者，包含PEDF 变体源的组合物可被局部地应用到感兴趣的组织(例如，注射，或者作为 连续输液或肿瘤里的弹丸泵入，被应用到全部或部分皮肤表面，被滴在眼 晴表面上，等等)。
包含PEDF变体源的药物组合物的引入方法包括但不限于局部的、 皮内的、肌肉内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的、硬膜外的、 眼的以及口H的途径。以任何方i"更的途径施用所述化合物，例如通过输注或弹丸注射、经由上皮层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等等)的吸收， 并且可以和其他治疗活性剂一起给药。给药最好是局部性的，但也可以是 全身性的。另外，希望以包括脑内注射和鞘内注射在内的任何适当途径把
本发明的药物组合物引入中枢神经系统；可以通过例如连接至贮器的脑内 导管来帮助脑内注射。也可使用肺部给药，例如，通过使用吸入器或雾化 器，并与雾化剂一起配制。
可能希望把本发明的药物组合物局部施用至需要治疗的区域；这可以 通过例如^a不限于下述方式实现在手术时局部输注、局部应用，例如， 与手术后创伤敷料结合，通过注射、借助于导管、借助于栓剂、借助于药 物贴片或借助植入物，其中所述植入物是多孔的、无孔的、或胶状的材料。 才艮据一些优选的实施方案，可通过例如经由注射器在肿瘤或肿瘤组织或肿 瘤前期组织的位置直接注射给药。
对于局部应用，基于需要的活性，抗血管生成PEDF变体、其类似物 或片段可与药学上可接受的载体结合，以便递送有效剂量(即，例如从l.O pM到1.0 mM的有效剂量范围，以緩解或预防局部血管生成)。载体可以 是如下形式(作为例子而非限制)软膏、乳油、凝胶、糊剂、泡沫、气 溶胶、栓剂、衬垫(pad)或胶棒。
用于治疗一些眼疾的局部组合物包含在如下眼科可接受的赋形剂中 的有效量的抗血管生成PEDF变体緩冲盐水、矿物油、诸如玉米油或花 生油的植物油、石蜡油、以及Miglyo1182、醇溶液或脂质体或类脂质体产 品。这些组合物也可以包括防腐剂、抗氧化剂、抗生素、免疫抑制剂和其 他治疗有效物质，它们对抗血管生成PEDF变体不产生有害作用。
对于定向的内部局部应用，药物组合物可以是片剂或胶嚢的形式，它 可以包含任何下列成分或相似性质化合物粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍 树胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、羧甲基淀粉钠 (Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes;或助流剂，如 胶体二氧化硅。当剂量单位形式是胶嚢时，除了上述类型的材料之外，还 可包含诸如脂肪油的液体载体。此外，剂量单位形式可包含改变所述剂量 单位的物理形式的各种其他原料，例如糖衣、虫胶或其他肠内吸收剂。
34可以控制释放系统递送抗血管生成PEDF变体、其片段或类似物。在
一个实施方案中，输液泵可用于施用抗血管生成PEDF变体、其片段或类 似物，例如，用于把力夷岛素或化学疗法递送到特定器官或肿瘤的输液泵。 在一种优选的形式中，抗血管生成PEDF变体、其类似物或片段与生物可 降解的、生物相容的聚合移植物结合给药，该聚合移植物在所选择的位置 在控制时段内释放抗血管生成PEDF变体。优选的聚合材料的例子包括聚 酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯醋酸乙烯酯、共聚物及其混合 物(见，控制释放的医学应用，Langer和Wise (编辑)，1974, CRC出版 社，Boca Raton, Fla.)。然而，在另一个实施方案中，可以把控制释放系统 置于治疗靶附近，这样仅需要全身性剂量的一部分。
PEDF变体的用途
本发明提供一种用于治疗疾病或病症特別是与新血管形成有关的疾 病或病症的方法。该治疗方法包括为有相应需要的患者施用药物组合物， 该药物组合物包括治疗有效量的作为活性成分的PEDF源和药学上可接受 的载体。按照本发明，PEDF源包括PEDF变体多肽，即，抗血管生成 PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白；编码本发明的PEDF多肽变体 的离析多核苷酸序列；包含离析多核苷酸序列的表达载体，该离析多核苷 酸序列编码本发明的PEDF多肽变体；以及用表达载体转染的宿主细胞， 该表达载体包含离析多核苷酸序列，该离析多核香酸序列编码本发明的 PEDF多肽变体。
血管生成的抑制通常被认为是阻止新血管形成，不管它们是通过抽芽 (sprouting)还是通过到达(arrival)而产生并随后分化成循环千细胞的内 皮细胞。然而，由于已经表明PEDF诱导活化的内皮细胞的凋亡，因此在 本发明上下文中血管生成的抑制也应被解释为包括PEDF变体杀伤细胞， 尤其是靠近肿瘤或在肿瘤里的现有血管中的细胞。因此，在本发明上下文 中，血管生成的抑制包括抑制新血管形成，该抑制作用可能伴随着或不伴 随着附近现有血管的破坏。术语"新血管形成，，和血管生成在本说明书和权 利要求书中可互换地使用。
"治疗性"治疗是对呈现病理学病征的患者给药以减少或消除那些病征
35的治疗。
PEDF源的"治疗有效量"是足以为被施用PEDF源的患者提供有益作 用的PEDF源的量。
有相应需要的患者可能患有与新血管形成有关的一种或多种的疾病 或病症，或者可能已^1判定更容易患有与新血管形成有关的疾病或病症。 因此，根据本发明的治疗方法包括治疗和预防两种效用。
可用抗血管生成PEDF源治疗的新生血管性疾病是包括但不限于以下 实体瘤的癌症肉瘤、癌瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、 骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉 瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤平滑肌肉瘤、^黄紋月几肉瘤、结肠癌、月夷腺癌、 乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌汗腺癌、皮 脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、嚢腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、 肝细胞瘤导管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、维尔姆斯氏瘤子 宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星 形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、 成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经 细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
可用抗血管生成PEDF源治疗的、与新血管形成有关的眼疾包括但不 限于新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、视网膜母细胞瘤、晶体 后纤维组织增生、葡萄膜炎、早熟性视网膜病、黄斑变性、角膜移植片新 血管形成、眼炎性疾病、诸如视网膜肿瘤和脉络膜肿瘤的眼瘤、以及与视 网膜、脉络膜或虹膜新血管形成有关的疾病。
可用抗血管生成PEDF源治疗的其他病症包括但不限于血管瘤、关 节炎、牛皮癣、血管纤维瘤、动脉粥样硬化斑块、血友病性关节病和肥厚 性瘢痕。
为了希望的治疗或预防活性并确定治疗有效剂量，可以在体内测定抗 血管生成PEDF变体。例如，在人体试验之前，在适当的动物模型系统中 测试PEDF源，该动物才莫型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等等。对于体内试验，在对人类给药之前，可使用在本领域中已知的任 何动物^f莫型系统(见下文的实施例)。
根据另一方面，本发明提供一种用于治疗患者的神经变性疾病或病症 的方法，该方法包含为有相应需要的患者施用治疗有效量的根据本发明原 理的药物组合物和药学上可接受的载体。
"神经营养"活性在此被解释为具有诱导神经元细胞群分化的能力。例
如，PEDF诱导培养的视网膜母细胞瘤细胞分化的能力被认为是神经营养 活性。神经营养活性也包括神经细胞诱向活性和胶质抑制活性(Gliastatic activity )。"神经细胞诱向，，活性在此解释为提高神经元细胞群的成活率的能 力。"胶质抑制"活性在此解释为抑制神经胶质细胞生长和增殖的能力。
神经元死亡和由神经胶质(神经胶质增生)引起的群体过剩代表了许 多神经变性疾病以及对CNS (脑和视网膜)的其他损伤。PEDF可有效地 -故用于这些病状以延长初级神经元的寿命和功能作用，避免神经胶质的增 加。例如，在阻断响应于CNS损伤的小神经胶质细胞活化以及在延长/保 护神经元的寿命方面，PEDF源是有效的。在视网膜中，可以预测PEDF 抑制马勒神经胶质细胞。由于马勒细胞与星形神经胶质相似，在阻断诸如 视网膜脱离、糖尿病、视网膜色素变性等等的神经胶质增生病状以及保护 视网膜神经元的寿命方面，PEDF源同样是有效的。
一般认为，移植神经元可治愈某些病变。例如，在帕金森氏症中，把 特定胎儿脑细胞移植到病人体内可以减轻或治愈与该疾病有关的问题。尽 管要解决的主要问题之一是延长移植细胞的寿命并使它们保持分化，例 如，分泌适当的物质。用PEDF变体对细胞进行预处理可以在这两个区域 中给予帮助。同样地，在植入前用包含编码PEDF变体的离析多核苷酸的 载体转染神经元或星形神经胶质，这可以是在移植位置的PEDF变体的长 期来源。
在尝试移植神经视网膜和光感受器细胞以帮助治愈失明方面有更多 的活动。由于非分化和移植物死亡，到目前为止，还没有富有成效的尝试。 PEDF源可在两方面提供帮助。具体地，在手术前，待移植的光感受器神 经元可用PEDF源进行预处理。或者，能够以高水平把包含编码PEDF变体的离析多核苷酸的载体转染到相邻的视网膜色素上皮(RPE)细胞，其 中它们可用作蛋白质的超常来源。现在， 一些研究人员已经表明，培养的
RPE细胞在被移植入试验动物的光感受器间空间中之后存活得很好。在体 外，用编码PEDF基因的离析多核苷酸转染人类RPE细胞，使得这些细胞 能够在视网膜移植上使用。
对于自然产生的PEDF,它可存在为高达约250 nM的浓度。因为PEDF 变体是无毒的，它们能够以高度浓缩的剂量供给组织。然而，由于PEDF 变体的潜能，它可以被用在非常低的浓度中，如大约10nM或更低的浓度 (例如，低至0.01nM)。根据包含PEDF源的组合物的剂型，它在足以延 緩血管生成和/或诱导神经营养活性的时程内被供给到所希望的组织中。
在一些方案中，重复应用可以提高PEDF变体的抗血管生成活性和/ 或神经营养活性，在一些应用中可能需要重复应用。对于PEDF源是PEDF 表达载体的情况，表达PEDF变体的细胞可以产生有效量的PEDF变体(也 就是说，足以发挥PEDF的一种或多种生物活性)。
可单独或与其他治疗模式联合施用PEDF变体。把PEDF变体作为包 括诸如手术、药物疗法、光动力学疗法和/或放射疗法的其他疗法的治疗方 案的 一部分进行给药是适当的。
实施例
材料及方法
试剂和抗体
重组人类CK2 (在大肠杆菌中表达)从Calbiochem (达姆 施塔特，德国)购买。釆用如(Beavo J. A.,等,酶学方法，38C: 299-308,1974) 描述的方法提纯PKA的催化亚基。内皮促细胞分裂剂(ECGS)从生物医 学技术公司(Biomedical Technologies Inc.)(斯托顿,马萨诸塞州，美国) 购买。重组人类bFGF (在大肠杆菌中表达)、聚-L-赖氨酸(70-150kDa) 和猪肠肝素从西格玛(Sigma)(圣路易斯，密歇根州)购买。基质胶从碧 迪生物科4支(BD Biosciences)(马萨诸塞州，美国)购买。限制酶从罗氏 制药公司(Roche) (Manhemin,德国)购买。PfiiDNA聚合酶从普洛麦格(Promega)(威斯康星州，美国)购买。对抗PEDF的多克隆抗体由魏兹 曼科学院(Weizmann Institute of Science)的抗体部门制备。全长人类 PEDFcDNA由N.Bouck博士 (西北大学，芝加哥，伊利诺伊州，美国)提 供。
细胞培养
人类Y-79视网膜母细胞瘤细胞在添加了 2 mM L-谷氨酰胺和15%胎牛 血清的MEM中生长。HEK-293T细胞在添加了 10%FCS的DMEMF-12中 培养。HUVEC在添加了 20%FCS、 25吗/ml ECGS促细胞分裂剂和5 U/ml 肝素的M-199中生长。
重组PEDF ( rPEDF)变体的构建
将包含Ser24和Serl14及其突变的区域的F/wdll和f/ "I消化片段 (l画362bp), ( Maik-Rachline, G.,等等，Blood: 299-308, 2005和WO 2006/054278,其内容通过参考合并于此)用含有各种突变的Ser227的质 粒中的相同片段替换，产生三重变体。所得到的三重变体如下
EEE变体，S24、 114E插入片段与经消化的pcDNA3-S227E载体连接。
AAE变体，S24、 114A插入片段与经消化的pcDNA3-S227E载体连接。
AAA变体，S24、 114A插入片段与经消化的pcDNA3-S227A载体连接。
EEA变体，S24、 114E插入片段与经消化的pcDNA3-S227A载体连接。 rPEDF的产生
如(Maik-Rachline,G.,等，Blood:299-308,2005 )中所述，使用 LipofectAMINE试剂把携带rPEDF或变体的各种质粒引入HEK-293T细胞 中，并在N产柱上提纯所分泌的蛋白质。
在此揭示的各种PEDF的氨基酸和核苷酸序列的名称和序列号(SEQ ID NO)如下所示
tt酸核普酸
氨基酸置换名称
SEQ ID NO:SEQ ID NO:
3无rPEDF或plPEDF16
S24,114,227EEEE27
S24,114入227EAAE38
S24，114，227AAAA49
S24,114E,227AEEA510
S24ES24E11
S24,114ES24,114E12
S227ES227E13
S114ES114E14
从人类血浆提纯PEDF
如先前所描述(Maik-Rachline, G.,等，Blood: 299-308, 2005 ),先通过 9-20% PEG切片，然后通过DEAE-Sephacel柱(2.9x40 cm)和肝素琼脂糖 柱，从人类柠檬酸盐血浆(IL)中提纯plPEDF。
PEDF的体外磷酸化
磷酸化试验(40 pi)包含rPEDF、 plPEDF或rPEDF变体(50 jig/ml )。 对于CK2:构成成分是CK2 (4[ig/ml)、甘油(2%)、 NaCl (20mM)、 巯基乙醇(O.lmM)、 MgCl2(20mM)、 [ 2P]-ATP (10 ,)、聚-L-赖氨酸 (200 nM)和Tris-HCl ( 50 mM pH7.4 )。对于PKA:纯的PKA催化亚基 (2.5 pg/ml )、 MgCl2 (10 mM )、肝素(50 pg/ml )、 [ 2P]-ATP (10 ) 和Tris-HCl ( 50 mM, pH6.5 )。反应在30。C持续45分钟。然后，加入煮沸 的样品緩冲剂，使所述样品经过10%SDS-PAGE处理。
ERK磷酸化的测定
血清饥饿的HUVEC用各种rPEDF变体(10 nM)处理15分钟。在刺 激之后，收集细胞，用SDS-PAGE离析蛋白质，并通过蛋白质印迹法使用 如(Aebersold, D. M.,等.Mol. Cell. Biol. 24:10,000- 10,015, 2004 )中所描 述的适当抗体检测磷酸ERK和普通ERK。
40内皮细胞增殖试验如先前所描述(Oliver, M. H.,等.，J. Cell Sci. 92: 513-518, 1989 )，通过 亚曱蓝试验确定增殖。筒而言之，HUVEC被接种在明胶涂布的24孔组织 培养皿中的2.5°/。FCS的M-199 ( 0.5 ml/孔)中(20xl03个细胞/孔)。在一 式四份(均为10 nM)接种之后立即添加各种PEDF,并将培养亚在加湿 培养箱中培养48小时。然后，细胞在4%的緩冲曱醛溶液中固定2小时， 用pH8.5的0.1 M硼酸钠緩冲液洗涤两次，并用溶解在0.1 M硼酸盐緩冲 溶液中的1%亚甲蓝染色20分钟。多余染料被洗掉，细胞结合的染料用200 pl/孔的0.1 MHC1洗脱。在Wallac 1420多标记计数器中读取595 nm处的 光密度值。在Microsoft Excel中分析数据，使用2.5%FCS介质中的细胞增 殖作为对照。突起生长(neurite outgrowth)试验如先前所描述(Bec固,S. P.,等等，J. Biol. Chem. 268: 23148-23156, 1993 )，试验人类Y-79视网膜母细胞瘤细胞(从ATCC获得)的突起生长。 lml的Y-79细胞混悬液(2.5xl()S个细胞/ml)在添加了 2 mM的L-谷氨酰 胺、抗生素和0.1% ITS的MEM中与rPEDF或者各种rPEDF变体(20 nM) 一起培养。7天之后，培养物中的细胞被转移到聚D-赖氨酸涂布的平板， 在不同时间段用光学显微镜监测它们的突起生长。体内基质M血管生成试验有或没有PEDF ( 20nM),在水上保持的基质胶(0.5毫升/鼠)与指定 浓度的bFGF混合，而且如(Passaniti, A.,等.，Lab. Invest. 67: 519-528,1992 ) 所描述，皮下注射入8个星期大的棵鼠的腹侧。在注射之后基质胶快速形 成一个塞。在第7天，宰杀小鼠，而且它们的皮肤被小心地后拉以暴露完 整的塞。塞被移出、固定(4%曱醛)、石蜡包埋并切片。切片用苏木素和 曙红(H&E)染色。通过Masson三色染色法确认浸润基质胶的内皮细胞/ 微血管。实施例1PEDF的CK2磷酸化突变体不是PKA底物已经研究CK2和PKA磷酸化之间的互相作用。作为第一个步骤，检 查每种磷酸化作用是否改变PEDF充当另一蛋白质激酶的底物的性能。为 达到这一目的，通过用带负电荷的谷氨酸残基替代，来模仿磷酸化丝氨酸 的负电荷，而丝氨酸的非磷酸化状态通过丙氨酸来模仿，它不能够充当磷 受体。因此，通过用PKA的纯催化亚基和[i^P]-ATP来培养，CK2磷酸化 变体S24、 114E (EE)经过PKA磷酸化。由于PKA磷酸化通常依赖于pH 值，在不同的pH值进行本实验。
如图1A所示，尽管rPEDF充当PKA的良好底物，但在所使用的条 件下，磷酸化变体S24、 114E并不被PKA磷酸化(图1A)。然而，用以 温和消除S24、 114E变体的天然结构的筒单热处理，恢复了其由PKA进 行的磷酸化(图1B)。这一结果表明，缺乏磷酸化是由于磷酸化CK2位点 对PKA磷酸化位点的构象依赖性掩蔽，而且这与这两个位点位于PEDF 分子的分离区域的这一事实无关。此外，在所试验的不同反应条件下，根 本不能被CK2磷酸化的变体S24、 114A (AA)被PKA轻易地磷酸化(图 1C),这表明缺乏磷酸化确实是由在Ser24和Serl14上的负电荷引起的。 与在CK2位点的负电荷对PKA磷酸化的妨碍相反，在PKA位点(Ser227 ) 的负电荷对CK2磷酸化没有显著影响。对PKA可磷酸化和不可磷酸化位 点变体(分别为S227E和S227A)来说都是这样，两者都被CK2轻易地 磷酸化(图1D)。由CK2对变性PEDF的高度磷酸化先前已被报导 (Maik-Rachline , G.,等.，同上)，并指出PEDF变性暴露了其他CK2位点。 而且，如先前所示出，由CK2对plPEDF的磷酸化显著低于rPEDF的CK2 磷酸化(图1D),这可能是由于在这些位点上的循环蛋白质预磷酸化而发 生的。因此，Ser24和Serll4的CK2磷酸化诱导PEDF的构象改变，这使 得Ser227难以进行PKA磷酸化。然而，Ser227的PKA磷酸化不影响PEDF 被CK2磷酸化的性 負g。
实施例2
PEDF三重变体的表征
本发明的发明人先前已经示出，从循环血液提纯的PEDF (plPEDF) 在其CK2位点上并且在较小的程度上也在其PKA位点上包含磷酸
42(Maik-Rachline， G.等，同上；以及上文的图l)。另外，上文结果示出， 三个PEDF位点可以同时(首先由PKA，然后由CK2 (图1))磷酸化。 考虑到这些发现，表征这些激酶对PEDF的同时磷酸化的效果变得重要了 。 因此，通过用以下Ala或Glu替代CK2和PKA磷S臾化位点Ser24 、 114和 227，构建一组三重位点变体S24E114E227E (EEE)模仿在CK2和PKA 位点上的磷酸化，S24E114E227A (EEA)模仿在CK2而非PKA位点上的 磷酸化，S24A114A227E (AAE )模仿在PKA而非CK2位点上的磷酸化， 以及S24A114A227A (AAA)模仿非CK2或PKA磷酸化PEDF (图2A )。 使用Glu突变体而非部分鳞酸化的plPEDF很重要，因为这提供了在相关 位点中具有负电荷的同质分子群，并由此使得可以准确检出磷酸化效果。 磷酸化Ser到Ala残基的突变也很重要，因为它们使得可以获得非磷酸化 分子的同质群。这不同于在S24、 114E或S24、 114A中的PKA位点上以 及在S227E和S227A变体中的CK2位点上发生的少量磷酸化
(Maik-Rachline， G.,etal.,同上)，这些磷酸化可以部分影响这些分子的性 质。通过用全长人类PEDFcDNA或变体来转染HEK293T细胞来表达这些 变体，并在N产柱上提纯。
为表征这些变体并确定它们的生物化学完整性，它们中的每一个经过 由CK2或PKA进行的体外磷酸化。AAE和AAA变体几乎完全消除了 CK2 磷酸化(图2B )。另 一方面，三重变体EEE和EEA轻易地被CK2磷酸化， 表明这些变体表现出与先前所描述的S24、 114E (EE)突变体的高度磷酸 化(Maik-Rachline, G.,等，同上) 一致的附加磷酸化位点。因此，与单独 的S24、 114E磷酸化相比较，S227A或S227E突变附加到CK2突变位点， 并不显著影响其CK2的磷酸化水平(图2B)。另外，三重突变体没有被 PKA磷酸化(图2C)，这表明三重突变体内CK2位点突变成Glu或Ala， 并不影响PKA位点的构象结构。
实施例3
PEDF变体对ERK活化的影响
尽管PEDF的受体还没有被鉴定，但已表明这一因子能刺激各种细胞 内信号传导过程，包括细胞外信号调控的激酶(extracellular signal-regulatedkinase , ERK) /促细胞分裂剂激活的蛋白质激酶(mitogen-activated protein kinase ， MAPK)级联。为进一步表征PEDF的各种三重变体，检验了它 们对HUVEC中ERK活化的影响。因此，各种变体被添加到血清饥饿的 HUVEC ，并使用抗磷酸化ERK和抗普通ERK抗体来测定ERK的活性。
在本发明人前面的研究中，他们示出CK2对PEDF的磷酸化显著提高 了 rPEDF对ERK活化的影响，而单独的PKA磷酸化实质上没有影响 (Maik-Rachline, G.,等.，同上)。这些发现表明S24、 114E诱导显著的ERK 磷酸化(图3A和3B),这高于由rPEDF诱导的磷酸化。然而，由三重磷 酸化变体EEE诱导的ERK磷酸化导致更强的磷酸化，是S24、 114E的磷 酸化的约1.5倍(图3A-B )。 EEA和AAE变体诱导ERK磷酸化到稍微高 于S24、 114E变体的水平，而AAA变体显著降低了 PEDF活化ERK的性 能。这些结果表明，PKA或CK2对PEDF的磷酸化对PEDF诱导的ERK 级联活化来说是必要的，并且这些激酶的三个位点的累积磷酸化显著提高 了这一诱导。
实施例4
PEDF变体对细胞增殖的影响
PEDF先前被示出为抑制子宫内膜癌细胞的细胞增殖，并诱导内皮细 胞的凋亡。这一实验的目的是确定PEDF及其磷酸化变体对HUVEC增殖 的影响。为达到这一目的，在24孔组织培养m中接种HUVEC，在用有或 没有各种PEDF的添加了 2.5%FCS的培养基中保持48小时，然后通过亚 甲蓝试验分析增殖速度(Oliver, M.H.,等.J. Cell Sci. 92:513-518, 1989 )。 在这些条件下，rPEDF把HUVEC增殖抑制在适当的范围内(22%,图3C )， 而从血浆提纯的PEDF (plPEDF )的抑制影响更为显著(33% )。当用S24、 114E处理细胞时，观察到对HUVEC增殖的抑制作用，变体非常类似于 plPEDF的抑制作用，这再次表明循环血浆中的PEDF主要是在其CK2位 点上被磷酸化的(见上文)。有趣的是，当用EEE变体处理细胞时，抑制 作用的水平显著提高(57%)，然而用EEA变体处理的细胞表现非常类似 于用S24、 114E处理的细胞(分别为27%和33%抑制作用)。另一方面， PKA磷酸化变体S227E和AAE对HUVEC增殖几乎没有影响。另外，用
44非磷酸化变体S24、 114A和S227A处理的细胞表现出与用rPEDF处理的 细胞相似的增殖水平，然而AAA突变体对HUVEC增殖只有小的影响。 因此，这些结果表示HUVEC增殖的抑制作用依赖于PEDF的磷酸化状态。 尤其是，细胞增殖被在其CK2位点上磷酸化的PEDF抑制，而且这一抑制 作用在把PKA位点中的一个负电荷附加到CK2位点的负电荷之后显著增 加。
实施例5
三重突变对PEDF诱导的神经营养活性的影响
发明人先前示出，CK2磷酸化显著减少了 PEDF的神经营养效果，而 PEDF的PKA磷酸化对PEDF的神经营养效果则没有或有非常小的影响 (Maik-Rachline,G.,等.，同上)。本研究目的是，检查同时发生的到PEDF 的PKA和CK2位点的磷酸结合是否调节PEDF变体诱导培养物中人类视 网膜母细胞瘤Y-79细胞分化的性能。令人惊讶的是，用EEE变体处理的 细胞(图4)呈现了突起生长并形成了聚合体，而EEA变体诱导小冠状结 构的形成，这些冠状结构非常紧密，没有任何幼芽以与用S24、 114E变体 处理的细胞类似的方式从这些细胞伸出。用PKA磷酸化位点变体处理Y-79 细胞:S227E和AAE，得到不同的细胞表型，其中尽管清楚地观察到它们 的过程，但菌落更小。这些发现表明，尽管CK2磷酸化显著减少了 PEDF 神经营养效果，除了 CK2的磷酸化之外对PKA位点的磷酸附加，保持了 PEDF的神经营养活性。尽管仅在其PKA位点被磷酸化的PEDF的影响最 小，这仍然发生了。
实施例6
三重氨基酸置换对体内PEDF诱导的抗血管生成活性的影响
为了进一步探究CK2和PKA磷酸化两者对PEDF功能的影响，使用 基质胶塞试验，确定三重变体对PEDF的抗血管生成活性的影响。
用已检验因子补充的液体基质胶被皮下注射到CD-I棵鼠中。基质胶 聚合形成一个塞，该塞在一个星期之后^皮移出，并通过组织学染色法分析 血管的生长和浸润。结合bFGF (300 ng/ml),用rPEDF、 plPEDF或各种
45变体处理基质胶塞。正如所期望的那样，用PBS处理的对照塞显示了非常
微小的血管生成响应，bFGF处理的塞显示了强的血管生成活性，rPEDF、 plPEDF以及S24、 114E和S24、 114A突变体呈现系统中先前描述的抗血 管生成活性(图5,也见Maik-Rachline, G.,等.，同上)。三重变体EEE 或EEA把bFGF诱导的血管生成减少到大致类似于S24、 114E的影响，而 AAA和AAE变体只有比大致类似于S24、 114A的影响更小的影响。有趣 的是，EEE变体的抗血管生成影响稍微高于其他变体，但是在当前实验中 所使用的情况下，这并非是统计学上显著的。值得注意，在所有结核的周 边观察到一些没有形成血管的增殖细胞，与PEDF变体的类型无关，这表 明抗血管生成活性部分地由不包括增殖抑制的机理介导。
考虑到EEE变体对血管抽芽的抑制稍微好些，于是考察了这一变体相 比其他磷酸化变体确实是更好的抗血管生成因子的可能性。为达到这一目 的，确定这些变体对用更高水平bFGF (500 ng/ml)处理的基质胶塞的抑 制作用。总的来说，用500 ng/ml bFGF处理的塞比用300 ng/ml处理的塞 呈现更高的血管生成响应(图6)。这由浸润塞的细胞数量的显著上升(图 6)以及这些塞中实际血管的清晰染色所证明，而这在用较低浓度bFGF处 理的塞中并不明显。在这些较高的bFGF水平下，EEE变体显著增加了 PEDF抗血管生成活性，这是因为在塞中没有观察到血管(图6)。与由S24、 114E或EEA突变体(分别为p=0.04和p=0.01)观察到的抗血管生成活性 相比较，这一抑制活性显然更为显著。因此，这些结果表明，当和CK2 磷酸化结合时，PEDF的PKA磷酸化是强抗血管生成活性所必要的，但在 由其本身给出时并非如此。这些结果进一步指出，CK2和PKA对PEDF 的同时磷酸化得到具有最高水平抗血管生成活性的PEDF变体，超过单独 由CK2进行磷酸化的PEDF变体所呈现的抗血管生成活性。
因此，PEDF的磷酸化在其生理学活性测定中扮演重要角色。在发明 人(Maik-Rachline, G.,等.，同上)的以上研究中，示出CK2对PEDF的 细胞外磷酸化消除了 PEDF神经营养活性，但增强了其抗血管生成活性， PKA磷酸化减少PEDF抗血管生成活性而不影响其神经营养活性。在本发 明中，在PKA和CK2磷酸化位点的丝氨酸对Glu的组合替换把PEDF转变成其最有效的抗血管生成形式，而仍保持其神经营养活性。考虑所有这
些发现，可以得出结论PKA、 CK2或这两种激酶一起对PEDF的细胞外 磷酸化，可以调节PEDF活性。因此，非磷S吏化的蛋白质具有弱的抗血管 生成和神经营养活性；PKA磷酸化的蛋白质呈现强的神经营养活性但不呈 现抗血管生成活性；在这两个CK2位点上^皮磷酸化的PEDF呈现抗血管生 成活性而不具有任何神经营养效果；最后，三重磷酸化的蛋白质恢复这两 种活性。此外，三重磷酸化的蛋白质的抗血管生成活性要比非磷酸化或单 一 PKA磷酸化PEDF的抗血管生成活性高很多，而且也高于双重CK2磷 酸化的蛋白质的抗血管生成活性(图7)。
实施例7
EEE三重变体抑制DU145移植瘤的生长
由于EEE变体在基质胶塞试验中呈现最高水平的抗血管生成活性，接 下来检验其对活体内移植瘤模型的效果。为达到这一目的，DU145人类前 列腺癌细胞混悬液(100 pl盐水中的5xl()S个细胞)被皮下注射到5星期 大的雌性无胸腺棵鼠的腹侧(CD-1)。肿瘤被允许生长大约1星期，之后 根据肿瘤体积把小鼠随机分成2组。其中一组用EEE变体静脉注射，每次 注射8昭(n=3 )。另 一组被用作对照组，用PBS (n=2 )静脉注射。使用测 径器，通过对长x宽x深进行相乘，计算肺瘤体积。所有处理一个星期进行 3次，肿瘤体积一个星期检测两次。结果给出为每一组肿瘤体积相对于其 初始大小的倍增均值。使用学生t-检验来分析处理组和对照组之间肿瘤体 积的倍增均值的统计显著性差异(*P^).05)。如图8A-B所示，用EEE变 体处理DU145异种移植物，显著减小了肿瘤体积。
实施例8
抗CK2和抗PKA磷酸化PEDF多克隆抗体的产生
针对对应于人类PEDF的氨基酸14-29的合成16mer肽，在兔中产生 抗磷酸Ser24 ( a-pSer24; CK2位点)PEDF多克隆抗体，其中人类PEDF 的氛基酸14-29的合成16mer肽具有以下氨基酸序列:SEQ ID N0:15中所 示的LGHSSCQNPAS (磷酸)PPEEG。针对对应于人类PEDF的氨基酸的合成15mer肽，产生抗磷酸Ser227( a-pSer227; PKA位点)PEDF 多克隆抗体，其中人类PEDF的氨基酸219-233的合成15mer肽具有以下 氨基酸序列:SEQ ID NO: 16中所示的TKFDSRKTS (磷酸)LEDFYL。此 外，针对对应于人类PEDF的氨基酸327-343的17mer肽，产生抗PEDF
(a-PEDF )多克隆抗体，其中人类PEDF的氨基酸327-343的17mer肽具 有以下氨基酸序列在SEQIDNO:17中所示的KSLQEMKLQSLFDSPDF。 用于制备多克隆抗体的方法正如本领域中所公知的那样(见Harlow和Lane
(1988)抗体:实验室手册，CSH出版社，其内容通过引用结合，如同完整 描述于此)。
为确定多克隆抗体识别PEDF，用各种抗磷酸PEDF抗体对rPEDF和 plPEDF进行免疫印迹。如图9A所示，两种蛋白质都被叩Ser24和叩Ser227 识别，然而与rPEDF相比较，两种抗体都把plPEDF识别到更高的程度， 且用叩Ser24对plPEDF的识别更显著。这些结果证实本文以上所揭示的 发现，即人类血浆中的PEDF在循环中作为磷酸化蛋白质存在，它主要在 其CK2位点上被磷酸化。
为进一步验证抗体确实是磷酸化PEDF抗体，rPEDF和plPEDF用马 铃薯酸性磷酸酶如下处理rPEDF (1吗)或plPEDF (1吗)用马铃薯酸 性磷酸酶(PAP， 0.5U)在37。C培养30分钟。此后，试样用各种抗磷酸 PEDF抗体进4亍免疫印迹。rPEDF的;奔酸酶处理完全消除了叩Ser24和 叩Ser227对其的识别，而plPEDF的相同处理显著減少磷酸化抗体对其的 识别(图9B)。最后，各种PEDF变体(EEA、 AAE、 EEE和AAA)用抗 磷酸PEDF抗体进行免疫印迹。如图9C所示，有趣的是，叩Ser24抗体高 度识别了 CK2磷酸化突变体(EEA和EEE),而叩Ser227抗体高度识别 了 PKA磷酸化突变体(AAE和EEE )。
本领域内的技术人员应该明白，本发明不受上文具体示出并描述的内 容的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定。
权利要求
1. 一种抗血管生成色素上皮衍生因子(PEDF)变体或其类似物或融合蛋白，其包括具有多个被改变的磷酸化位点的人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO1的变体或其片段，条件是所述变体不同于仅由两个在丝氨酸24和丝氨酸114处被改变的磷酸化位点组成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白。
2. 如权利要求2所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白 或片段，其包括选自丝氨酸24和丝氨酸227、丝氨酸114和丝氨酸227的 两个被改变的磷酸化位点。
3. 如权利要求1所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白 或片段，其包括在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变的 磷酸化位点。
4. 如权利要求3所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白 或片段，其具有神经营养活性。
5. 如权利要求4所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白 或片段，其中所述三个被改变的磷酸化位点被带负电荷的氨基酸残基置 换。
6. 如权利要求5所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物或融合蛋白， 其包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其片段。
7. 如权利要求4所述的抗血管生成PEDF变体、类似物、融合蛋白或 其片段，其中丝氨酸24和丝氨酸114被非极性的氨基酸残基置换，并且其 中丝氨酸227被选自由带负电荷的氨基酸残基和非极性的氨基酸残基所组 成的组的氨基酸残基置换。
8. 如权利要求7所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物或融合蛋白， 其包括选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4或其片段所组成的组的氨基酸 序列。
9. 如权利要求3所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白 或片段，其基本上缺乏神经营养活性。
10. 如权利要求9所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋 白或片段，其中丝氨酸24和丝氨酸114被带负电荷的氨基酸残基置换，并 且其中丝氨酸227被非极性氨基酸残基置换。
11. 如权利要求10所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物或融合蛋 白，其包括SEQ ID NO:5所示的tt酸序列或其片段。
12. 如权利要求1所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋 白或片段，其中磷酸化位点的改变通过化学改性来进行。
13. 如权利要求12所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋 白或片段，其中所述化学改性选自糖基化、氧化、永久磷酸化、还原、 十四烷基化、石克酸化、酰化、乙酰化、腺苷二磷酸核糖基化、酰胺化、羟 基化、碘化、曱基化以及封闭基团衍生化。
14. 一种离析多核苦酸序列，其编码抗血管生成的色素上皮衍生因子 (PEDF)变体或其类似物或融合蛋白，所述多核苷酸序列包括人类PEDF核苷酸序列SEQIDNO:6的变体或其片段，该变体或其片段编码包括多个 被改变的磷酸化位点的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白，条件是 所述PEDF变体不同于仅由在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷 酸化位点所组成的变体。
15. 如权利要求14所述的离析多核苷酸序列，其中所述PEDF变体、 其类似物、片段或融合蛋白包括选自下述组的两个磷酸化位点丝氨酸24 和丝氨酸227;以及丝氨酸114和丝氨酸227。
16. 如权利要求14所迷的离析多核香酸序列，其中所述PEDF变体、 其类似物、片段或融合蛋白包括在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227处 的三个被改变的磷酸化位点。
17. 如权利要求16所述的离析多核苷酸序列，其中所述抗血管生成 PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白具有神经营养活性。
18. 如权利要求17所述的离析多核香酸序列，其中所述三个被改变的磷酸化位点被带负电荷的氨基酸残基置换。
19. 如权利要求18所述的离析多核苷酸序列，其包括SEQIDNO:7或其片段。
20. 如权利要求17所述的离析多核苷酸序列，其中丝氨酸24和丝氨 酸114被非极性的氨基酸残基置换，并且丝氨酸227被选自由带负电荷的 氨基酸残基和非极性的氨基酸残基组成的组的氨基酸残基置换。
21. 如权利要求20所述的离析多核苷酸序列，所述离析多核苷酸序 列选自由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9或其片段所组成的组。
22. 如权利要求16所述的离析多核苷酸序列，其中所述抗血管生成 PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白基本上缺乏神经营养活性。
23. 如权利要求22所述的离析多核苷酸序列，其中丝氨酸24和丝氨 酸114被带负电荷的氨基酸残基置换，且丝氨酸227被非极性氨基酸残基 置换。
24. 如权利要求23所述的离析多核苷酸序列，其包括SEQIDNO:IO或其片段。
25. —种表达载体，其包括如权利要求14至24任一项所述的编码抗 血管生成PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白的离析多核苷酸序列。
26. —种宿主细胞，其包括如权利要求25所述的包括编码抗血管生 成PEDF变体或其类似物、片段或融合蛋白的离析多核苷酸序列的表达载 体。
27. —种药物组合物，其包含作为活性成分的、如权利要求1至13 任一项所述的抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段；以及 药学上可接受的载体。
28. —种药物组合物，其包含作为活性成分的、如权利要求14至 24任一项所述的编码抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段 的离析多核苷酸序列；以及药学上可接受的载体。
29. —种药物组合物，其包含作为活性成分的、如权利要求25所述的表达载体以及药物上可接受的载体，所述表达载体包括编码抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段的离析多核苷酸序列。
30. —种药物组合物，其包含作为活性成分的、如权利要求26所述 的包括表达载体的宿主细胞以及药学上可接受的载体，所述表达载体包括 编码抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段的离析多核苷酸 序列。
31. —种用于治疗患者中与新血管形成关联的疾病或病症的方法，其 包括为有相应需要的患者施用治疗有效量的如权利要求27至30任一项所 述的药物组合物。
32. 如权利要求31所述的方法，其中所述与新血管形成关联的疾病 或病症选自癌症、眼疾以及用抗血管生成因子治疗的病症。
33. 如权利要求32所述的方法，其中所述疾病或病症是选自下述组 的癌症肉瘤、癌瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原 性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、 滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤平滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳 腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌汗腺癌、皮脂 腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、嚢腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、 肝细胞瘤导管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、维尔姆斯氏瘤子 宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星 形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、 成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤和神经母 细月包瘤。
34. 如权利要求32所述的方法，其中所述眼疾选自新生血管性青 光眼、糖尿病性视网膜病变、视网膜母细胞瘤、晶体后纤维组织增生、葡 萄膜炎、早熟性视网膜病、黄斑变性、角膜移植片新血管形成、视网膜肿 瘤和乐K络膜肿瘤。
35. 如权利要求32所述的方法，其中所述用抗血管生成因子治疗的 病症选自血管瘤、关节炎、牛皮癣、血管纤维瘤、动脉粥样硬化斑、血友病性关节病和肥厚性瘢痕。
36. —种用于治疗患者神经变性病状的方法，其包括为有相应需要的患者施用治疗有效量的如权利要求27至30任一项所述的药物组合物。
37. 如权利要求36所述的方法，其中所述神经变性病状选自多发 性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病、重症肌无力、运动原神经病、格-巴二氏综合症、自身免疫神经病、Lambert-Eaton类重症肌无力综合征、肾 上腺炎神经疾病、肾上腺炎小脑萎缩、非肾上腺炎僵人综合症、渐进性小 脑萎缩、Rasmussen氏脑炎、肌萎缩侧索硬化、Sydeham舞蹈病、Tourette 综合症、自身免疫多内分泌腺病、异常免疫神经病、获得性神经性肌强直、 多关节弯曲、视神经炎和全身肌强直综合症。
38. —种离析抗体或其片段，其特异性结合选自下述组的多肽(a) 人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO:l的变体，其包括至少一个带负电荷的 被改变的磷酸化位点；(b ) ( a)的PEDF变体的类似物；(c)(a)的PEDF变体或(b)的类似物的片段，其中所述离析抗体不结合相应的具有非磷酸化丝氨酸或不带负电荷 的被改变的磷酸化位点的人类PEDF序列SEQ ID NO: 1 。
39. 如权利要求38所述的离析抗体或片段，其中所述至少一个被改 变的磷酸化位点位于丝氨酸24,并且其中所述PEDF变体包括选自SEQ ID NO:2 、 SEQ ID NO:5 、 SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
40. 如权利要求38所述的离析抗体或片段，其中所述至少一个被改 变的磷酸化位点位于丝氨酸227,并且其中所述PEDF变体包括选自SEQ ID NO:2 、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO: 13的^J^酸序列。
41. 如权利要求38所述的离析抗体或片段，其中所述PEDF变体包括 在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点，并且所述PEDF 变体包括选自SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:5和SEQ ID NO: 12的氨基酸序 列。
42. 如权利要求38所述的离析抗体或片段，其中所述PEDF变体包括 在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变的磷酸化位点，并 且所述PEDF变体包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
43. 如权利要求38至42任一项所述的离析抗体或其片段，其是多克 隆抗体。
44. 如权利要求38至42任一项所述的离析抗体或其片段，其是单克 隆抗体。
45. 如权利要求38至42任一项所述的离析抗体或其片段，其选自(a) Fab;(b) F(ab)2;(c) 嵌合抗体；以及(d) 单链抗体。
46. —种用于产生抗血管生成PEDF变体的方法，其包括在j足进如 权利要求1至13任一项所述的抗血管生成PEDF变体或其片段或类似物的 表达的条件下，培养包括编码所述变体、片段或类似物的离析多核苷酸的 宿主细胞，以及回收所述变体、片段或类似物。
47. 如权利要求46所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。
全文摘要
本发明涉及色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)的抗血管生成变体及其用途，其中所述变体包含多个被改变的磷酸化位点、编码所述位点的多核苷酸。尤其，本发明的PEDF变体提供优良的抗血管生成活性和高神经营养活性，可用于治疗与新血管形成和神经变性病状关联的疾病。
文档编号C07K14/00GK101506226SQ200680042260
公开日2009年8月12日 申请日期2006年11月14日 优先权日2005年11月14日
发明者加利亚·麦克-瑞茨琳尼, 罗尼·塞格 申请人:维兹曼科学研究所耶达研究与发展有限公司